Estamos muy agradecidos a Ruth Lehman y Dorthea Godt que suministró amablemente anticuerpos Vasa y Tráfico Jam. Nos gustaría reconocer el Stock Center de la Universidad Bloomington de Indiana para el mantenimiento de las reservas previstas y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco elaboradas bajo los auspicios de la NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa. Damos las gracias a todos los miembros del laboratorio Wawersik por sus consejos y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Programa de Becarios Monroe Grant (a AF y LB) y NSF conceder IOS0823151 (a MW).

1 Preparación de una jaula de Colección <ol><li> Anestesiar jóvenes, moscas fértiles con CO 2. Transferencia moscas anestesiados a una jaula. Para obtener un rendimiento óptimo, utilice 100-120 moscas adultas que van de 2-7 días de edad en una proporción de 4: 1 de mujeres a hombres. Permitir moscas un período de aclimatación apropiada, ~ 24 horas antes de la obtención de la muestra para la fijación. Si la jaula se creó con hembras vírgenes se aparearon con machos, un uso un 36 - periodo de aclimatación de 48 horas. </li><li> En el extremo libre de la jaula, coloque una placa de agar de zumo de manzana preparado previamente con una gota tamaño de una moneda de la pasta de levadura en el centro sobre la abertura de la jaula. A continuación, fije con cinta adhesiva. Sellar la unión entre la placa de agar de zumo de manzana y la jaula con Parafilm. </li><li> Coloque la jaula en un recipiente secundario con placa de agar jugo de manzana como la base y permitir que las moscas para reproducir a una temperatura definida durante un período adecuado de tiempo determinado por el experimento. Nota: Los tiempos de recogida de muestras will variar. Por ejemplo, en la recogida de embriones en fase tardía / larvas L1 precoz (17 - 24 horas), permitirá a las moscas ponen sus huevos en placas de agar de jugo de manzana durante 7 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 17 horas a 25 ° C. Del mismo modo, para una colección de larvas de primer instar a mediados-finales (36 - 48 hr) permiten a las moscas ponen huevos durante 12 horas a 25 ° C antes del envejecimiento de la muestra durante 36 horas a 25 ° C. </li><li> Una vez que el período de tiempo es completa, puntee en la jaula en una mesa para que las moscas caen fuera de la placa de agar jugo de manzana sin anestesia. Colocar inmediatamente la placa utilizada por una nueva que contiene una gota de pasta de levadura. Asegure la placa fresca con cinta y parafina y almacenar la jaula con placa de agar jugo de manzana como base. </li><li> Retire con cuidado la caída de la levadura de la placa utilizada con una espátula de metal. Coloque la tapa en la placa de jugo de manzana se utiliza y permitir embriones puso a la edad si experimentalmente necesario. Nota: Si bien el envejecimiento muestras, placas pueden almacenarse a 25 ° C menos que las temperaturas más altas son ExperimentaLLY necesario. Ejemplos de cómo los embriones para la recolección se ha descrito anteriormente la edad (ver nota para el paso 1.3). La eliminación de pasta de levadura antes de probar el envejecimiento se realiza para evitar que las larvas de meterse en la levadura y romper el agar debajo. El residuo agar jugo de manzana y pasta de levadura restante proporcionan nutrientes para el crecimiento de las larvas. Mientras que los embriones fijados directamente en la pasta de levadura se pierden a través de la eliminación de pasta de levadura, esta pérdida es preferible a la levadura y agar residuo de la muestra que puede reducir la eficiencia de la tinción. Si uno elegir no eliminar la pasta de levadura, la levadura puede ser licuado con tampón fosfato Triton X-100 (PbTx), mezclado con un pincel, y luego se retira de la muestra con un filtro de células antes de la fijación. </li></ol> 2. Fijación <ol><li> Una vez que los embriones fijados sobre la placa de agar jugo de manzana han envejecido hasta el punto de tiempo deseado, use un pincel pequeño humedecido con tampón fosfato Triton X-100 solución (PbTx) para quitar cuidadosamente la muestra de jue plato. Nota: Las larvas más viejas son móviles y puede gatear en el interior de la tapa. Esta muestra se puede recoger de manera similar