この作品は no. グラント ドイツ研究振興協会 (DFG) からの財政支援で作成されましたPO413/12-1 とラ 1028/7-1。

<ol>
	<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-on-a-chip+developments:+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man?.">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?.</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li><li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro.">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li><li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface.">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li><li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing.">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li><li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing.">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li><li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations.">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li><li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals.">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li><li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+study+of+percutaneous+absorption+of+aluminum+from+antiperspirants+through+human+skin+in+the+Franz+diffusion+cell.">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li><li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt.">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li><li>Ng, S. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies.">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li><li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels.">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li><li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope.">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li><li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels:+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations.">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li><li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching.">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li><li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo.">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li><li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis.">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li><li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin.">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts.">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li><li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+a+focus+on+compartmentalized+microdevices.">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li><li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Three-Dimensional+Cell+Culture+to+Organs-on-Chips.">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li><li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem.">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing.">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li><li>Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput.">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).</li><li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera.">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li><li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+Diffusion+of+Polar+Molecules+Through+and+Effective+Pore+Radii+Estimate+of+Intact+and+Ethanol.">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li><li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin.">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-&#946;-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li><li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin,+the+final+frontier.">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li><li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Epidermis+Reconstructed+by+Culture:+Is+It+"Normal"?.">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?.</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li><li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent.">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li><li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line.">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li><li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions.">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li><li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+random+walk's+guide+to+anomalous+diffusion:+A+fractional+dynamics+approach.">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li></ol>

Uwe マルクスは社長や株主と逆流性食道炎リンドナー TissUse gmbh 社は、製造・建設技術を商業化会社の株主であります。他の著者は本稿の出版物に関する利益相反を宣言しません。

