この作品は、以下の中からRAWに資金によってサポートされていました：国立衛生研究所は、K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237を付与します。ダイムバジルオコナースターター学者グラント賞＃5-FY12-75 3月;科学と生物科学専攻のノートルダム大学の大学から資金を起動する。そしてギャラガー家族に代わってエリザベスとマイケル·ギャラガーからノートルダム大学の寛大な贈り物は、幹細胞研究促進するため。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割がありませんでした。私たちは、ゼブラフィッシュのコロニーのケアと福祉での傑出した献身ために彼らのサポートのために生物科学科のスタッフに感謝し、ノートルダム寺院でのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、この作品についての彼らのコメント、議論や洞察力のための私達の研究室のメンバーに感謝。

著者らは、開示することは何もない。

ここでは、成体ゼブラフィッシュにおけるネフロンセグメントのコンポーネントの視覚化を可能にする方法を記載している。蛍光デキストラン複合体の注入は、これらの近位尿細管細胞30,38のエンドサイトーシスの性質により優遇されたPCTラベリングを可能にします。この方法は、異なる蛍光複合体の群れを得ることができるデキストランの存在に非常に柔軟に行うことができる。二次標識手順が必要とされないように加えて、リジン固定可能なデキストランの使用は、PCTセグメントを標識するための特に便利な方法です。これは、比較的簡単な信号検出を可能にし、多くの他の蛍光標識、免疫標識、およびトランスジェニックレポーター株の使用と互換性がある。アルカリホスファターゼ標識はまた、PCTにおいて強い反応性とPSTでわずかに弱い反応性、近位尿細管をマークします。最後に、DBA染色はCHを表示遠位尿細管セグメントのラベル付けを可能にしますaracteristicは形態を分岐した。非免疫由来の糖結合タンパク質である、さまざまなレクチン分子は、哺乳動物のネフロンセグメント47を区別するために広く使用されてきた。それはそれは、哺乳動物の腎臓47に集合管をマークするために利用されるようにゼブラフィッシュにおけるDBAは、遠位尿細管セグメントと相関していることは興味深い。 まとめると、これらの方法は、腎組成および機能を文書化するためにさまざまな組み合わせで利用することができる。これらの方法の全ては、全体の腎臓調製物において使用することができるので、それらは完全に多くの時間がかかり、面倒な方法、 例えば、凍結切片作業と免疫標識の使用に頼ることなく、臓器全体ネフロンの構造と機能を評価するためのツールを提供する。しかし、この方法の資料に記載の汚れは凍結切片で生存可能である。凍結切片の分析は、特定のpeptiを検出するための免疫組織化学のために適しています（ホールマウントと比較して）サンプルを生成DESは、もちろんかかわらずこの種の分析は、適切な一次抗体の利用可能性を必要とします。残念ながら、ゼブラフィッシュ、動物モデルでの作業中の一つの主要な制限は、抗体の貧しい可用性残る。したがってWISHは、遺伝子発現の解析のための最も広く使用されている、 すなわち、「ゴーに、「手続きのまま。紫や赤の沈殿物を生成するためにBCIP、NBT、および/またはINT基質反応を用いてWISHは、凍結切片上の蛍光染色と互換性がありません。一つの選択肢は、蛍光WISH検出、ゼブラフィッシュの胚のサンプル用に最適化されており、成人の腎臓での使用のために調整することができた手順の使用を呼び出すことであろう。このビデオ記事の方法の説明は、個別のセグメントは、eGFPのかmCherryをレポーターで標識されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統との組み合わせで蛍光WISHのような技術とのさらなる実験のために許可する必要があります。代わりに、これらの方法は、ここでクーロンを説明したその他の重要な染料、 例えば、他のレクチンと組み合わせて試験することがdは。したがって、ここに記載した方法の更なる適応と膨張が全体マウント腎臓調製および分析のための研究者のニーズに合うように呼び出すことができる。 このように、これらの方法は、進行中の再生の研究のためのゼブラフィッシュモデルと実装のための、また、遺伝病のモデル化において幅広い可能性を秘めている。腎臓の苦痛のための革新的な研究や治療の差し迫った必要性がある。何百万人もの人が、先天性の急性および/または慢性の原因から生じ、毎年腎臓病のいくつかのフォームに苦しんでいます。さらに、腎臓病の有病率は、これらの疾患のグローバルな公衆衛生上の問題14,15を作り、世界的に上昇し続ける。