por la eliminación con un pincel. </li><li> Limpie el pincel-muestra cargado contra la arista interior-frente de un filtro celular. Luego, enjuague las paredes del colador y el pincel con una botella con atomizador que contiene solución PbTx. Coloque una cubierta de placa de Petri debajo del filtro para capturar la solución PbTx. </li><li> Después de toda la muestra se ha transferido al colador, vierta suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. </li><li> Repita el paso 2.3 tres veces para eliminar la levadura y los residuos que puedan haber sido transferido junto con la muestra vuelan. </li><li> Vierta suficiente 50% de lejía (NaOCl) / agua (ddH2O) solución en el colador para elevar las larvas fuera de la malla. Permita que las larvas que se siente en la solución durante 5 minutos. Luego, levante el colador y verter tque el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. Se requiere Bleach sólo en las muestras embrionarias de edades comprendidas 0-22 hr a fin de eliminar la membrana coriónica: Nota. La aplicación de cloro para muestras de mayor edad se puede omitir, pero su inclusión no es perjudicial. Si se desea omisión, sustituya la lejía en este paso con PbTx. Lejía diluida debe utilizarse dentro de las 24 horas de preparación de la solución. </li><li> Lavar la muestra en el colador con PbTx vertiendo suficiente PbTx en el colador para elevar la muestra fuera de la malla. Permita que la muestra que se siente en la solución durante 3 min. A continuación, levante el colador y verter el contenido de la placa de Petri en un contenedor de residuos líquidos. </li><li> Repita el paso 2.6 de cinco veces. </li><li> Frote la parte inferior del filtro celular seco, a continuación, transferir la muestra a un vial de centelleo que contiene 1,75 ml de solución PEMS usando un pincel. </li><li> Trabajar en una campana de humos con ventilación, añadir 250 l de formaldehído al 37% y 8 ml de heptano grado reactivo en el vial de centelleo. <br/&gt; Nota: El formaldehído y el heptano son peligrosos. Por razones de seguridad, seguirá trabajando en una campana extractora ventilada y usar guantes apropiados para los pasos 2.9 a 3.3. </li><li> Dejar que el vial agitar a 200 rpm o velocidad moderada similar para 20 min. </li><li> Añadir 10 ml de metanol para vial de centelleo sin la eliminación de la fase acuosa anterior y permitir que el vial para agitar vigorosamente a 500 rpm durante 1 min. Nota: El metanol es peligroso. Continuar trabajando en una campana extractora bien ventilada y use guantes adecuados. </li><li> Retire el vial de agitador e inmediatamente vierta el contenido en un filtro de células sobre un recipiente de residuos líquidos en la campana. Añadir metanol adicional para el vial y ejecutar a través del filtro como sea necesario para asegurar que todos célula de muestra se ha eliminado. Nota: coladores celulares pueden drenar lentamente. Para remediar esto, tocar un tejido de laboratorio para la parte inferior del filtro de células a fin de extraer la solución a través del filtro más rápidamente. El metanol, formaldehído, y heptano debería seralmacenada en contenedores para residuos apropiados hasta la eliminación adecuada según las directrices institucionales. </li><li> Fondo seco del filtro de células utilizando un tejido de laboratorio, a continuación, utilizar un pincel para transferir la muestra capturada en el colador a un tubo de 1.5 ml contiene 0,5 ml de metanol. Nota: Si hay varios viales de centelleo están en uso, complete los pasos 2.12 y 2.13 un vial a la vez para evitar que la muestra se seque en células coladeras. </li><li> Una vez que la muestra se ha añadido al tubo de microcentrífuga, eliminar el metanol con una pipeta. Asegurar la muestra ha depositado en el fondo del tubo. </li><li> Enjuague muestra en el tubo de microcentrífuga mediante la adición de aproximadamente 0,5 ml de metanol al tubo. Espere a que la muestra que conformarse entonces eliminar el metanol con una pipeta. </li><li> Repita el paso 15 de tres veces. </li><li> Añadir 0,5 ml de metanol en el tubo, y luego almacenar en un congelador -20 ° C para su uso posterior. </li></ol> 3. Rehidratación y Preparación de la muestra para la inmunotinción <ol><li> Eliminar el metanol desde el tubo de