この手順の全体的な目標は、成体シマウマ魚における腎毒性剤としてのシスプラチンの使用、炎症、および腎臓組織における細胞死を分析する方法を説明する。これを達成するために、成体シマウマの魚は麻酔をして、腹腔内のシスプラチンの特定の用量で注入するために計量されます。モニター死亡率の後、腎臓を解剖し、細胞を分離してフローサイトメトリーを調べ、あるいは、蛍光TUNELアッセイによって分析するために解剖する。
以下の手順は、急性腎損傷モデルおよび成人シマウマ魚を開発するためのツールとしてシスプラチンの腎毒性効果を使用して腎分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。このモデルは、腎保護における新しい治療標的の探索に使用できるだけでなく、シマウマの魚の腎臓の再生のメカニズムを解明する。シスプラチンは、様々な癌を治療するために使用される化学療法剤である。
しかし、腎臓に容易に蓄積し、細胞死、炎症を発生させ、腎機能を低下させることができる。シスプラチンの効果は用量に依存します, あなたの目的に依存して投与の私たちの増加を下げることができます..炎症や細胞死を分析するためにここで使用される技術は、疾患モデルの普及のためだけではありません。
シマウマ魚のフローサイトメトリーは、動物の炎症状態を定量的な方法で解明するのに役立ちますが、TUNELでは生理学的および病理学的文脈におけるポプト化された細胞の存在を明確にすることができます。実験を開始する前に、ストック溶液を0.9%塩化ナトリウムで1milあたり820マイクログラムに希釈してシスプラチン加工液を調製します。次に、別のシマウマの魚を麻酔し、いくつかのペーパータオルの余分な水を乾かします。
魚の重量を量る、重量の注意を取って、スケールでそれらを配置します。注入する正確なボリュームを知るために計算を行います。体重グラム当たり120マイクログラムの用量を達成するには、次の式を使用してください。
最終的な用量を作業溶液の用量で割り、この数をマイクロリットルに変換し、1000を掛けてシスプラチンの120マイクログラムの体積を得る。次に、この数値に魚の重量を掛けて、注入する最終的な体積を得ます。濡れたスポンジの上に魚を置き、それを保持するために小さなカップを入れて。
腹側を上にして、シスプラチンの計算された量でインスリン注射器を満たす。腹側の正中線に浅い角度で針を挿入し、腹側壁を優しく引き上げて内臓を穿刺しないようにします。そして、ソリューションを注入します。
注射後、魚を水槽に入れて麻酔から回復し、水泳や適切な動きなどの回復の兆しを待ちます。その魚を1日2回監視します。この用量では、シスプラチンは最初の24時間で約30%の死亡率を誘導する。
魚を安楽死させ、ペーパータオルで余分な水を乾かします。頭部と内臓を取り外した後、解剖針を使用して身体の壁を固定します。魚の裏壁に腎臓を見つけ、鉗子を使って腎臓を取り外します。
1つの1X PBS、2%FBSの冷却溶液で6つのウェルプレートに腎臓を入れ、氷の上に保ちます。次に、液体で組織をピックアップし、40ミクロンの細胞ストレーナーを通過し、注射器プランジャーで組織を穏やかに浸漬します。1回の1X PBS、2%FBSで2回洗浄します。
そして、50ミルハヤブサチューブに細胞を収集します。その後、400 G.慎重にピペットで上清をピックアップし、それを捨てるで5分間遠心分離機。500マイクロリットルの冷たい1X PBSを加えて細胞を再中断し、5ミルフローサイトメトリーチューブに入れます。
氷の上に保管してください。サンプルを10マイクロリットル取り、エペンドルフチューブに90マイクロリットルのトリパンブルーと混ぜます。混合物の10マイクロリットルをネオバウアーチャンバーに加え、顕微鏡で細胞を数えます。
細胞を読み取る細胞をサイトメーターで取り、興味のある母集団を選択した結果を分析します。この手順では、魚を安楽死させ、腎臓を体内に取り付けたまま内臓を取り除きます。次に、コルクの表面にボディの壁を固定し、固定溶液の上にフェージングを配置します。