外部透析機械が自分の腎臓がこの役割を実行できない場合には、代謝廃棄物の患者の血液を取り除くのに役立つことにより、血液透析などの治療法が利用可能である。残念ながら継続的な治療が生存のために必要であるとして、この介入は、制限があります。また、患者は、最終的には、患者がキャンセル待ちに置かれると受け取るように年を取ることができる腎臓移植を必要とします。でも、腎臓移植を取得した後、多くの患者は、手順の結果として悪影響を受けると自分たちの生活の残りのためにこれらの効果を戦う必要があります。これらの困難は、腎疾患を予防またはおそらく組織再生8,16,52,53を強化するのに役立つどちら小説治療法の開発のための重大な必要性を実証している。生物医学研究室で人間の被験者の使用の明白な倫理的な限界を考えると、動物モデルは、ヒト疾患の病因の研究のため、新たな治療法のテストのために不可欠である。その解剖学的類似性および進化の近接の結果、マウスは、ヒト疾患45の最も広く使用されているモデルとなっている。しかし、この動物との一定の制限がはこちらより、あるインビボでの大規模遺伝子スクリーニングを完了することの実用性器官の発達を可視化するることができない。ゼブラフィッシュは、ヒト疾患45,46の臓器の開発とモデリングの研究のための関連性の高い有益なモデル生物である。ヒトの疾患に関しては、ゼブラフィッシュにおける機能ホモログは、ヒトの全遺伝子54,55のほぼ70％のために存在する。 最近の研究は、腎臓の研究31,37,56の多くの分野のためのゼブラフィッシュの有用性を強調している。 AKI後のゼブラフィッシュにおける再生及び修復の研究は、尿細管上皮再生とneonephrogenesisが発生し、30,37時間経過再生を通じて重複する2つのプロセスがあることを示唆している。ゲンタマイシンと呼ばれるアミノグリコシド系抗生物質の使用は、成人のゼブラフィッシュ29,30,37にAKIの成果を研究するためのそれを通して怪我パラダイムとして利用されている。ゲンタマイシン、近位tubulから損傷後約2週間にわたりエス再生成し、その間に新しいネフロンは、臓器29,30,37を通じて形成される。一般的には、上皮再生を制御するメカニズムは非常に議論の余地が残されている。修復プロセスの1提案されたメカニズムでは、内腔への死細胞の脱落に続いて、最初の急性損傷のイベントがあります。次に、新しい細胞が分化し、その後脱分化、増殖、および移行一連のイベント、負傷した基底膜を再増殖し、損傷部位に機能を回復さがある。あるいは、他の研究は、置換細胞はネフロンの尿細管内に存在する幹細胞/前駆細胞から生じることを示唆している。ゼブラフィッシュにおいてneonephrogenesisのプロセスに関しては、細胞凝集体は、ゲンタマイシン注射29,30によって次AKIが観察されている。これらの凝集体は後に既存の細管29,30に配管し、新しいネフロンに成熟する。ネフロン上皮再生とneonephrを結びつける共通のスレッドogenesisは、全くの謎因子である：現時点では、これらの回生偉業が利用可能な洞察があるよりも、発生する方法については、指数関数的に多くの質問があります。 現在までに、しかし、証拠のいくつかのエキサイティングなラインがゼブラフィッシュを用いた腎再生研究は確かに、直接、翻訳可能性56-58を有することができる人間のAKIに関連する比較洞察を提供できるという考えを支持している。化学スクリーニングは、最近、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤メチル-4-（フェニルチオ） -ブタノエート（m4PTB）56,57が同定されたゼブラフィッシュ胚における腎前駆細胞の増殖を増加させる小分子を同定する。ゲンタマイシン誘発のAKIとゼブラフィッシュの幼虫にこの化合物の投与は、幼虫の生存率が増加し、その尿細管増殖は56,58を向上したことを明らかにした。適度な虚血誘導AKIとマウスをm4PTBで処理した場合、その回復が連想で加速された尿細管細胞58の増殖の両方尿細管萎縮および細胞周期停止の減少にiation。これらの知見は、正常なゼブラフィッシュ腎臓の発生および/ ​​またはAKI回生応答を担う経路は、哺乳類56で保存されることを示唆している。 このように、さらなる研究が関与しているシグナル伝達経路を特定し、それらの相互作用、ゼブラフィッシュは、腎臓フィールドに、この重要な目標を追求するために、1つの有望な手段を提供して理解することが回生すなわちのメカニズムを離れていじめるために必要とされている。このようなプロトコルに記載ネフロンセルのラベルなどのツールは、AKIモデルにおいて腎組成および機能性を評価するために利用することができるアッセイの1つのグループを表す。さらに、それらは、腎臓病のトランスジェニックモデルを特徴付けるために適用することができ、腎ダム後のネフロン構造の修復を促進することができる化学治療薬を同定する方法を提供することができる時代。

