우리는 친절 바사 및 트래픽 잼 항체를 공급 루스 리먼과 Dorthea Godt에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 NICHD의 후원하에 개발하고 아이오와의 대학에 의해 관리 제공된 주식과 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 유지하기위한 인디애나 대학 블루밍턴 주식 센터에 감사드립니다. 우리는 그들의 조언과 지원을 Wawersik 실험실의 모든 구성원 감사합니다. 이 작품은 먼로 학자 프로그램 그랜트와 NSF (AF 및 LB에) (MW로) IOS0823151을 부여에 의해 투자되었다.

컬렉션 케이지의 1 준비 <ol><li> CO 2 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합. </li><li> 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉. </li><li> 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다. 참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 시간) 파리 25 ° C에서 36 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ° C에서 12 시간 동안 알을 낳기 위해 수 있습니다. </li><li> 기간이 완료되면 파리 마취없이 떨어져 사과 주스 한천 플레이트에서 드롭 있도록 테이블에 새장을 누릅니다. 신속 효모 페이스트의 방울을 함유 한 신선한 플레이트로 사용을 대체. 테이프와 파라 필름으로 신선한 판을 고정베이스로 사과 주스 한천 플레이트와 케이지를 저장합니다. </li><li> 조심스럽게 금속 주걱 사용 된 플레이트에서 효모 강하를 제거합니다. 실험적으로 필요한 경우 장소 사용되는 사과 주스 접시에 뚜껑 나이에 배아를 마련 할 수 있습니다. 참고 : 샘플을 노화 동안 판은 25 ° C에서 저장 될 수있다 높은 온도가 experimenta가 아니라면에서야이 필요합니다. 상기 기술 한 바와 같다 수집을위한 배아를 나이하는 방법의 예 (단계 1.3 참고 사항을 참조하십시오). 노화를 샘플링하기 전에 효모 페이스트의 제거는 효모에 크롤 링 아래 한천을 깨는에서 유충을 방지하기 위해 수행된다. 나머지 사과 주스 한천과 효모 붙여 넣기 잔류 애벌레 성장을위한 영양분을 제공합니다. 효모 페이스트에 직접 배치 배아 효모 페이스트 제거를 통해 손실되는 반면,이 손실은 염색 효율을 줄일 수있는 샘플 효모 및 한천 잔류하는 것이 바람직하다. 하나는 효모 페이스트를 제거하지 않도록 선택한 경우, 효모는 페인트 브러시와 혼합, 인산염 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx)와 액화 한 후 이전에 고정에 셀 스트레이너를 사용하여 샘​​플에서 제거 할 수 있습니다. </li></ol> 2 고정 <ol><li> 사과 주스 한천 플레이트에 배치 배아가 원하는 시점에 세되면, 조심스럽게 일에서 샘플을 제거 인산 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx) 용액에 적신 작은 붓을 사용하여전자 판. 참고 : 이전 애벌레 이동하고 뚜껑의 안쪽에 크롤링 할 수 있습니다. 이 샘플은 페인트 브러시와 제거에 의해 유사하게 수집 할 수있다. </li><li> 셀 스트레이너의 내부를 향하는 능선에 대한 샘플을 함유 한 페인트 브러시를 닦아주십시오. 그런 다음, 스트레이너의 벽과 PBTx 솔루션을 포함하는 물총 병 붓을 씻어. PBTx 솔루션을 캡처 여과기 아래에 배양 접시 덮개를 놓습니다. </li><li> 모든 샘플은 여과기로 전송 된 후, 메쉬 오프 샘플 인상 여과기로 충분히 PBTx을 붓는다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다. </li><li> 단계를 반복 2.3 세 번 효모를 제거하고 샘플과 함께 전송 된 수 있습니다 폐기물을 비행. </li><li> 메쉬를 유충을 제기하기에 충분한 50 % 표백제 여과기에 (의 NaOCl) / 물 (DDH 2 O) 용액을 붓는다. 유충은 5 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음, 스트레이너를 들어 올려 t을 부어그는 액체 폐기물 용기에서 배양 접시의 내용을 표시합니다. 참고 : - 융모막 막을 제거하기 위해 22 시간 표백제는 0 세 배아 샘플이 필요합니다. 이전 샘플 표백제 애플리케이션은 생략 할 수 있지만, 그것의 포함은 유해하지 않다. 누락이 필요한 경우, PBTx이 단계에서 표백제를 대체. 희석 표백제 용액 준비 24 시간 이내에 사용하시기 바랍니다. </li><li> 메시 오프 샘플을 높이기 위해 스트레이너에 충분한 PBTx을 부어 PBTx와 여과기에 샘플을 씻으십시오. 샘플 3 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다. </li><li> 반복 단계 2.6 다섯 번. </li><li> 셀 스트레이너 건조의 바닥 DAB 후 붓을 사용 PEMS 용액 1.75 ㎖에 함유하는 섬광 바이알로 샘플을 전송. </li><li> 환기 흄 후드에서 작업, 37 %의 포름 알데히드 250 μL와 섬광 유리 병에 시약 등급 헵탄의 8 ML을 추가합니다. <br/&gt; 참고 : 포름 알데히드 및​​ 헵탄이 위험합니다. 