microcentrífuga con una pipeta, dejando la muestra en el tubo. Tienda metanol residuos al contenedor de desechos apropiado hasta el momento de su eliminación adecuada. Nota: Para mejorar la eficiencia de tratamiento con ultrasonidos, utilizan no más de 3 mm de la muestra se establecieron en la parte inferior del tubo de 1.5 ml. El exceso de muestra puede ser transferida a un tubo separado con una pipeta antes de comenzar la etapa de rehidratación anteriormente. Cortar la punta de la pipeta con una cuchilla de afeitar limpia se puede utilizar para prevenir la obstrucción de la punta de pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de una / tampón fosfato Tween (PBTw) solución de metanol 50% al tubo y de la roca durante 3 min. </li><li> Eliminar la solución de metanol al recipiente de desechos adecuado y enjuague con 1,0 l de PBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de albúmina de suero bovino / Phosphate Buffered Tween (BBTw) mezclar al vial y el rock. Después de 3 minutos en un agitador, permitir que el sample se asiente y retire la BBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 3.4 dos veces, teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad BBTw como sea posible sin perder la muestra después del último lavado. </li><li> Añadir 0,5 ml de BBTw al tubo y colocar el tubo en hielo. </li></ol> 4. La sonicación de la Muestra <ol><li> Ajuste el aparato de ultrasonidos a 10% de la amplitud máxima y designar un tiempo de ejecución de sonicación constante 2 seg. Nota: Estos ajustes son específicos para el aparato de ultrasonidos se indica en los materiales y equipos Mesa y pueden requerir de optimización para diferentes sonicadores. </li><li> Antes de la sonicación de la muestra, limpiar la sonda de ultrasonidos mediante la colocación de la punta de la sonda en un tubo cónico de 50 ml lleno de agua desionizada y ejecutar sonicador para limpiar la sonda. Sonda de ultrasonidos en seco con papel de laboratorio después de la ejecución. </li><li> Sumergir la sonda en el tubo de microcentrífuga que contiene la muestra de modo que se sitúe aproximadamente 3 a 4 mm por encima de la muestra y empezar a sonicación. </li><li> Retire la microcentrifuge tubo y colocarlo en hielo durante al menos 30 segundos para disipar el calor de sonicación y permitir que la muestra se asiente en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. </li><li> Repita los pasos 4.3 y 4.4, según sea necesario por motivos de edad de la muestra que se está procesando. Nota: Para obtener el volumen de muestra sonicación óptima, los embriones menos de 17 horas, no requieren tratamiento con ultrasonidos, pero aquellos entre 17 y 24 horas (etapa 17 / early-L1) requieren dos sonicaciones. Las larvas entre 24 - 36 (a principios / mediados de L1), 36 - 48 (mediados / finales-L1), 48 - 60 (a principios / mediados de L2), 60 - 72 (mediados / finales-L2), 72-84 ( principios-L3), 84-96 (principios / mediados de L3), 96-108 (mediados / finales-L3) hr requieren 5, 9, 11, 13, 15, 18, y 22 sonicaciones respectivamente. Véase la discusión para más explicaciones sobre los tiempos de sonicación. </li><li> Enjuague con 1,0 ml BBTw dos veces. Después de cada enjuague dejar que la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la BBTw con pipeta. &lt;/ Li&gt; <li> Repita el paso 4.7 dos veces. </li></ol> 5. Inmunoticción <ol><li> Bloque de muestras mediante la adición de 5% de suero normal diluida en BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 1 hora. Nota: Utilice el suero normal de la especie en la que se generan los anticuerpos secundarios. </li><li> Diluir anticuerpos primarios para apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%. </li><li> Muestra de la roca en la solución de anticuerpo primario O / N a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. Nota: Los tiempos de incubación de anticuerpos y las temperaturas pueden variar. O / N de incubación a 4 ° C o 3 horas a RT es típicamente suficiente. Sin embargo, un período de incubación de dos días puede mejorar la calidad de la tinción, especialmente con muestras mayores o cuando se utilizan anticuerpos primarios de baja afinidad. Incubaciones más largas se realizan normalmente a 4 ° C. Consideraciones similares se deben hacer al