腎臓は、体内の生理機能の多くを満たす複雑な器官である。腎臓の最も重要な機能は、代謝老廃排泄され、このタスクは密接流体恒常性の維持と絡み合っている。付随的に、血圧、電解質レベル、および酸塩基平衡を調節しながら腎臓は、血液を濾過し、尿を形成することにより、これらのジョブを実行する。ネフロンと呼ばれる高度に専門化上皮尿細管は、腎臓1,2の基本的な機能単位として機能する。大人の脊椎動物では、ネフロンは、一般的にこのように多くの細管がかなり小さな器官にパックするためにできるように、集中排水システムを取り巻くしっかりとコイル状の配置で構成されています。例えば、それぞれの人間の腎臓は100万人以上のネフロン3を含むことができます。マウスのような他の哺乳動物は、腎臓4あたり8から10000ネフロンのオーダーで保有する。腎臓の複雑度は、これらの哺乳動物および他のヴェールの間で異なる総ネフロン数と腎臓内でのそれらの建築レイアウトの変動によるebrates。脊椎動物種は開発中に最大3つの連続した​​腎臓構造を形成し、ネフロン養老や配置に関して複雑さを増す各フォームが表示されます。前腎、中腎、および後腎。保持される最後の腎構造は、成人の腎臓臓器通常、中腎または後腎2として機能する。各腎臓の形態は、しかしながら、ネフロン系組成物2を有する。 ネフロンは腎臓の主力であり、代謝物分泌および再吸収と一緒に血液濾過を担当しています。ネフロンは、上皮細胞で構成される単純な管状構造であり、分化した上皮の離散、専門性の高いドメインは、特定のタスクを実行する分節組織を持っている。ネフロンを通してろ液の流れのために、典型的には、3つの主要な部分はcomprisことがある電子各ユニット：（1）腎小体、近位、中間、および遠位セグメントを有する、（2）尿細管、および（3）集合管1。近位尿細管は、有機溶質、最も顕著なグルコースおよびアミノ酸1の再吸収を担当しています。中間細管（またはヘンレのループ）塩と水の調節1の主要部位である。最後に、塩および他のイオンの微調整は、遠位尿細管および集合管で発生し、高度内分泌系1によって調節される。そこから、ろ液は、最終的には廃棄物1としての体を出て、尿管、膀胱を通って移動する。 腎機能の喪失は、正常なネフロンの活動を妨げる原因の多数に由来することができます。これらの原因は腎臓の発生、ネフロン5の奇形を引き起こすなど、先天性欠損、または損傷の異なるタイプからの原因（遺伝的およびenvironme両方に起因する時に発生する可能性がありますNTAL起源）。後天性の傷害は、大きく、急性腎臓損傷（AKI）または慢性腎障害（CKD）に分類される。 AKIは、多くの場合、虚血または毒素曝露6,7起因する腎機能の突然の喪失を伴う。哺乳類では、ネフロン上皮修復は、このような怪我8後に可能となり、多くの人が、AKI後の腎機能の完全な回復を示す。 70％の入射範囲6,7 -しかし、AKIも広い30全体に報告されており、高い罹患率と死亡率に関連付けられています。 CKDは、対照的に、典型的には、線維症8,9に関連付けられた、延長された損傷の年に起因する腎機能の進行性の喪失と関連している。どちらか一方が他方10-12に個人を素因となることができますように。また、相互作用は、AKIとCKDの間に存在する。例えば、AKIに苦しんでいる人たちは、CKDや死13の影響を受けやすくなります。腎臓病の発生率は、米国および全世界の両方、epideに達しているマイクプロポーションとは高齢者人口は、腎臓14,15のための再生医療介入を識別するためのニーズがあると、このように拡張するように上昇すると予測される。 AKI患者が回復できるという知識にもかかわらず、それは長い間、腎臓が先天的回生の力のない臓器であると考えられてきた。この伝統的なビューには、劇的に近年16年に改定されました。 AKI後のマウスとラットで腎障害を調査する研究はネフロン細管上皮細胞が増殖し、機能的ネフロン17-20を再構築することができることを示している。哺乳類はネフロンを再生成するには、この適応能力を有しているが、腎線維症とCKD 21につながるトリガすることができます注目すべき制限及び不適応応答があります。例えば、最近の研究では、マウスネフロンにおける繰り返さ上皮細胞の切除が減少再生に関連していたことが実証され、腎線維化を示唆しているネフロンは場海EA限られた回生しきい値22。大人の哺乳類の腎臓は、紛失または破損したものを置き換えるために新しいネフロンを構成するので、それらの破壊が恒久的なネフロン赤字8,9につながるという証拠はない。興味深いことに、いくつかの脊椎動物はネフロン上皮を再生することにより、また、新しいネフロン、neonephrogenesisまたはネフロン新生23と呼ばれるプロセスを生成することによって、AKIに反応しません。 Neonephrogenesisは毒素曝露または部分切除後に魚に発生し、損傷モデルは、歴史的に金魚24,25、ティラピア26、スケート27、メダカ28、およびより最近では、ゼブラフィッシュ29,30が含まれている。これらのうち、ゼブラフィッシュは、腎再生のための責任を細胞および分子経路を発見するために実行可能な遺伝子研究のモデルを提供する。 このビデオの記事では、成人のゼブラフィッシュではネフロンセグメントにラベルを付ける方法を示します。