本研究は、組織構造の膜でエンジニア リングの透過特性を定量化する手法を説明します。Agarose のゲルを分子サイズが異なる物質の透過をテストおよび検証メソッドと対応するシミュレーション最初検討した.小さい分子浸透 (透過クロマトグラフィーによるゲル濾過の効果) を除いてマトリックス メッシュを速くことが知られています。似たような観測は、強膜26、ひと表皮膜27、人間の皮膚の17、およびラット皮膚28物質のサイズ排除実験で作られました。透水係数と対応するストークス半径 (説明、通常分子の有効な半径よりも小さい分子として同じ拡散速度を持つ移動剛体球の半径) の間の負の相関関係が示されています。26,28日と同様の関係は、分子サイズの異なる物質を用いた実験で観察されました。1/ストークス半径以上透水係数をプロットすることによって最小の分子サイズを 4 つのグループに線形相関が認められた (R2 = 0.93) (図 6)。これは提案法によるシミュレーションの透水係数は、現実的な範囲を示します。
実験では 46.15% のエラーはフランツ ・拡散セル システム10透水性実験の報告よりもやや大きい。1 つの可能な説明は、フルオレセイン-イソチオ シアン酸-デキストラン、後述のサイズ分布で可能性があります。
説明メソッドは利点フランツ拡散細胞システムを用いた方法と比較して重要であります。まず、セットアップがよりコンパクトです。実験は、商業のウェル プレート (∼ 13 cm × 8.5 cm) のスケールを持つ膜挿入システムで直接実行されます。別のフランツ ・拡散セルは各サンプルに必要なに対し、これにより、同時に実行する複数のサンプルです。第二に、栽培が行われる膜挿入皮膚モデルの透磁率を直接測定できます。フランツ ・拡散セルを使用して、サンプルにある撮影しは小さいサンプルのため手間がかかります、また時間がかかるシステムにマウントされています。
コラーゲン細胞マトリックスの透過実験セル シード システムにこのメソッドを正常に適用できることを示した。皮膚モデルにここに提示されたモデルを検証しましたただし、メソッドは、有機細胞培養、例えば腎臓や肝臓の他のタイプに適用できます。
本研究ではコラーゲン細胞モデルを用いて HaCaT 細胞が完全にモデルの表面をカバー (図 5参照)。これは、メソッドが HaCaT の層とコラーゲン細胞モデルと透水係数を区別するために十分に敏感であることを示す透水係数の削減につながった。理想的には、皮膚モデルは29の本当の皮膚の表皮に近づくと、バリアを構築する必要があります、したがって、実際に使用する前に皮膚モデルの質 (例えば真皮、表皮の建物) を検証する重要です。皮膚モデルの開発は、染色技術を可視化し、皮膚タンパク質とコラーゲン30,31,32の検出から定量化できます。透水係数は、皮膚モデルの開発を評価するための重要な要素もありますが、さらに、実験はこれを確認するために必要な。前述したように、このメソッドは、複数のサンプルを同時に実行できます。また、透磁率を測定し、それによって皮膚モデルのこのパラメーターの開発を観察する栽培中にサンプルを取ることが可能です。
それは、透磁率が同時にゲル/コラーゲン-セル-モデル、膜を通して測定されること注意してください。検出された透水係数は、システム固有という異なる皮膚モデルの結果のみ比較できます同じ膜挿入を使用する場合です。さらに、皮膚モデルは、モデルを介してのみ被験物質に浸透し、それに隣接していないと誘導するエラー測定透水性を確保するために全体の栽培面積をカバーする必要があります。今後の実験で考慮するべきもう一つの側面は、皮膚を取り巻く自然環境です。通常、皮膚表面の温度は透過条件に影響を与えることができます内側の地域と比較して低いです。
計算機シミュレーションと実験を配置するために応用シミュレーションにおけるパラメーター最適化を可能にする方法が発表されました。シミュレーションは、分子サイズの小さい物質の実験データとよく一致するように発見されました。ただし、シミュレーションと実験データの偏差は分子サイズの大きな物質の観察されました。大規模な多糖類分子は、摩擦を高めるし、ゲル内拡散プロセスを遅くできます。この効果により、実験間の偏差の原因である異常拡散とシミュレーション値33,34。別の説明は、フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの小さいまたは大きい粒子の存在可能性があります。メーカーは、特定の範囲に存在するより小さくより大きい粒子を可能にすると平均サイズとして物質の分子量を指定します。ないもどれほど分散してこれらの物質は、小さい粒子浸透ゲルと流体チャネルを介してより速くです。これらの拡散と摩擦の影響を考慮するシミュレーションを拡張することが可能です。
透過性実験とシミュレーション 2 OC で使用するため開発されました。シミュレーションの助けを借りて、この実験法より洗練された実験的設定に直接転送することができます。たとえば、膜挿入システム シミュレーションは、2 OC のジオメトリまたは同様のセットアップで他のシステムに簡単に転送できます。今後の実験の設計をサポートする変調シミュレーションのこのオプションを使用できます。また、蒸発、異常拡散膜効果などの副作用は、シミュレーションの精度を向上させる統合できます。シミュレーション プログラムは、変更または皮膚モデルの開発の他の側面を調査するために他の物理モジュールを統合するシミュレーション式を改良する機会を与えます。1 つの例は、コラーゲン細胞モデルにおけるブドウ糖の消費量と乳酸の生産のシミュレーションです。
特に興味深い医療物質のテストでは、チップ上の器官システムで物質を分散する方法です。私の助けに答える質問物質がシステムに浸透する速さなどシミュレーションと透磁率のパラメーター多 organ チップで他の組織の濃度になりますだけでなく。このメソッドは、サポートし、そのような器官のオンチップ システムを開発およびテストを強化できます。