一晩で4度に保ちます。翌日、細かい鉗剤で腎臓を解剖する。それを混乱させないようにしてください。
1X PBSの小さなシャーレまたはエペンドルフチューブに入れ、洗いすります。PBSを変更し、彼らがしっかりと処理する前に腎臓の支持マトリックスを生成するために2%アガロースを準備します。残りのPBSをすべて捨て、アガロースをゆっくりと注ぎます。
次に、腎臓を細かい鉗子で配置し、折り畳むのを防ぎます。アガロースを室温で固めます。アガロース固化後、メスを使って小さな立方体を形成する腎臓の周りにアガロースを切断する。
アガロースキューブを組織学的カセットの中に入れ、組織をパラフィンに埋め込むために組織学的処理のために送ります。パラフィンブロックは、その後、5ミクロンの厚さのセクションにカットします。ワックスを取り出し、蒸留水に入れておきます。
暗いインキュベーターチャンバーを準備し、底に濡れたペーパータオルを置きます。スライドを暗室に入れ、組織の透過性のためにプロテアーゼKを加えます。37°Cで30分間インキュベートします。
サンプルをインキュベートしながら、TUNEL反応混合物を調製し、450マイクロリットルのラベル溶液に50マイクロリットルの酵素溶液を添加して調製する。そして、光から保護してください。暗い部屋を拾い、1つの1X PBSでスライスを2回洗います。
次に、スライドを乾燥させ、TUNEL反応混合物上で乾燥させます。そして、2時間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、このスライドを1回の1倍PBSで再び洗います。
そして核カウンター染色のためのDAPIを加える。光から保護された5分間室温でインキュベート。1回1X PBSで3回リンスします。
そして、アンチフェード親水性培地でスライドを成形します。カバースリップを置きます。そして、マニキュアでシール。
蛍光顕微鏡でサンプルを可視化します。このグラフでは、0.9%の塩化ナトリウムのみを注入した対照と比較して、シスプラチンが魚の生存に対する用量応答効果を有することを確認することができる。このグラフの赤い線は、このビデオで使用されるグラム当たり120マイクログラムの線量を表しています。
これらの用量は、男性と女性に適用することができます, それらの間に統計的な違いは見つからなかったので、.フローサイトメトリーは、組織に存在する異なる細胞を定量化することを可能にする。造血細胞集団は、サイズまたは前方散乱および粒度またはサイズ散乱によっていくつかの魚の腎臓で同定される。
このようにして、赤血球、リンパ球、顆粒球、造血前駆体で集団を分離することが可能です。ここで、顆粒球、シングルトおよびMPO陽性細胞を選択する現在のゲート戦略は、骨髄ペルオキシダーゼの蛍光発現によって特徴付ける腎臓における好中球の集団を見つけることを可能にする。この場合、シスプラチンの注射は、腎臓に存在する好中球の割合の増加を誘導した。
TUNELアッセイは、蛍光顕微鏡で腎臓の組織スライドを観察することによって組織中のアポトーシス細胞を検出することを可能にし、いくつかの細胞の核内のアポトーシスシグナルを赤色で見ることができる。このようなDAPIの核染色によって対照的に、ここは青で。シスプラチン注射は、腎臓におけるアポトーシス細胞の存在を増加させ、手動でまたは画像ソフトウェアを使用して定量することができる。
このビデオの最後に、あなたは、成人シマウマの魚の急性腎臓損傷を誘発するためにシスプラチンの用量を注入し、調整する方法を知ることができるはずです.そして、異なる目的のために腎臓を解剖する方法。フローサイトメトリーは、ラボ内のトラトラベスラインの可用性に依存するさまざまな細胞タイプのプロファイルを理解するのに役立つ優れたツールです。
抗体を使用してすべての細胞タイプにラベルを付ける場合は、トランスポーターラインの色を考慮してください。TUNELアッセイは、アポトーシス細胞や組織を検出できるシンプルなツールで、顕微鏡だけでなくフローサイトメトリーでも解析できます。必ず、手順全体で個人用保護具を使用してください。
