Name: assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
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この作品は、ロズウェルパークがん研究所に研究所アレルギー感染症のグラントR01AI079253（BHS）は、国立がん研究所がんセンターによる支援助成CA016056によってサポートされていました。

本研究では、動物で実行されたすべての手順は、ロズウェルパークがん研究所で動物実験委員会によって承認され、すべての状態を遵守し、連邦政府及び保健規則の国立研究所れた。 1。 インビボマクロファージのラベリング注：PHK26（iv）は、静脈内投与された場合、循環中および組織中の両方食細胞によって取り込まれる親油性染料である。 PKH26は、マクロファージの収穫後の操作量を最小限にするためにin vivo標識のために使用した。 PKH-26を安定して長期間にわたって肺胞マクロファージに蓄積するという利点を有する。行政だけ肺胞マクロファージを安定PKH26 8、9で標識したまま循環からすべての標識細胞の排除を可能にした後10日を待っています。 PKH26は、互換性の励起（551 nm）を照射（567 nm）の特性を持つ赤の蛍光色素であるローダミンまたはフィコエリス検出システムと。いずれの標識操作は、生存率の低下を含め、アーティファクトを導入することができます。我々は（NADPHオキシダーゼ欠損対例えば 、WT）異なるマウスの遺伝子型におけるマクロファージの標識に同じアプローチを使用するので、これらのアーチファクトの影響は均一になります。 <ol><li> PKH26の原液（エタノール中1×10 -3 M）メーカーが提供する希釈剤Cの1:5に希釈する。 </li><li>各マウス1/2ミリリットルのインスリンシリンジ（29 G×1/2 &quot;）に希釈したPKH26の負荷を100μl。 </li><li>収穫するには、少なくとも10日前までに静脈内注射（尾静脈または眼窩のいずれか）によりマウスに投与する。 </li></ol>気管支肺胞洗浄による2。収穫肺胞マクロファージ（BAL） 実験に使用するマウスの数は変えることができる。刺激されていないマウスからの典型的な収率は1〜2×10 5肺胞マクロファージの範囲であるが、この数は大幅に浅を変えることができこのようなマウスのサイズ、洗浄を行った人の経験、洗浄液や肺から引き出されたボリュームの点滴の数などの要因に編このプロトコルでは肺洗浄を繰り返した1mlの洗浄液と共に細胞収率を高めるために役立つ閉鎖胸腔を用いて行われる。 <ol><li>滅菌溶液を維持するために、無菌状態を使用してアベルチン麻酔薬の致死量（12.5 mg）を腹腔内（IP）を投与することにより、マウスを安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールで徹底的にマウスをスプレーします。 </li><li>胸部を露出させた動物の頭蓋終わり（ 図1A）から肌を削除します。 <ol><li>ただ、ダイヤフラムの下の皮膚の小さなカットを行います。 </li><li>カットに指を挿入し、離れて動物（ 図1A）の頭蓋端から肌を引き出します。 </li><li>首（ 図1A）の腹側を拡張し、頭の上にわずかに押し上げます。 </li></ol></li><li>胸郭を通して小さな穴をカット胸部の右側に肺を収縮させると、次のステップの間に、肺の可視化を可能にする。 </li><li>気管を見つけて、慎重に周囲の組織を離れて解剖。 <ol><li>湾曲したピンセットで唾液腺、胸骨舌骨筋および喉頭などを削除します。 </li><li>慎重に湾曲したピンセットで持ち上げて、ハサミで基盤となる環状軟骨構造を明らかにし、気管（外膜）を覆う薄い組織を切り取る。 </li></ol></li><li>気管にカテーテルを挿入します。 <ol><li>湾曲したピンセットを用いて、気管（背側に）背後に縫合糸を配置し、開口部を通って10cmの長さを引き出します。 </li><li>輪状（軟骨の肥厚したリング）上に起動すると、慎重に気管が胸骨の後ろに消え気管停止まで22のGカテーテルを導く。 </li><li>しっかりとぴったりフィットするため、気管およびカテーテルの周りに縫合糸を結ぶ。カテーテルから針を外します。 </li></ol></li><li> 4方活栓を組み立てます。 <ol><li>埋めるオン6 mlのDPBS、1％FBSでシリンジ及び図1Bに示すように、4方コックに取り付けられる。 </li><li> 4方コック（ 図1B）に示される位置に空の6ミリリットルの注射器を取り付けます。 </li><li>カテーテル4方コック（ 図1B）上で開いているポートを接続します。気管からカテーテルを取り除くしないように注意してください。 </li></ol></li><li>肺から洗浄液を収集します。 注：研究者は、組織への損傷の可能性を最小限にする洗浄液の低いボリュームを使用することを選ぶことができる。それは、同じアプローチが一貫してすべてのマウスのグループに適用されることが重要である。 <ol><li>空のシリンジが閉じているので、ストップコックのハンドルを回して、 ゆっくりと肺を膨らませるために〜1ミリリットルのDPBS、1％FBSを注入します。ステップ2.4​​の穴のカットを通じて肺インフレを観察します。 </li><li>肺をover​​inflateないように注意してください。 </li><li>フルシリンジが閉じているように、ストップコックのハンドルを回して、慎重にインフルエンザを撤回<html>肺からのID。 </li><li>肺はステップ1.4の穴のカットを通じて収縮を観察。カテーテルは、良いドローを得るために、わずかに前後に移動させる必要があります。気管内カテーテルを維持するために、特別な予防措置をとる。 </li><li>すべてのDPBS、1％FBSを肺から注入され、撤回されるまで繰り返します2.8.1-2.8.4 5-6Xを繰り返します。注：肺液の回収が注入される流体の100パーセントではありません。 </li></ol></li><li>を50mlコニカルチューブに洗浄液を持つ空のシリンジ。室温で細胞を維持する。 </li><li>室温で5分間、300×gで遠心分離して細胞をペレットにし、上清を捨てる。所望の場合、これは、サイトカイン分析のために保存することができる。 </li><li> 10％FBSを1〜5ミリリットルRPMI1640中で細胞を再懸濁し、血球計数器でカウントされます。刺激されていないマウスでは、BALによって採取された細胞の&gt; 95％が細胞学によって確認することができるマクロファージであることが期待される。 </li></ol> 3。培養および収穫菌&gt; アスペルギルスフミがライフサイクルの全段階を通して、GFPを発現し、このプロトコルで使用される&quot;：胞子、germlingsと菌糸この菌株は、博士のマーゴ·ムーア、サイモンフレーザー大学、バーナビー、BC州、カナダから提供された。 <ol><li>クロラムフェニコール（0.05グラム/ L）およびゲンタマイシン（0.5 g / L）とを有する斜面寒天サブローブレインハートインフュージョン（BHI）上にGFPを発現するアスペルギルス·フミガタス株の分生子板。 </li><li>緩く室温で7〜10日間頂いた暗闇の中でインキュベートする。 </li><li> DPBS中0.01％のTween20を10mlで洗浄傾斜による収穫生子。軽く緩めstripetteで真菌をこすり。収率を高めるために傾斜を数回すすいでください。 </li><li> 50ミリリットルコニカルに100μmのセルストレーナーを通して生子懸濁物を渡す。 </li><li> 10分間400×gで遠心分離してペレット生子。 </li><li> 50ミリリットルのDPBSに再懸濁分生子と血球計数器を用いてカウントします。 </li><li> DPBSで二回洗浄し、希望concenに希釈するtration。 </li></ol> 4。