utilizar anticuerpos secundarios (véase 5.10). </li><li> Permita que la muestra se deposite enparte inferior del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos primarios con pipeta. Ahorra anticuerpos para la reutilización, si lo desea. </li><li> Enjuague con 1,0 ml de BBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera BBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de BBTw al vial y el rock. Después de 3 minutos en el balancín, deje la muestra se asiente y eliminar BBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 5.6 de cinco veces. </li><li> Bloque de muestras mediante la adición de solución al 5% / suero normal de BBTw al tubo de microcentrífuga. Retire el bloque después de balanceo durante 30 minutos a 1 hora. Nota: No se requiere este paso adicional de bloqueo, pero puede mejorar la calidad de la tinción de anticuerpos específicos. </li><li> Diluir anticuerpos secundarios de apropiarse de la concentración de trabajo en solución / BBTw suero normal de 5%. </li><li> Envuelva tubo de microcentrífuga en papel de aluminio para reducir el desvanecimiento debido a la exposición a la luz. Muestra de la roca en la solución de anticuerpo secundario durante 12 a 48 horas a 4 ° C o por lo menos durante 3 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 22 ° C. </li><li> Permita que la muestra se deposite en el fondo del tubo de microcentrífuga. Trasvasar anticuerpos secundarios con pipeta. </li><li> Enjuague con 1,0 ml de PBTw dos veces. Después de cada lavado deje la muestra se asiente antes de sacar fuera de la PBTw con una pipeta. </li><li> Añadir 1,0 ml de PBTw al vial y el rock. Después de 5 minutos en el balancín, dejar que la muestra se asiente y retire la PBTw con pipeta. </li><li> Repita el paso 5.13 tres veces. </li><li> OPCIONAL: Añadir DAPI diluido 1: 1000 en PBTw. Muestra de la roca envuelta en papel de aluminio durante 3 min; a continuación, eliminar la solución de DAPI con una pipeta. Enjuague cinco veces con 1,0 ml de PBTw, permitiendo que la muestra se asiente antes de extraer PBTw con la pipeta. </li><li> Añadir 80-100 l de 1,4-diazabiciclo [2.2.2] octano solución (DABCO) al tubo de microcentrífuga y se almacenan a -20 ° C. Nota: Otro agente anti-fade basado en glicerol puede ser sustituido por. </li></ol> 6. Análisis <ol><li> Antes de la muestra de montaje en portaobjetos, añadir un extra de 5 - 10 l de DABCO / p-phenilenodiamina (PPD) Antifade solución al tubo de microcentrífuga. Nota: La muestra se puede añadir a las diapositivas sin disección. El volumen de muestra añadido a una diapositiva varía con el tamaño de hoja de la cubierta. Cuando el pipeteado de la muestra en un portaobjetos, la punta de pipeta se puede cortar utilizando una cuchilla de afeitar para prevenir muestra de cizallamiento. A menudo es útil para alinear muestra en filas para el análisis fácil. La adición de PPD como un agente Antifade adicional puede no ser necesaria, pero puede evitar photobleaching si las muestras se almacenan a largo plazo. </li><li> Coloque suavemente hoja de la cubierta de vidrio sobre la muestra. Entonces, cubreobjetos seguro en su lugar con el esmalte de uñas. </li><li> Ver muestra montada mediante microscopía de fluorescencia. </li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal.">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li><li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells.">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li><li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila.">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li><li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cell+identity,+morphology,+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila.">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este protocolo proporciona un método para dirigir con éxito inmunotinción Drosophila embrionario y en los tejidos de las larvas in situ, eliminando así la necesidad de disección. Según los protocolos anteriores para la tinción de embriones tempranos 1,2,3, la membrana coriónica se elimina usando 50% de lejía (NaOCl). Las muestras se fijaron en formaldehído y metanol. Debido a la cutícula de las larvas causa de muestra mayores a flotar, toda la muestra se hace pasar luego a través...

