ここで説明するプロトコルは、基準大気汚染物質オゾンに曝された後の肺マクロファージ・エフェロサイトーシスを測定する。これらのデータは、オゾン暴露が肺胞マクロファージ・エフェロサイトーシスを減少させ、オゾンレベルの上昇が肺疾患の発生率を高める理由のメカニズムとなり得ることを示している。この技術の主な利点は、表現型または機能を変化させる可能性のあるマクロファージのエビボ操作を伴わずに肺胞マクロファージ・エフェロサイトーシスのin vivo評価を可能にすることです。
この技術は、大気汚染暴露後に肺が自分自身を修復できない新しいメカニズムを明らかにしました。さらに、この技術は、肺の中でエフェロサイトスを変化させる標的への新しい経路を明らかにすることができる。この方法は、肺の損傷または炎症の任意のモデルに適用することができます。
しかし, ユーザーは、肺損傷後のエフェロサイトス症を評価するのが最善であるときに最適化する必要があります。.中咽頭の吸引を行うことは技術的に困難な場合があります。私はあなたがこの手順を実行するためにあなたの技術を最適化していることを確認するためにあなたの獣医スタッフと協力することをお勧めします。
37°Cと5%の二酸化炭素で原稿の指示に従って補充基底細胞培養培地でJurkat T細胞を培養することから始めます。Jurkat T細胞は、3日ごとに温め込み前培養培地への通過を通じて維持することができる懸濁細胞株である。アポトーシス細胞を90%の合流度に成長させ、通過後3~4日かかります。
5つのT75フラスコで細胞を増殖させ、このプロトコルに十分な数の細胞を得る。細胞の準備ができたら、フラスコの内容物を約24ミリリットル吸引し、50ミリリットルの円錐形チューブに移します。トリパンブルー染色と血球計を使用して細胞を数えます。
ペレットは、271回gで5分間遠心分離して細胞を捨てる。次いで、培地中の細胞を再懸濁して、1ミリリットル当たり300万個の細胞を得る。アリコートは、1皿あたり5ミリリットルの細胞を移すことによって、細胞を100 x 20ミリメートルの組織培養皿に入れる。
約9種類の文化料理を用意する。1つの皿を露出していないコントロールとして脇に置き、残りの皿をUVにさらす。エネルギーボタンを押して、数字パッドで600を入力することにより、UVクロスリンカーを正しいエネルギーレベルに設定します。UV露光中に組織培養皿の上部カバーを確実に取り除くことを確認するコントロールを除いて、細胞ですべての料理を照射します。
その後、細胞培養インキュベーター内のすべての料理を摂氏37度、炭酸ガス5%で4時間インキュベートします。インキュベーション後、照射した細胞をすべて50ミリリットルの円錐形チューブに組み合わせ、271回gで5分間遠心分離してペレット状にします。上清を捨て、滅菌PBSの24ミリリットルで細胞を再懸濁します。
チューブを再び遠心分離し、上清を取り除きます。適切な濃度でPBS中で再懸濁してマウスをドーズするための細胞を準備します。マウスが適切に麻酔されたら、半リカンベントのスピージンの位置に置きます。
上顎切歯によってマウスを中断するために傾斜したアクリルシート板のペグの間に結ばれた外科ストリングを使用してください。鈍い非隆起鉗子のペアを使用して、マウスの舌をつかんで軽く引っ張り、P200ピペットでアポトーシス細胞を口腔に植え付けます。投与は、マウスが用量を受けてから1~2秒後にパチパチ音を起すと成功する。
手袋をはめた指で、舌が引き込まれる間に吸い込まれるまで、マウスの鼻をそっと覆います。口腔内に液体が見えなくなるまで鼻を覆い、マウスが2回以上の吸入を行った状態に保ちます。接種ボードからマウスを取り出し、ケージに戻して麻酔から回復させ、破片がナレスをふさぐのを防ぐためにマウスを背中に置きます。
すべてのマウスが麻酔から目覚めた後、肺胞マクロファージがアポトーシス細胞の流入を巻き込むように90分待ちます。洗浄液を収集するには、原稿の指示に従って安楽死させたマウスを準備します。ゆっくりとPBSを肺に押し込んで膨張させ、同じボリュームを引き戻してPBSが鼻孔から出ていないことを確認します。
15ミリリットルチューブ内の各マウスからプールされた洗浄を収集します。気管支肺胞洗浄物またはBALを摂氏4度で6分間6分間610倍にして遠心分離し、上澄み物を1.5ミリリットルチューブに集め、マイナス80度で凍結します。ペレットは、気管支胞腔からの細胞を表す。
ACK赤血球のリシスバッファーを1ミリリットルペレットに加え、残存赤血球を除去します。渦と溶地を氷の上で1分間、4ミリリットルのPBSを加え、溶出反応を止める。細胞を摂氏4度で6分間6分610倍にして遠心分離し、真空吸引器で上清を吸引する。
その後、1ミリリットルのPBSで細胞を10%FBSで再懸濁し、トリパンブルーなしでヘモサイトメーター上の細胞を数える。遠心分離機各サンプルの120マイクロリットルは、中加速度と細胞遠心分離機を使用して3分間、12回gのスライドに置きます。スライドを一晩乾燥させます。
翌日、ヘマトキシリンとエオシンでスライドを染色し、細胞数と差動細胞数の両方を計算します。次に、20Xまたは40Xの目的を使用して、生物学的顕微鏡上のBrightfield設定下のスライドを表示します。アポトーシス型のJurkat T細胞をアポトーシス細胞に貪食させた肺胞マクロファージの比率に基づいて、各スライドから少なくとも200個の細胞をカウントすることを確認します。
このプロトコルは、肺の炎症に対するオゾン暴露の影響を調べるのに使用された。オゾン暴露マウスは、濾過空気制御群と比較して空域中のマクロファージおよび好中球の増加を示し、肺胞上皮機能不全のマーカーであるBALタンパク質の増加を有した。マウスをドーズする前に、ユールカットT細胞におけるアポトーシスがフローサイトメトリーで確認された。
60ミリジュールのUV露光レベルと4時間のインキュベーション時間は、約75%アポトーシス細胞の反復的な結果をもたらした。efferocyticマクロファージは、通常の肺胞マクロファージと比較してJurkat T細胞を巻き込んだマクロファージとして同定された。オゾン誘発性肺炎症がアポトーシス細胞のクリアランスの減少に関連していることを示す濾過された空気制御と比較して、オゾン暴露群の浸透性指数が有意に低下した。
この手順では、細部への注意と、観察された違いを書き留めるのが重要です。また、分析のためにサンプルを盲目にし、2人の異なる人々にマクロファージを数えさせるのも推奨されます。分離後、BAL細胞はmRNA分析に使用することができ、免疫蛍光によって追加のマーカーに染色され、および/またはフローサイトメーター上で動作して表皮変化を区別する。