オルガノ典型的な 3 D 培養医薬品開発とテスト1の物質の強力なツールとなっています。この点で、ヒト皮膚モデルなど、化粧品業界の規制要件により特別な関心です。彼らはその後として独自の単一器官培養ウェル プレート、または追加臓器モデル、例えば、肝2との組み合わせで多 organ チップのいずれかの使用のための多数の 3 D 皮膚モデルの開発につながっています。
肌と同等の栽培に関して気液界面 (ALI) は、適切な表皮分化3の重要な要素です。下部に液体透過性膜で容器から成る細胞文化挿入は、アリを確立する通常使用されます。ALIs は、12 ウェル (径 12.2 mm) まで表皮4Phenion5Episkin6、96 ウェル (4.26 直径 mm) からサイズの皮膚モデルの文化など市販の皮膚モデルに広く使用されています。ここで説明したメソッドは、膜挿入における物質の透過を決定します。
透水係数、培養皮膚モデルは、ネイティブの皮膚5と比較しての品質を評価する重要なパラメーターであるし、どのように迅速に評価するために使用される活性物質が皮膚を通して移行します。薬や化粧品の製品は、皮膚に適用する必要があります、特に場合は、このパラメーターは正確に活性剤がそれを通過するときに理解しておく必要。シミュレーション システムの挙動を予測し、必要な時間のかかる実験努力を減らすに助けることができるさらに、物質が関与している大口の場合は特に。
フランツ ・拡散セルは、透過実験皮膚および皮膚モデル5,6,7,8,9に芸術の状態です。このデバイスは、固定サンプル (拡散障壁) と 2 つのコンパートメントの間で構成されます。テストする物質がサンプル (ドナー コンパートメント) の上部に直接適用され、反対 (受容体) のコンパートメントに浸透の化合物の濃度を検出できます。アクセプタ側では、一定の温度と同種の物質濃度は温度チャンバー、マグネチックスターラーを保障されます。サンプルは、アクセプタ側でフランツ ・ セルのサンプリング アームから撮影することができます。179 cm と 19 cm の高さ範囲でこのシステムは比較的大きい10,11です。ゲル状物質や組織の拡散係数測定のための別の方法は、縛る。この手法の原理を使用漂白蛍光粒子ゲルと、漂白の領域の回復時間を決定するラベルの付いた拡散係数12,13,14を計算します。
さらに、皮膚15,16物質の浸透過程を決定するために、赤外光の吸光度と粒子の動きを検出するフーリエ変換赤外線 (FTIR) 分光法を使用できます。ただし、これらやその他のイメージングの方法 (例えば、2 光子蛍光相関分光法17) 集中的な楽器の費用必要があります。
この記事で手法を提案直接測定する膜挿入システム内の障壁の透過性皮膚モデルが栽培することができます。このメソッドは、小さなサンプル (よく 4.26 mm までサイズ) の数が多いとコンパクトなシステムで実行される透過性実験できます。これはフランツ ・拡散セル、別のデバイスが、デバイスにマウントするには、それぞれのプローブが必要し、小さなサンプル (4.26 mm サイズ) を実現することは困難ですのとは対照的です。さらに、メソッドは、主要なインストルメンテーション (例えば、共焦点または多光子顕微鏡) を必要としない、時間とコストの削減が達成されました。
多孔膜の実験を行ったすべては agarose のゲルまたは膜上確立されたコラーゲン細胞モデルから成るシステム サンプル (バリア) を挿入します。分子サイズが異なる蛍光物質 (ドナー) は、サンプルの上部に適用され、蛍光プレート リーダーを使用して下部 (受容体) に浸透物質の濃度が検出されました (図 1参照)。メソッドを検証し、このシミュレーションの精度をテストするために agarose のゲルが生成され、障壁として使用します。ヒドロゲルは、一般的に生物科学13多孔質媒質中の拡散と浸透のプロセスの調査のために使用されます。簡略化された皮膚モデル18,19 である一次繊維芽細胞とひと成人低カルシウム高温ケラチノ サイト (HaCaT) 細胞 (細胞マトリックス モデル)、コラーゲン マトリックスから成るセル シード システムの試験方法.
さらに、浸透プロセス フロー数値流体力学シミュレーションによるシミュレートしました。パラメーター最適化による拡散係数が実験データから計算することが分かった。一般に、このシミュレーションは、異なるアプリケーションを提供しています例えば、短い実験に基づく透過過程を予測することが可能だし、シミュレーションが実験の数を大幅に削減できます。
具体的には、2 ・ オルガン ・ チップ (2 OC) が開発市販1,22、実験とシミュレーションがオルガン オンチップ システム1,20,21にアプリケーションの設計されていた 23,24,25。原則として、膜挿入システムに基づく任意の臓器モデルの浸透プロセスはこの方法で記述することができます。