Embriones y larvas de Drosophila proporcionan un excelente modelo para estudiar los procesos de desarrollo en muchos órganos y tejidos. Obtención de imágenes de células individuales es a menudo necesario en estos estudios a fin de determinar los entornos complejos en los que se desarrollan las células. Visualización de las células en los tejidos se puede lograr mediante inmunotinción. Bueno-describen inmunotinción existen protocolos para tejidos embrionarios de Drosophila &lt;17 h después de la puesta de huevos (AEL) 1-3. Sin embargo, una protección formas cutícula hacia el final de la embriogénesis, la prevención de la permeación de anticuerpo eficaz. Por lo tanto, estos protocolos de inmunotinción son ineficientes en el análisis de los tejidos en embriones de la última etapa y en etapas posteriores de desarrollo de las larvas (1 st estadio (L1), 2 nd estadio (L2), y 3 º estadio (L3)). Esta ineficiencia impone una barrera para nuestra comprensión de los procesos dinámicos que ocurren durante este período de desarrollo prolongado 4. Tissdisección ue es una técnica ampliamente utilizada para eludir esta barrera 5-7. Sin embargo, la disección puede resultar ineficaz. La extracción puede ser gravado por la dificultad en localizar o aislar embriones y tejidos larvarios. Por otra parte, la eliminación física de los tejidos diana puede causar daño rompiendo ellos o al no extraer en su totalidad. La sonicación es un método que emplea ondas sonoras para perturbar las interacciones intermoleculares. Se ha utilizado para interrumpir la integridad de la cutícula de las larvas de Drosophila con el fin de inmunotinción desarrollo de tipos de células neuronales 6. Este protocolo ha sido adaptado a inmunotinción de embriones en etapa tardía y las gónadas de larvas, que pueden ser tan pequeñas como 50 micras de diámetro 8-10. A través de estos estudios, el proceso de células madre de línea germinal (GSC) formación nicho macho se ha caracterizado en la etapa tardía embriones de Drosophila 8-10 y los mecanismos que regulan el desarrollo de células madre y el DIFdiferencia- en la etapa tardía gónadas embrionarias y las larvas se han dilucidado 9-12. Por lo tanto, sonicación proporciona una alternativa eficiente para la disección de tejidos que puede ser difícil debido al tamaño del tejido. Además, permite la inmunotinción de tejidos de Drosophila in situ, dejando a las células en el contexto de todo el organismo y mantener en la morfología situ. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para la fluorescencia inmunotinción de la última etapa embrionaria hasta principios / mediados de los tejidos L3 in situ. Análisis de Drosophila gonadal y neural tejido se muestra en los resultados representativos para demostrar la eficacia de este protocolo. Además, este protocolo de inmunotinción puede estar adaptado para analizar otros tejidos de Drosophila, así como en otros organismos tejidos con una cutícula externa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 1: Reagents and Buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Triton X-100 (PBTx)</td>
			<td>For 5 L: 500 mL PBS 10X 4.45 L ddH2O 50 mL Triton 10%</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline 10x (PBS 10X)</td>
			<td>For 1 L in dH2O: 80 g NaCl 2 g KCl 14.4g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4</td>
			<td>Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL of Triton 5 mL of PBS 10X 45 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEMS</td>
			<td>0.1 M Pipes (pH 6.9) 2.0 mM MgSO4 1.0 mM EGTA</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipes</td>
			<td>For a 400ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH</td>
			<td>Dissolve Pipes in 300 mL dH2Oand then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 mL with dH2O and autoclave. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>37% formaldehyde by weight in methanol</td>
			<td>Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>n-Heptane</td>
			<td>CAS 142-82-5. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Methanol</td>
			<td>CAS 67-56-1. Store at room temperature. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Tween (PBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10%</td>
			<td>Filter sterilize after adding all components. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 10%</td>
			<td>For 50 mL: 5 mL Tween 5 mL of PBS 10X 40 mL of ddH2O</td>
			<td>Rock to mix. Store at room temperature.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin/Phosphate Buffer Tween (BBTw)</td>
			<td>To make 1 L: 100 mL PBS 10X 890 mL ddH2O 10 mL Tween 10% 1 g Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Add BSA then sterilize using a 0.2 micrometer vacuum filter unit. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>To make 10 mL: Normal Goat Serum (Jackson ImmunoResearch Laboratories Code: 005-000-121) 10 mL ddH2O</td>
			<td>Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 micrometer syrninge filter. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td>To make 100 mL: 25 mL ddH2O 1 mL Tris HCl (1M, pH 7.5) 2.5 g of DABCO solid (CAS: 281-57-9) 3.5 mL 6N HCl 250 uL 10N NaOH 70 mL glycerol</td>
			<td>In 250 mL beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DABCO + p-phenylenediamine (PPD) Solution</td>
			<td>1.765 mL NaHCO3 0.353 Na2CO3 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3)</td>
			<td>Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 uL of PPD solution to 500 uL of DABCO. Store aliquots at -20 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apple juice plates</td>
			<td>To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0) 45 g granulated sugar (store bought) 500 mL Apple juice (store bought) 15 mL Tegosept 10% 1.5 mL ddH2O</td>
			<td>Add agar to ddH2O in 4L flask then autoclave for 30 minuntes. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10mL volumes into 35 mm petri dishes and let stand at room temperature to solidfy. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept 10%</td>
			<td>To make 100mL: 10g Tegosept 100 mL Ethanol</td>
			<td>Store aliquots at -20 degrees C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast paste</td>
			<td>~50 g Dry Active Yeast</td>
			<td>Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 degrees C.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 2: Staining Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1:1000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571 //// Stock at 5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-Vasa</td>
			<td>1:250</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Ruth Lehmann</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasciclin III</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>7G10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-1B1</td>
			<td>1:4</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>1B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guniea pig anti-Traffic Jam</td>
			<td>1:2500</td>
			<td></td>
			<td>A gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Prospero</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Prospero MR1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-Elav</td>
			<td>1:30</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>Rat-elav 7EBA10 anti-elav</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Repo</td>
			<td>1:10</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>8D12 anti-Repo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa546</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-guniea pig Alexa633</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rat Alexa488</td>
			<td>1:500</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Table 3: Materials and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly Cages</td>
			<td>Hand-made; Genesee Scientific Corporation</td>
			<td>Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101</td>
			<td>Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model: Branson Digital Sonifier 250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator Probe</td>
			<td>Branson</td>
			<td>Model #: 102C (CE)</td>
			<td>EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>190-25-20</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose, acetate membrane filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software</td>
			<td>Microscope: Olympus Light source: Lumen Dynamics Camera: Q-Imaging Imaging Software: Intelligent Imaging Inc.</td>
			<td>Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc Light source: X-Cite 120Q Camera: RETIGA-SRV Imaging Software: Slidebook 5.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter unit</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>450-0020</td>
			<td>0.2 micrometer cellulose nitrate membrane filter</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sonication-facilitated immunofluorescence staining of late-stage embryonic and larval drosophila tissues in situ