3.3 - 안전을 위해 통풍이 잘되는 흄 후드 작동 및 단계 2.9에 적합한 장갑을 착용하는 것을 계속한다. </li><li> 유리 병은 200 rpm으로 20 분 동안 비슷한 적당한 속도로 흔들 수 있습니다. </li><li> 이전의 성상을 제거하지 않고 섬광 유리 병에 메탄올 10 mL를 넣고 유리 병은 1 분 동안 500 rpm으로 흔들어 할 수 있습니다. 참고 : 메탄올은 위험합니다. 환기 흄 후드에서 작업하고 적절한 장갑을 착용 계속합니다. </li><li> 후드에서 액체 폐기물 용기 위에 셀 스트레이너에 내용을 부어 바로 통에서 유리 병을 제거하고. 바이알에 여분의 메탄올을 첨가하고 모든 샘플이 제거되었는지 확인하기 위해 필요한 셀 스트레이너를 통해 실행. 참고 : 셀 스트레이너 천천히 방전 될 수 있습니다. 이를 해결하기 위해,보다 빠르게 여과기를 통해 용액을 그리기 위해 셀 스트레이너의 바닥 실험실 조직을 터치. 메탄올, 포름 알데히드, 헵탄이 있어야한다제도적 지침에 따라 적절한 폐기 될 때까지 적절한 폐기 용기에 보관. </li><li> 실험실 조직을 사용하여 셀 스트레이너의 마른 바닥, 메탄올 0.5 ㎖에 들어있는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스트레이너에서 캡처 샘플을 전송하기 위해 붓을 사용합니다. 참고 : 여러 섬광 유리 병을 사용하는 경우 단계를 완료 2.12 한 번에 2.13 한 병 셀 스트레이너에 건조에서 샘플을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 샘플이 microcentrifuge 관에 추가되면, 피펫과 메탄올을 제거합니다. 확인 샘플 튜브의 바닥에 침전되었다. </li><li> 튜브의 메탄올 0.5 ㎖에 첨가하여 microcentrifuge 관에 샘플을 헹군다. 다음 정착 피펫 메탄올을 제거하는 샘플 기다립니다. </li><li> 단계를 반복하여 15 세 번. </li><li> 에서 관에 메탄올 0.5 ML을 추가 한 다음 저장 -20 나중에 사용하기 위해 C 냉동고 °. </li></ol> 3 재수 및 면역 염색을위한 시료의 준비 <ol><li> 튜브 샘플을 떠나, 피펫 microcentrifuge 관에서 메탄올을 제거합니다. 적절한 폐기 때까지 적절한 폐기 용기에 보관 메탄올 폐기물. , 초음파 처리 효율을 향상시키기 위해 시료의 더 이상 3mm가 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 바닥에 침전 없음 사용 참고. 과잉 시료 위 재수 화 공정을 시작하기 전에 피펫 분리 튜브로 이송 될 수있다. 깨끗한 면도날과 피펫 팁을 절삭하는 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 3 분 동안 튜브와 바위에 50 % 메탄올 / 인산 버퍼 트윈 (PBTw) 솔루션의 1.0 ML을 추가합니다. </li><li> 적절한 폐기물 용기에 메탄올 용액을 제거하고 두 번 PBTw의 1.0 μl를 씻어. 각 린스 후, 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 소 혈청 알부민 / 인산염 완충 트윈 (BBTw)의 1.0 ML을 추가 바이알과 바위에 섞는다. 로커에 3 분 후, SAMP를 허용르 정착과 피펫 BBTw를 제거합니다. </li><li> 단계를 반복 마지막 세척 후 샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTw을 제거 돌보는 3.4 두 번. </li><li> 튜브에 BBTw의 0.5 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다. </li></ol> 샘플의 4 초음파 처리 <ol><li> 10 % 최대 진폭에 초음파기를 2 초 일정 초음파의 실행 시간을 지정합니다. 참고 :이 설정은 재료 및 장비 표에 표시된 초음파기에 고유 한 다른 sonicators에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. </li><li> 이전 시료의 초음파로, 프로브를 청소하는 탈 이온수 및 실행 초음파기 가득 50 ML 원뿔 튜브에 프로브 팁을 배치하여 초음파기 프로브를 청소합니다. 실행 한 후 실험실 조직과 드라이 초음파기 프로브. </li><li> 이 시료 위에 약 3-4mm 배치되도록 샘플을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 프로브를 담그고 초음파 처리를 시작한다. </li><li> m을 제거icrocentrifuge 튜브 초음파로부터 열을 소산 샘플 microcentrifuge 관의 하단에 정착 할 수 있도록 적어도 30 초 동안 얼음에 배치하고. </li><li> 반복 4.3 및 처리되는 샘플의 연령에 따라 필요에 따라 4.4 단계를 반복합니다. 참고 : 최적의 초음파 샘플 볼륨의 경우, 초음파를 필요로하지 않는 미만 17 시간 배아, 그러나 그 시간 17 사이의 24 (/ 17 단계 초기 L1)이이 sonications이 필요합니다. 애벌레 사이 24-36 (초 / 중반-L1), 36-48 (중 /-L1 후반) 48-60 (초 / 중반 L2), 60-72 (중 / 후반 L2), 72-84 ( )-L3 초, 84-96 (초 / 중반 L3), 96-108 (중 / 후반 L3) 시간이 필요 5, 9, 11, 13, 각각 15, 18, 22 sonications. 