真菌チャレンジおよび共焦点顕微鏡宿主防御におけるマクロファージNADPHオキシダーゼの役割を調査するために、貪食アスペルギルス胞子の成長を制御するための3つの遺伝子型のマウスからの単離された肺胞マクロファージの能力を評価した。本研究で用いた遺伝子型が含まれる。 / 1）は、野生型マウスは、2）NCF1 * / *マンガンマウス自然発生NCF1変異を有する（NCF1は彼らにNADPHオキシダーゼ欠損を残しP47のphoxの 、食細胞NADPHオキシダーゼの必須コンポーネント）をコードし、3）NCF1 * NADPHオキシダーゼ活性は、単球/マクロファージ集団10,11で再構成された*のMn +トランスジェニックマウス（MNは、ヒトCD68プロモーターの制御下で野生型NCF1を保有するトランスジーンを示す）。 共焦点顕微鏡は、存在のために、このアッセイに最適ですそして、スライド上の非貪食分生子の成長。共焦点顕微鏡は、Z軸内の個々の面の可視化を可能にし、周囲に成長しているのではなく、マクロファージ内部の菌との区別が可能になります。すべての共焦点画像を、63X油浸対物レンズを用いて取得される。 Zスタックは、2.5の電子ズーム倍率で取得されています。 Zスタックの厚さは、視野の上部と下部を見つけるためにDAPIおよび明視野画像を用いて決定される。 Zスタックは、〜1μmの厚さの個々のスライスを14から24ミクロンの範囲であった。マクロファージの定量化のために、1X電子ズームの単一スキャンは遺伝子型につき10視野で行った。無傷のマクロファージはそれぞれPKH26および膜および核のDAPI染色に基づいて同定した。分生子は、FITC発現と明視野像に基づいて同定した。 <ol><li>無菌カバーグラス、プレートを準備します<ol><li>生物学的安全キャビネットの下で、70％のエタノで22×22ミリメートルのカバーガラスを浸す5〜10分間リットル。 </li><li>滅菌PBSでカバーグラスをすすぐ。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、穏やかに無菌充填単独で6ウェルプレートの各ウェルの底に単一のカバースリップを置く。 </li></ol></li><li>シード〜1×10 6個の収穫PKH26は、各カバースリップ上に300μlのRPMI 1640、10％FBSに懸濁し、肺胞マクロファージを標識した。正確な数は、収穫量に応じて変えることができる。 </li><li>マクロファージは、一晩で5％CO 2、37℃でインキュベートすることにより接着させる。 </li><li>翌朝、〜1×10 7 GFP発現Aを追加フミガーツス分生子を100μlの予め温めた（37℃）RPMI 1640、10％FBSに懸濁した。 </li><li> 5％CO 2で37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li><li>細胞を室温で2時間、最低固定または4℃で一晩されるべきである3,7、および14時間の修正セルの各ウェル（最終濃度1％ホルムアルデヒド）、2％ホルムアルデヒドの等容量を添加することによって。ための場所プレート一晩4℃での初期の時点。最終時点（14時間）の場合は、2時間室温で細胞を固定。 </li><li>固定後、静かにピンセットを用いてカバースリップを削除し、DPBSですすぐ。 </li><li>折り畳まれたキムワイプにカバースリップの端を配置することで余分な水分を取り除きます。 </li><li>ガラス顕微鏡スライドにDAPIで6μlの蛍光封入剤を適用します。 </li><li>スライドにカバーガラスの一端を置き、ゆっくりと封入剤に分解セル側にドロップします。メディアをマウントすると、拡散し、カバーグラスの下に均一な層を形成することになる。カバースリップ上に押す必要がない。 </li><li>明確なマニキュアでカバースリップの端をシールし、空気乾燥させ。 </li><li>ストアは、共焦点顕微鏡によって分析することができる状態になるまで、室温で（遮光して）スライドボックススライドを用意しました。 </li></ol>