ネフロン解剖学、分子的特徴に関する知識、そして機能的特徴は、ゼブラフィッシュを用いて、将来の成功腎研究のために不可欠です。大人のゼブラフィッシュの腎臓は中腎構造であり、大人の哺乳類、鳥類、爬虫類31で見つかった後腎構造よりネフロン数と組織の観点から本質的にあまり複雑である。しかし、ゼブラフィッシュネフロンセグメント組織は、哺乳類に類似しており、最初の遺伝子発現研究31-35に基づいて胎児腎臓で文書化されました。ゼブラフィッシュ胚ネフロンは、近位尿細管（PCT）、近位尿細管ストレート（PST）、（DE）遠位早く、および遠位後期（DL）31-35（ 図1）を含むリニア細管セグメントを含む。ゼブラフィッシュ成体のネフロンは、同様の管状のセグメント30,31,36,37（ 図1）を有する。 PCTは、機能表現型によって識別できます。PCTにおける上皮細胞は（サイズは10〜70 kDa）の蛍光標識されたデキストラン化合物を組み込む予定に存在胚および成体ゼブラフィッシュの腎臓の両方で使用されてきた循環は、これらの近位尿細管細胞38-41（ 図1）によるエンドサイトーシス取り込みを評価した。ゼブラフィッシュと哺乳類の間ネフロンセグメントにおける1つの違いは、ゼブラフィッシュが中間尿細管、ヘンレまたは30-37のループを欠いているということです。哺乳類におけるこのセグメントの機能は、水を節約するために、ゼブラフィッシュは、その尿を濃縮するための緊急性のない淡水種であるので、ゼブラフィッシュは、このセグメント32,33を欠いていることは驚くべきことではない。このように、全体的なネフロン組成物は、主にゼブラフィッシュと哺乳類の腎臓32,33の間で保存されている。これらの類似性は、発生腎形成32-35,42時の腎発現遺伝子の機能を調査することにより、することができ、人間の条件のかなりのリストに追加して、非常に多くの腎疾患43,44をモデル化するための有効な研究ツールであることがゼブラフィッシュを有効にしている使用して調査ゼブラフィッシュ45,46。 今日では、成人のゼブラフィッシュの腎臓は、その遺伝的取り扱いやすさと、この種における遺伝子機能及びシグナル伝達経路を調べるために利用可能な技術リソースの拡大を口蓋に腎再生の比較研究のための魅力的なモデルです。いくつかの研究は、AKI 29,30,37後の再生のメカニズムを調査するためにゼブラフィッシュ中腎を使用している。大人のゼブラフィッシュの腎臓を使って継続的なAKIの研究のためには、ネフロンの機能を調査するために、異なるネフロン領域や方法を標識する絶妙なメソッドを持つことが不可欠である。成人腎臓分析のためのいくつかの方法が胚腎臓プロトコルから適応されている。大人のゼブラフィッシュにおける蛍光標識されたデキストランの腹腔内注射は、ゼブラフィッシュ胚38-41（ 図1）のように、エンドサイトーシス30を介して中腎ネフロンにおけるPCT上皮にラベルを付けます。この方法は、visualizするために使用されている近位尿細管が復元生理的機能の一つ評価30（ 図1）を可能AKI、次の彼らの再吸収財産を取り戻すメール。ネフロンの近位尿細管のもう一つの特徴は、このセグメントの上皮細胞は、内因性アルカリホスファターゼ活性の高いレベルを示す刷子縁37を有することである。このように、近位上皮はELF-（酵素標識蛍光）として知られている蛍光ベースの技術-97 47を使用して、大人のゼブラフィッシュの腎臓で視覚的に定位させることができる。 ここでは、近位尿細管の機能評価を取得し、この細管セグメントのサイズと輪郭をマッピングするように、成人のゼブラフィッシュの腎臓中の蛍光デキストラン取り込みアッセイを30,48の実行方法について説明します。次に、蛍光標識アルカリホスファターゼで大人のネフロンの近位尿細管領域を標識するためのテクニックを説明します。第三に、私たちはそのrhod初めて示して哺乳類の腎臓49集合管の一般的なマーカーとして使用されてきたアミンタグ付きレクチンドリコスbiflorus凝集素（DBA）は、成人のゼブラフィッシュの腎臓の遠位尿細管をマーク。 DBAは、アルカリホスファターゼ染色に相互に排他的であるように、これらのラベルは、広く大人のゼブラフィッシュネフロンのパン - 遠位ストレッチに対する汎近位を区別する方法を提供します。ホールマウントクライオスタット組織切片の両方でこれらの蛍光染色剤の実装を通じて、私たちは一意にネフロンセグメントを識別し、溶質輸送体遺伝子の発現ドメインとこれらのラベルを関連付ける。したがって、このプロトコルはまた、当社の胚WISHプロトコル50に基づいて、in situハイブリダイゼーション （WISH）分析における成体組織全体のマウントのための修正された組織処理手順のガイドが含まれています。これらの手順は、O、形態学的および機能的属性を文書化するためにさまざまな組み合わせ（ 図2）において使用することができるfは大人のゼブラフィッシュの腎臓ネフロン。したがって、これらのプロトコルは、再生の研究、他の腎疾患モデルの表現型の特徴に適用することができ、さらには成人腎臓の形成を研究するために使用される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