초음파 시간에 더 정교에 대한 설명을 참조하십시오. </li><li> BBTw 두 번 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다. &lt;/ 리&gt; <li> 단계를 반복 4.7 두 번. </li></ol> (5) 면역 염색 <ol><li> microcentrifuge 관에 BBTw에 희석 5 % 정상 혈청을 추가하여 샘플을 차단합니다. 1 시간 동안 락을 한 후 블록을 제거합니다. 참고 : 보조 항체가 생성되는 종에서 정상 혈청을 사용합니다. </li><li> 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 적절한 작업하는 차 항체를 희석. </li><li> 4 ° C에서 또는 (약 22 ° C 실온에서 적어도 3 시간 동안 차 항체 솔루션 O 락 샘플 / N. 주 : 항체 배양 시간 및 온도는 다를 수 있습니다. O / RT에서 N 4 ° C에서 배양 또는 3 시간은 일반적으로 충분합니다. 그러나,이 일의 잠복기는 특히 오래된 샘플 또는 낮은 친화력 차 항체를 사용하는과, 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 긴 인큐베이션은 일반적으로 4 ° C에서 수행됩니다. 이차 항체 (5.10 참조)을 사용하면 유사한 고려가 이루어져야합니다. </li><li> 샘플에 정착 할 수 있도록 허용미세 원심 분리 튜브의 바닥. 피펫 차 항체를 그립니다. 원하는 경우 재사용에 대한 항체를 저장합니다. </li><li> 두 번 BBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 반복 단계 5.6 다섯 번. </li><li> microcentrifuge 관에 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액을 첨가함으로써 차단 샘플. 1 시간 30 분 동안 흔들 후 블록을 제거합니다. 이러한 추가적인 차단 단계가 필요하지 않고, 특정 항체 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 작동하는 적절한 보조 항체를 희석. </li><li> 빛 노출로 인해 변색 줄이기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감 쌉니다. 4 ° C에서 12 시간 48 2 차 항체 용액 또는 RT (약 22 ° C에서 적어도 3 시간 동안 바위 샘플. </li><li> 샘플 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 피펫 차 항체를 그립니다. </li><li> 두 번 PBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다. </li><li> 유리 병 바위에 PBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에서 5 분 후, 샘플 정착 피펫 PBTw를 제거 할 수 있습니다. </li><li> 단계를 반복 5.13 세 번. </li><li> 옵션 : 1,000 PBTw에 : DAPI 1 희석 추가합니다. 록 샘플은 3 분 동안 알루미늄 호일에 싸서; 다음 피펫 DAPI 솔루션을 제거합니다. 샘플 피펫 PBTw를 제거하기 전에 정착 할 수 있도록 PBTw의 1.0 mL를 다섯 번 씻어. </li><li> -20 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 1,4 - 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 용액 100 ㎕ - 80를 추가합니다. 주의 : 다른 글리세롤 계 안티 - 페이드 에이전트가 대신 할 수있다. </li></ol> (6) 분석 <ol><li> DABCO / P-페닐의 10 μL - 슬라이드에 샘플을 설치하기 전에 여분의 5를 추가ylenediamine (PPD) microcentrifuge 관에 antifade 솔루션입니다. 참고 : 샘플 절개없이 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 슬라이드에 추가 샘플 볼륨을 커버 슬립의 크기에 따라 달라집니다. 슬라이드 상에 샘플을 피펫 때 피펫 팁은 시료 전단 않도록 면도날을 이용하여 차단 될 수있다. 그것은 쉬운 분석을위한 행 샘플을 정렬하는 것이 유용하다. 추가 antifade 제로 PPD의 첨가는 필요하지 않을 수 있지만, 샘플 장기 photobleaching에 저장되어있는 경우를 방지 할 수있다. </li><li> 부드럽게 샘플을 통해 유리 커버 슬립을 배치합니다. 그런 장소에 보안 커버 슬립은 매니큐어를 사용. </li><li> 보기는 형광 현미경을 이용하여 시료를 탑재. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li><li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila.">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li><li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌?...