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	<li>Reeves, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+activity+of+neutrophils+is+mediated+through+activation+of+proteases+by+K++flux.">Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux.</a> Nature. 416, 291-297 (2002).</li><li>Bianchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoration+of+NET+formation+by+gene+therapy+in+CGD+controls+aspergillosis.">Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis.</a> Blood. 114, 2619-2622 (2009).</li><li>Vethanayagam, R. 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Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes.</a> J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).</li><li>Philippe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+of+Aspergillus+fumigatus+by+alveolar+macrophages+is+mediated+by+reactive+oxidant+intermediates.">Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates.</a> Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).</li><li>Cornish, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+use+of+CARD9+by+dectin-1+in+macrophages+and+dendritic+cells.">Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells.</a> J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

一緒にin vivoで真菌のチャレンジでマクロファージの抗真菌活性のex vivo分析のためにこのアプローチを使用して、我々は以前に、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼはA.に対する防御において重要な役割を果たしていることが実証されフミ4。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例?...

肺胞マクロファージは、吸入微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージは、病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し摂取および吸入胞子（分生子）の成長を制限し、炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、スーパーオキシドアニオンおよび下流の活性酸素中間体（ROIを）への分子状酸素に変換します。慢性肉芽腫症（CGD）は、重度の細菌および真菌感染により、過度の炎症反応によって特徴づけられるNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。以前の研究では好中球が主に菌糸のステージ5をターゲットに対し、肺胞マクロファージは、 アスペルギルス胞子を摂取し、殺すことが示されている。しかし、矛盾するresulがあったA.の成長を制御するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの役割としてのts フミ胞子 6、7。 このメソッドの目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ胞子 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。最も密接に吸入菌類に対する宿主応答をモデル化するために、我々はすぐに犠牲を次の刺激されていないマウスから気管支肺胞洗浄により収穫肺胞マクロファージを使用していました。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例えば 、好中球を募集）が存在しない場合に、その抗真菌活性に焦点を当てることができました。この方法では、肺胞マクロファージは、収穫後の操作の量を最小にするように収穫する前にインビボで染色した。&lt;/ pの&gt; この議定書のもう一つの利点は、GFPを発現するAの使用でフミ株 。この菌は菌糸のステージを通じて生子段階からのGFPを発現し、さらに染色の必要がありません。さらに詳細な画像を得るために、我々は得られた画像から3次元構造の再構築を可能にし、共焦点顕微鏡を選びました。三次元再構成は、菌糸がマクロファージやを通じて周囲に成長しているのではなく、区別できるようになります。分生子はまた、細胞外に対する細胞内のように正確に区別することができる。

<table><tbody><tr><td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Used to make AvertinAnesthetic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>Used to make ACK red cell lysis buffer</td></tr><tr><td>22 G x 1.00 inch i.v. catheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Syringes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-way stopcock</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Suture thread</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml conical centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze sponges (4 inch square)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with L-glutamine</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>heat inactivated</td></tr><tr><td>Hema 3 Stain Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aspergillus fumigatous&lt;/em&gt; strain expressing green fluorescent protein</td><td></td><td></td><td>provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet Class II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 light microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>37 &amp;deg;C, 5%&amp;nbsp; CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>22 x 22 mm micro cover glass</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>glass coverslips</td></tr><tr><td>6-well Cell culture plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 system with a laser point scanner</td><td></td><td></td><td>Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope</td></tr></tbody></table>

assessing anti-fungal activity of isolated alveolar macrophages by confocal microscopy

肺は、宿主細胞は日常的に微生物および微生物産物に曝露されるインターフェースである。肺胞マクロファージは、吸入真菌および他の微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージおよび他の免疫細胞が病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し、下流の炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、活性酸素中間体（ROIを）を生成し、宿主防御のために重要である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。本研究の目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。ここでは、マウスαの能力を評価するための方法を記載貪食アスペルギルス胞子 （分生子）の成長を制御するためlveolarマクロファージ（AM）。肺胞マクロファージは、 インビボで染色し、10日後に気管支肺胞洗浄（BAL）マウスから単離される。マクロファージは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するA.を播種し、次いで、カバーガラス上に播種するフミ胞子 。特定の時間に、細胞を固定し、貪食された胞子を有する無傷マクロファージの数を、共焦点顕微鏡法によって評価される。

<html>刺激されていないマウスからBALによる肺胞マクロファージの収集は、細胞診に基づいて&gt; 95％純粋な集団になります。 3と7時（ 図2）の時点では、真菌増殖の菌糸段階に先行し、遺伝子型間生子の貪食効率の比較を可能にします。遺伝子型は、組織浸潤性菌糸のステージ（ 図3）に貪食された分生子の転移を阻害する能力に関して比較することができる場合に14?...

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Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K ビュー.  Roswell Park Cancer Institute. 共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。 

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Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

生物工学

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

免疫・感染学

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング<em&gt; A。フミガーツス</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. The 4T1 cells expressing GFP in combination with imaging and confocal microscopy are used to monitor tumor growth, track metastasizing tumor cells, and quantify the metastatic burden. These approaches are supplemented by digital histopathology that allows the automated and unbiased quantification of metastases. In this method the routinely prepared histological lung sections, which are stained with hematoxylin and eosin, are scanned and converted to the digital slides that are then analyzed by the self-trained pattern recognition software. In addition, we describe the flow cytometry approaches with the use of multiple cell surface markers to identify alveolar macrophages in the lungs. To determine impact of alveolar macrophages on metastases and antitumor immunity these cells are depleted with the clodronate-containing liposomes administrated intranasally to tumor-bearing mice. This approach leads to the specific and efficient depletion of this cell population as confirmed by flow cytometry. Tumor volumes and lung metastases are evaluated in mice depleted of alveolar macrophages, to determine the role of these cells in the metastatic progression of breast cancer.

Here we describe the model and approach to study functions of pulmonary alveolar macrophages in cancer metastasis. To demonstrate the role of these cells in metastasis, the syngeneic (4T1) model of breast cancer in conjunction with the depletion of alveolar macrophage with clodronate liposomes was used.

乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

This paper describes the application of the syngeneic model of breast cancer (4T1) to the studies on a role of pulmonary alveolar macrophages in cancer ...

医学

In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce pulmonary inflammation, but little is known regarding how exposure alters processes important to the resolution of inflammation. Efferocytosis is a resolution process, whereby macrophages phagocytize apoptotic cells. The purpose of this protocol is to measure alveolar macrophage efferocytosis following O3-induced lung injury and inflammation. Several methods have been described for measuring efferocytosis; however, most require ex vivo manipulations. Described in detail here is a protocol to measure in vivo alveolar macrophage efferocytosis 24 h after O3 exposure, which avoids ex vivo manipulation of macrophages and serves as a simple technique that can be used to accurately represent perturbations in this resolution process. The protocol is a technically non-intensive and relatively inexpensive method that involves whole-body O3 inhalation followed by oropharyngeal aspiration of apoptotic cells (i.e., Jurkat T cells) while under general anesthesia. Alveolar macrophage efferocytosis is then measured by light microscopy evaluation of macrophages collected from bronchoalveolar (BAL) lavage. Efferocytosis is finally measured by calculating an efferocytic index. Collectively, the outlined methods quantify efferocytic activity in the lung in vivo while also serving to analyze the negative health effects of O3 or other inhaled insults.

This manuscript describes a protocol for determining whether exposure to ozone, a criteria air pollutant, impairs alveolar macrophage efferocytosis in vivo. This protocol utilizes commonly used reagents and techniques and can be adapted to multiple models of pulmonary injury to determine effects on alveolar macrophage efferocytosis.

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

Ozone (O3) is a criteria air pollutant that exacerbates and increases the incidence of chronic pulmonary diseases. O3 exposure is known to induce ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

マクロファージの真菌クリアランス効率

Viability Assay of Trichoderma stromaticum Conidia Inside Human Peripheral Blood Mononuclear-Derived Macrophages

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial phagocytosis is a key process that allows for the investigation of the cytoplasmic and molecular events involved in macrophage-pathogen interactions, as well as for the determination of the time of death of internalized conidia. The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The evasion of phagocytosis and escape of phagosomes are mechanisms of fungal virulence. Here, we report the methods that can be used for the analysis of the phagocytosis, clearance, and viability of T. stromaticum conidia, a fungus which is used as a biocontrol and biofertilizer agent and is capable of inducing human infections. The protocol consists of 1) Trichoderma culture, 2) washing to obtain conidia, 3) the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using the polysucrose solution method and the differentiation of the PBMCs into macrophages, 4) an in vitro phagocytosis method using round glass coverslips and coloration, and 5) a clearance assay to assess the conidia viability after conidia phagocytosis. In summary, these techniques can be used to measure the&#160;fungal clearance efficiency of macrophages.

著者スポットライト: Trichoderma stromaticum と哺乳類の免疫系との相互作用を解き明かす

The technique involving the phagocytosis of fungal conidia by macrophages is widely used for studies evaluating the modulation of the immune responses against fungi. The purpose of this manuscript is to present a method for evaluating the phagocytosis and clearance abilities of human peripheral blood mononuclear-derived macrophages stimulated with Trichoderma stromaticum conidia.

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

Macrophages represent a crucial line of defense and are responsible for preventing the growth and colonization of pathogens in different tissues. Conidial ...

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

要約

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マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング

乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

全実装光学的にクリアされたマウス肺におけるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内のトリコデルマ・ストロマティカム分生子の生存率アッセイ

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内のトリコデルマ・ストロマティカム分生子の生存率アッセイ

共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する

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真菌病原体の食作用の生細胞ビデオ顕微鏡

宿主細胞に関連して病原性真菌の定量化のための画像サイトメトリーの使用

に応答したヒト一次好中球及び単球による抗カビ活動のライブイメージング

乳がんの転移における肺胞マクロファージの役割を学びます

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

フローサイトメトリーを用いたヒト白血球によるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディアの食細胞症の測定

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内の トリコデルマ・ストロマティカム 分生子の生存率アッセイ

全実装光学的にクリアされたマウス肺におけるアスペルギルス・フミガトゥス・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内のトリコデルマ・ストロマティカム分生子の生存率アッセイ

ヒト末梢血モノ核由来マクロファージ内のトリコデルマ・ストロマティカム分生子の生存率アッセイ