<table width="883">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:236px;height:20px;">Agarose</td>
			<td style="width:248px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:112px;">K297.2</td>
			<td style="width:287px;">High Resolution Powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagen&#160;</td>
			<td>Serva</td>
			<td>47256.01</td>
			<td>Collagen R solution 0.4 %</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td>
			<td>880010-12</td>
			<td>High Glucose with L-Glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>S0615 0114F</td>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46960-25G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46944-500MG</td>
			<td>4000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD10S-250MG</td>
			<td>10 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD20S-250MG</td>
			<td>20 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein Isothiocyanate-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>FD40S-250MG</td>
			<td>40 000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>no calcium, no magnesium , with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06467.9010</td>
			<td>granulated</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912-014</td>
			<td>tablets</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3391</td>
			<td>96 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transwell Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>734-1563</td>
			<td>12 well, 0.4 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Biochrom GmbH</td>
			<td>L2143</td>
			<td>with EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for determination and simulation of permeability and diffusion in a 3d tissue model in a membrane insert system for multi-well plates

皮膚モデルの in vitro栽培ますます関連、製薬および化粧品用となっている物質のテストし同様、医薬品の開発にも使われて.これらのモデルは主に不可欠な要因別の物質への透過性の膜挿入システムで耕されます。通常、これらのパラメーターを決定するための応用法は、通常大規模なサンプル サイズ (例えば、フランツ ・拡散セル) または骨の折れる機器 (例えば、(FRAP) 退色後蛍光回復) が必要です。本研究は 4.26 〜 12.2 mm (栽培面積) の直径サイズの膜挿入システムに直接透水係数を決定する方法を示します。メソッドは、アガロース、コラーゲン ・ ゲル、皮膚モデルを表すコラーゲン細胞モデルと検証されました。さまざまな分子サイズと異なる細胞モデル (HaCaT、線維芽細胞は、コラーゲン ・ ゲルから成る) の透過特性を持つ物質の浸透プロセスは、正確に記述されていた。
また、上記の実験的方法をサポートするため、シミュレーションが設立されました。ストークス半径 m 14 × 10-10に分子サイズが小さい物質についても実験データにフィットまでシミュレーション (4,000 MW)、されるため、システムを記述するための有望なツール。また、シミュレーション実験努力をかなり減らすことができます、拡張またはより複雑なセットアップに適合する十分な堅牢です。