초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) 1-3 후 배아 초파리 조직 &lt;존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 (1 차 령 (L1), 2 차 령 (L2), 및 3 차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 4 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다. 초음파는 분자간 상호 작용을 방해 음파를 이용하는 방법입니다. 이는 신경 세포 유형 6을 개발하기 위해 발현 사이 초파리 유충 표피의 무결성을 파괴하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 늦게 단계 배아 직경 8 ~ 10 년으로 50μm 작게 할 수있다 애벌레 생식선을 발현 사이하도록하고있다. 이러한 연구를 통해, 수컷 생식선 줄기 세포 (GSC) 틈새 형성 과정이 말기에있어서 한 줄기 세포 발달과 DIF 조절 초파리 배아 8-10 및 메커니즘후기 배아 생식선 및 유충의 ferentiation 9-12을 밝혀왔다. 따라서, 초음파로 인해 조직의 크기가 어려울 수 있습니다 조직 절개에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. 또한, 전체 유기체의 컨텍스트 내에서 셀을 떠나 시츄 형태로 유지 시츄 초파리 조직의 면역 염색을 가능하게한다. 여기에, 우리는 현장에서 초 / 중반 L3 조직을 통해 늦게 단계 배아의 형광 면역 염색에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 초파리 생식선 및 신경 조직의 분석은이 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 대표 결과에 나타낸다. 또한,이 면역 프로토콜은 외부 표피와 기타 다른 초파리 생물 조직뿐만 아니라 조직을 분석하도록 구성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1: Reagents and Buffers</td></tr><tr><td>Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>For 1 L in dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Triton 10%</td><td></td><td></td><td>For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Rock to mix. Store at RT.</td></tr><tr><td>PEMS</td><td></td><td></td><td>0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 mM EGTA. Store at RT.</td></tr><tr><td>Pipes</td><td></td><td></td><td>For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and autoclave. Store at RT.</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td></td><td></td><td>37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td></tr><tr><td>Heptane</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td></tr><tr><td>Phosphate buffer Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Rock to mix. Store at RT.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw)</td><td></td><td></td><td>To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 &amp;mu;m vacuum filter unit. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 &amp;mu;m syrninge filter. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>To make 100 ml: 25 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 &amp;mu;l 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution</td><td></td><td></td><td>1.765 ml NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.353 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; and NaCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; solution. Add 60 &amp;mu;l of PPD solution to 500 &amp;mu;l of DABCO. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Apple juice plates</td><td></td><td></td><td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. Add agar to ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Tegosept 10%</td><td></td><td></td><td>To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Yeast paste</td><td></td><td></td><td>~50 g dry active yeast. Gradually add ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Table 2: Staining Materials</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, stock at 5 mg/ml.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, a gift from Ruth Lehmann.</td></tr><tr><td>Mouse anti-Fasciclin III</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Mouse anti-1B1</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea pig anti-Traffic Jam</td><td></td><td></td><td>1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).</td></tr><tr><td>Mouse anti-Prospero</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Rat anti-Elav</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>mouse anti-Repo</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-guniea pig Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Goat anti-rat Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Table 3: Materials and Equipment</td></tr><tr><td>Fly Cages</td><td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td><td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td><td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td></tr><tr><td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td><td>Branson</td><td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator probe</td><td>Branson</td><td>Model #: 102C (CE)</td><td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 &amp;mu;m cellulose, acetate membrane filter</td></tr><tr><td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td><td>Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Vacuum filter unit</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 &amp;mu;m cellulose nitrate membrane filter</td></tr></tbody></table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.