Los estudios realizados en Drosophila melanogaster embriones y larvas proporcionan información fundamental en los procesos de desarrollo, tales como la especificación del destino celular y la organogénesis. La inmunotinción permite la visualización de desarrollo de tejidos y órganos. Sin embargo, una cutícula protectora que se forma en el extremo de la embriogénesis impide la penetración de los anticuerpos en embriones de fase tardía y las larvas. Mientras que la disección antes de la inmunotinción se utiliza regularmente para analizar los tejidos larvarios Drosophila, resulta ineficaz para algunos análisis porque los tejidos pequeños pueden ser difíciles de localizar y aislar. La sonicación proporciona una alternativa a la disección en los protocolos de inmunotinción Drosophila larval. Permite la rápida tramitación y simultánea de un gran número de embriones en etapa tardía y larvas y mantiene en la morfología situ. Después de la fijación en formaldehído, se sometió a ultrasonidos una muestra. Muestra a continuación, se somete a inmunotinción con la hormiga primaria específica de antígenoibodies y secundaria de anticuerpos marcados con fluorescencia para visualizar los tipos de células diana y proteínas específicas mediante microscopía de fluorescencia. Durante el proceso de sonicación, la colocación apropiada de una sonda de sonicación encima de la muestra, así como la duración y la intensidad de la sonicación, es crítico. Modificaciones menores Adicionales a los protocolos de inmunotinción estándar pueden ser necesarios para las manchas de alta calidad. Para los anticuerpos con baja relación señal a ruido, los tiempos de incubación más largos son típicamente necesario. Como una prueba de concepto para este protocolo de tratamiento con ultrasonidos-facilitado, mostramos inmunotinciones de tres tipos de tejidos (testículos, los ovarios y los tejidos neuronales) en una serie de etapas de desarrollo.

Para demostrar la eficacia de la inmunotinción a base de ultrasonidos en el análisis de embriones en etapa tardía y tejidos larvarios in situ, de tipo salvaje embriones y larvas fueron procesadas para la inmunotinción de los testículos, los ovarios, y el tejido neural. Las muestras se obtuvieron imágenes a través de microscopía confocal y los resultados representativos se muestran (Figura 1 y Figura 2). Los resultados revelan que el protocolo descrito es eficaz para la ...

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Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

12.5K vistas.  College of William & Mary. Immunostaining is an effective technique for visualizing specific cell types and proteins within tissues. By utilizing sonication, the protocol described here alleviates the need to dissect Drosophila melanogaster tissues from late-stage embryos and larvae before immunostaining. We provide an efficient methodology for the immunostaining of formaldehyde-fixed whole mount larvae. 

Video: Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

Cultivos neuronales primarios del cerebro de Drosophila pupas etapa tardía

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophila larval NMJ Disección

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

La disección y la tinción de Drosophila Larvas Ovarios

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

La medición de las larvas La actividad en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Actividad

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...