シミュレーションの精度を評価するために障壁を行った 96 ウェル膜透過実験 2% アガロースゲル システムを挿入します。フルオレセイン ナトリウム塩 (NaFl) とフルオレセイン イソチオ シアン酸メンブラン (FD) は、45 × 10-10 m ストークス半径 (376.27 40,000 mol wt) を 5 × 10-10 m から拡散物質の分子の大きさの影響を確認する使用されました。シミュレーションのネイティブのパラメーター最適化シミュレーションを実験データに合うように使用されました。
そのために、シミュレートされた透磁率の線形部分だけの斜面は実験結果と比較しました。小さい分子サイズのシミュレーションと実験データよく一致した NaFl の 99.2% と FD 4,000 80.2% (図 4 aと4 b を図参照)。大きな分子サイズには、FD の 10,000 の 50.5%、FD 20,000 の 79.7%、FD 40,000 53.6% の相関を示す高い偏差が生成されます。シミュレーションでカーブ進行を示した (図 4 c-4e参照) グラフの一層のコースの強力な上昇そして初めに遅延。
透水係数とシミュレートされた拡散係数が表示されます表 4.透過係数は分子サイズの増加と共に減少します。標準偏差は 10-8 m/s × 0.47 0.08 × 10-8 m/s とあった (N = 7)、4.18% 46.15% の間の絶対的な誤差に対応しました。大きい分子の実験は誤差の絶対値の大きいを示した。シミュレートされた拡散係数は実験的透水係数に非常に同じように振る舞った。大きなストークス半径をもつ物質減少の拡散係数と 9.09%、18.46% の間であった絶対誤差を示した (N = 3)。
追加透過実験 12 ウェルの膜でバリア挿入システム、4 つの異なるコラーゲン細胞モデル タイプが使用されました。これらのモデルは、携帯無料モデルと表面にコラーゲン ・ ゲルと HaCaT 主線維芽細胞の異なる組み合わせで細胞モデルを構成します。次の組み合わせが使用された: 携帯無料モデル コラーゲン + 線維芽細胞 (大佐 + f.) として (大佐) コラーゲン コラーゲン HaCaT (大佐 + h.) やコラーゲン + 線維芽細胞 + HaCaT (大佐 + F. + 時間)。フルオレセイン ナトリウム塩 DMEM + 10 %fcs とは、ドナーの物質として使用されました。イメージのヘマトキシリンとエオシン (HE) 染色コラーゲン細胞モデルの解析が使用されました。この染色を行ったメーカーのプロトコルを使用しています。図 5代表的な大佐 + F. + H. モデルが付いているそのような汚れが表示されます。彼は、コラーゲン マトリックスの組織構造を若干汚れ。マトリックスで、繊維芽細胞がある、濃い紫の線維芽細胞と細胞の核が染色します。コラーゲン マトリックス上に HaCaTs は、モデルの上にそれを囲む層を構築の核となるべき多くの核を含む層があります。
テーブル 5、実験的透過係数とシミュレートされた拡散係数が記載されています。HaCaT なしモデルと比較してより低い浸透・拡散係数を有する HaCaT、モデルのほとんどのための傾向を見ることができます。透過係数の絶対誤差は 10.9 24.4% との拡散係数 5.2% 12.9%。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg"> 図 1: 膜透過性実験の側面がシステムを挿入します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg"> 図 2: 透過性実験の模範的なグラフ。受容体の濃度は、時間をかけて印刷されます。2 本の破線は、ほぼ線形グラフ部をブラケットします。直線部分の傾きは、透水係数を決定するために使用されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg"> 図 3: ジオメトリおよびメッシュ膜のシミュレーション システムを挿入します。(、) 96 ウェル膜のジオメトリの挿入システム。12 ウェル膜の幾何学 (b) 挿入システム。(c) 96 ウェル膜のメッシュ挿入システム。(d) 12 ウェル膜のメッシュ挿入システム。(e) 断面と膜のパラメーター挿入システム。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg"> 図 4: 透過実験から最適化シミュレーションの実験データの比較します。(e) 40,000 モル重量、(d) 20,000 モル重量 10,000 (c) mol の重量 (b) フルオレセイン イソチオ シアン酸デキストラン 4,000 モル重量 (、) フルオレセイン ナトリウム塩<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg"> 図 5: 代表者彼のコラーゲン細胞モデル (コラーゲン + 線維芽細胞 + HaCaT) 染色します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg"> 図 6: 96 ウェル膜でフルオレセイン ナトリウム塩とフルオレセイン イソチオ シアン酸デキストランの使用 1/ストークス半径の関数としての透水係数は、システムを挿入します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>Mm 96 よくシステムの表現</td>
			<td>12 ウェル用 mm で発現</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_tran</td>
			<td>5.65 [mm]</td>
			<td>14.7 [mm]</td>
			<td>井戸の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_a</td>
			<td>4.26 [mm]</td>
			<td>12.1 [mm]</td>
			<td>膜の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>d_w</td>
			<td>8.79 [mm]</td>
			<td>21.97 [mm]</td>
			<td>受容体の直径</td>
		</tr>
<tr>
<td>ホブ</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>障壁の高さ</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>距離間も上下</td>
		</tr>
<tr>
<td>h_a</td>
			<td>4.73 [mm]</td>
			<td>5.24 [mm]</td>
			<td>受容体の高</td>
		</tr>
<tr>
<td>b</td>
			<td>硬度/2</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬深さ</td>
		</tr>
<tr>
<td>r</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬ボール+の半径
</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘイズ</td>
			<td>r + 硬度</td>
			<td>-</td>
			<td>浸漬ボール+の z 位置
</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1:「化学種輸送」シミュレーションの幾何学パラメーター 。+アガロースのシミュレーション用にのみ 96 よく膜のゲルはシステムを挿入します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>式</td>
			<td>値</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_fl</td>
			<td>0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol]</td>
			<td>0.26576 mol/m2
</td>
			<td>Fl.So の濃度です。</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_4 植物</td>
			<td>2 [mg/ml]/4000 [g/mol]</td>
			<td>0.5 mol/m 2</td>
			<td>FD 4.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml]/10000 [g/mol]</td>
			<td>0.2 mol/m 2</td>
			<td>FD 10.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml]/[g/mol] 20000</td>
			<td>0.1 mol/m 2</td>
			<td>FD 20.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml]/[g/mol] 40000</td>
			<td>0.05 mol/m 2</td>
			<td>FD 40.000 の濃度</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m ^2/s]</td>
			<td>1E-9 m2/s</td>
			<td>混合水の拡散係数</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:「化学種輸送」シミュレーションの物理パラメーター。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>名</td>
			<td>式</td>
			<td>説明</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>アクセプタ濃度の定義</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>D_search * 1e 10</td>
			<td>D のためのフォームファクターの変更</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 3:「最適化」シミュレーションのパラメーター。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>浸透</td>
			<td>透水係数 (m/s) 10-8 x</td>
			<td>拡散係数 (m/s2) x 10-10</td>
			<td>透過 (m) x 10 の-10のストークス半径</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fl.So。</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 4,000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD10, 000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 20,000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>FD 40,000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: 別のストークス半径 2% アガロースゲル + 96 ウェル膜の膜を介して物質の透磁率と拡散係数システムを挿入します。(フルオレセイン ナトリウム塩階そう、fitc デキストランを = = FD)。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>モデル</td>
			<td>透水係数 (m/s) 10-8 x</td>
			<td>拡散係数 (m/s2) x 10-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + F。</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + H。</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
<tr>
<td>大佐 + F. + H。</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 5: 12 でコラーゲン細胞モデルによるフルオレセイン ナトリウムの透磁率と拡散係数-よく膜挿入システム (大佐 = コラーゲン、f. h. 線維芽細胞を = = HaCaT).