마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징?...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.6K 조회수.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

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High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

연구

유전학

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

생물학

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and apoptosis, development and ageing, to neuronal synaptic plasticity and regeneration have been associated with Ryanodine receptors (RyRs). Despite the importance of calcium signaling, the exact mechanism of its function in early development is unclear. As an organism with a short gestational period, the embryos of Drosophila melanogaster are prime study subjects for investigating the distribution and localization of CICR associated proteins and their regulators during development. However, because of their lipid-rich embryos and chitin-rich chorion, their utility is limited by the difficulty of mounting embryos on glass surfaces. In this work, we introduce a practical protocol that significantly enhances the attachment of Drosophila embryo onto slides and detail methods for successful histochemistry, immunohistochemistry, and in-situ hybridization. The chrome alum gelatin slide-coating method and embryo pre-embedding method dramatically increases the yield in studying Drosophila embryo protein and RNA expression. To demonstrate this approach, we studied DmFKBP12/Calstabin, a well-known regulator of RyR during early embryonic development of Drosophila melanogaster. We identified DmFKBP12 in as early as the syncytial blastoderm stage and report the dynamic expression pattern of DmFKBP12 during development: initially as an evenly distributed protein in the syncytial blastoderm, then preliminarily localizing to the basement layer of the cortex during cellular blastoderm, before distributing in the primitive neuronal and digestion architecture during the three-gem layer phase in early gastrulation. This distribution may explain the critical role RyR plays in the vital organ systems that originate in from these layers: the suboesophageal and supraesophageal ganglion, ventral nervous system, and musculoskeletal system.

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Here, we describe a protocol for detection and localization of Drosophila embryo protein and RNA from collection to pre-embedding and embedding, immunostaining, and mRNA in situ hybridization.