ゼブラフィッシュのモデルは、腎臓の開発、再生や病気を研究するための関連システムとして浮上している。どちらの胚および成体ゼブラフィッシュ腎臓を強く哺乳類を含む他の脊椎動物と保存されているネフロンとして知られている機能ユニットで構成されている。ゼブラフィッシュの研究は最近、成人のネフロンが被害を被るから2独特の現象が蒸散ことを実証した：最初に、破壊された尿細管上皮細胞に置き換えられ、既存のネフロン内の強固な再生があります。第二、全く新しいネフロンはneonephrogenesisとして知られているプロセスにおける腎前駆細胞から産生される。これとは対照的に、ヒトおよび他の哺乳動物は、ネフロンの上皮再生のための限られた能力を持っているようだ。現在までに、これらの腎臓再生現象の原因となるメカニズムはよくわかっていないままである。大人のゼブラフィッシュ腎臓はネフロン上皮再生とneonephrogenesis両方を受けるので、それらは優れた実験的なパラを提供これらのイベントを研究するdigm。さらに、腎臓の再生を制御する細胞および分子メカニズムを描写するために使用することができるゼブラフィッシュモデルで利用可能な遺伝的および薬理学的ツールの広い範囲が存在する。このような研究の一つの重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、大人のゼブラフィッシュの腎臓における腎組成やテストネフロンの機能を評価するために使用することができます標識技術のセットについて説明します。したがって、これらの方法には、これらに限定されないが、成体ゼブラフィッシュの腎臓損傷パラダイム、腎毒性暴露方式や、ニトロレダクターゼ媒介細胞アブレーション法などの標的細胞死の遺伝的方法の将来の表現型の特徴付けに広く適用可能である。さらに、これらの方法は、成人の腎臓形成に遺伝的摂動を研究するために使用することができ、また、慢性疾患のモデリングの際に腎状態を評価するために適用することができる。

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Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。

大人のゼブラフィッシュの腎臓におけるネフロン構成と機能の解析

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K ビュー.  University of Notre Dame. ゼブラフィッシュ成体の腎臓は腎臓の再生や病気の研究のための優れたシステムです。このような研究の重要な側面は、ネフロンの構造と機能の評価である。このプロトコルは、ネフロンの尿細管組成を評価し、腎再吸収を評価するために実施することができるいくつかの方法論を記載している。 

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュの全腎骨髄の移植

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

生物学

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュからの臓器の解剖

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

アダルトゼブラフィッシュへの腹腔内注射

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

直接アダルトゼブラフィッシュの腎臓への細胞の移植

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

アダルトゼブラフィッシュ腎臓の解剖

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

アダルトゼブラフィッシュ網膜にモルフォの in vivoエレクトロポレーションに

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

リジェネアダルトゼブラフィッシュテールフィンにMorpholinos の in vivoエレクトロポレーションで

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

大人のゼブラフィッシュの生化学的解析のための採血

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavagingアダルトゼブラフィッシュ

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...