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates at JoVE.com

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.0K ビュー.  Hamburg University of Technology. 膜の透磁率の定量方法挿入ウェル プレート用システム、インシリコパラメーターの最適化シミュレーションを用いた拡散係数の計算が表示されます。

ビデオ: A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

タンパク質分解的に分解性3次元システムにおける卵胞のカプセル化と文化のための方法

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

生物工学

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

タンパク質、細胞閉じ込めのための二次元加工基板を作成する

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture systems, which inadequately reflect physiological conditions in vivo. Biological 3D matrices provide cells an environment in which cells can self-organize, allowing the study of tissue organization and cell differentiation. Such scaffolds can be seeded with a mixture of different cell types to study direct 3D cell-cell-interactions. To mimic the 3D complexity of cancer tumors, our group has developed a 3D in vitro tumor test system.	
	Our 3D tissue test system models the in vivo situation of malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which we established with our decellularized porcine jejunal segment derived biological vascularized scaffold (BioVaSc). In our model, we reseeded a modified BioVaSc matrix with primary fibroblasts, microvascular endothelial cells (mvECs) and the S462 tumor cell line. For static culture, the vascular structure of the BioVaSc is removed and the remaining scaffold is cut open on one side (Small Intestinal Submucosa SIS-Muc). The resulting matrix is then fixed between two metal rings (cell crowns).	
	Another option is to culture the cell-seeded SIS-Muc in a flow bioreactor system that exposes the cells to shear stress. Here, the bioreactor is connected to a peristaltic pump in a self-constructed incubator. A computer regulates the arterial oxygen and nutrient supply via parameters such as blood pressure, temperature, and flow rate. This setup allows for a dynamic culture with either pressure-regulated pulsatile or constant flow.	
	In this study, we could successfully establish both a static and dynamic 3D culture system for MPNSTs. The ability to model cancer tumors in a more natural 3D environment will enable the discovery, testing, and validation of future pharmaceuticals in a human-like model.

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Methods to create human 3D tumor tissues as test systems are described. These technologies are based on a decellularized Biological Vascularized Scaffold (BioVaSc), primary human cells and a tumor cell line, which can be cultured under static as well as under dynamic conditions in a flow bioreactor.

人間の3次元の組織工学<em&gt; in vitroで</em&gt;腫瘍テストシステム

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

の体系的な分析<em&gt;体外</emマルチウェルプレートマイクロ流体システムを使用して&gt;セルローリング

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

操作された複合三次元組織<em&gt;インビトロ</em&gt; /<em&gt;インシリコ</em具体的な突然変異背景に薬物の有効性を予測するための&gt;肺腫瘍モデル

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

ウェル プレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法

ウェルプレート用システムを挿入測定および透過性と膜の 3次元組織モデルにおける拡散のシミュレーションの方法