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

발생학

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

의 입식 이미징 Drosophila 태아

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of embryogenesis, these organelles undergo dramatic movements powered by actin-based cytoplasmic streaming and motor-driven trafficking along microtubules. The development of a multitude of small, organelle-specific fluorescent probes (FPs) makes it possible to visualize a wide range of different lipid-containing structures in any genotype, allowing live imaging without requiring a genetically encoded fluorophore. This protocol shows how to inject vital dyes and molecular probes into Drosophila embryos to monitor the trafficking of specific organelles by live imaging. This approach is demonstrated by labeling lipid droplets (LDs) and following their bulk movement by particle image velocimetry (PIV). This protocol provides a strategy amenable to the study of other organelles, including lysosomes, mitochondria, yolk vesicles, and the ER, and for tracking the motion of individual LDs along microtubules. Using commercially available dyes brings the benefits of separation into the violet/blue and far-red regions of the spectrum. By multiplex co-labeling of organelles and/or cytoskeletal elements via microinjection, all the genetic resources in Drosophila are available for trafficking studies without the need to introduce fluorescently tagged proteins. Unlike genetically encoded fluorophores, which have low quantum yields and bleach easily, many of the available dyes allow for rapid and simultaneous capture of several channels with high photon yields.

Visualizing Cytoskeleton-Dependent Trafficking of Lipid-Containing Organelles in Drosophila Embryos

In the early Drosophila embryo, many organelles are motile. In principle, they can be imaged live via specific fluorescent probes, but the eggshell prevents direct application to the embryo. This protocol describes how to introduce such probes via microinjection, and then analyze bulk organelle motion via particle image velocimetry.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

Early Drosophila embryos are large cells containing a vast array of conventional and embryo-specific organelles. During the first three hours of ...

Antibody-Mediated Live Imaging을 통한 단백질 시각화 향상

Visualizing Low-Abundance Proteins and Post-Translational Modifications in Living Drosophila Embryos via Fluorescent Antibody Injection

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein localization, dynamics, and function. Compared to immunofluorescence, live imaging more accurately reflects protein localization without potential artifacts arising from tissue fixation. Importantly, live imaging enables quantitative and temporal characterization of protein levels and localization, crucial for understanding dynamic biological processes such as cell movement or division. However, a major limitation of fluorescent tagging approaches is the need for sufficiently high protein expression levels to achieve successful visualization. Consequently, many endogenously tagged fluorescent proteins with relatively low expression levels cannot be detected. On the other hand, ectopic expression using viral promoters can sometimes lead to protein mislocalization or functional alterations in physiological contexts. To address these limitations, an approach is presented that utilizes highly sensitive antibody-mediated protein detection in living embryos, essentially performing immunofluorescence without the need for tissue fixation. As proof of principle, endogenously GFP-tagged Notch receptor that is barely detectable&#160;in living embryos can be successfully visualized after antibody injection. Furthermore, this approach was adapted to visualize post-translational modifications (PTMs) in living embryos, allowing the detection of temporal changes in tyrosine phosphorylation patterns during early embryogenesis and revealing a novel subpopulation of phosphotyrosine (p-Tyr) underneath apical membranes. This approach can be modified to accommodate other protein-specific, tag-specific, or PTM-specific antibodies and should be compatible with other injection-amenable model organisms or cell lines. This protocol opens new possibilities for live imaging of low-abundance proteins or PTMs that were previously challenging to detect using traditional fluorescent tagging methods.

저자 스포트라이트: Unveiling the Dynamics of Mechanical and Biochemical Signals in Animal Morphogenesis Research (동물 형태 형성 연구에서 기계적 및 생화학적 신호의 역학 공개) 

This protocol describes the customized antibody-based fluorescence labeling and injection into early Drosophila embryos to enable live imaging of low-abundance proteins or post-translational modifications that are challenging to detect using traditional GFP/mCherry-tag approaches.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

Visualization of proteins in living cells using GFP (Green Fluorescent Protein) and other fluorescent tags has greatly improved understanding of protein ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색

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높은 해상도 교 잡 형광 제자리에 초파리 태아와 Tyramide 신호 증폭을 사용 하 여 조직에서

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

초기 초파리 배아 내의 면역조직화학 및 RNA 계내 분포를 위한 프로토콜

후기 배아 초파리 고나드의 해부와 라이브 이미징

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형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

전체 마운트 RNA 형광