この作品は、ローランドジュニア·フェロー· ​​プログラムによってサポートされています。クリス·ストークス特注の、コンピュータ支援圧力制御のセットアップ博士ダイアンSchaak、の開発に彼の助けのため：著者はハーバード大学ローランド研究所の科学者やスタッフに感謝の意を表したいと思います生体試料処理のための彼女の入力、電気セットアップを開発するためのウィンフィールド·ヒル、Alavaroサンチェス博士のための圧力のセットアップに必要な機械の配管部品を機械加工するためのフローサイトメーター、スコットBevis、ケニースペンサーとドンロジャースへのアクセスを許可する。マイクロ流体のマスターは、ハーバード大学のナノスケールシステムセンター（CNS）で作製した。

1。細胞調製<ol><li>リーボビッツL-15培地中で組織培養用T75フラスコあたり10 mlの容量でプレート転移性乳癌細胞株MDA-MB-231 1×10 5細胞/ mlを、10％（v / v）のウシ胎児血清および1を補充％ペニシリン - ストレプトマイシン。 </li><li> 0％CO 2環境下で37℃の加湿インキュベーター中MDA-MB-231細胞をインキュベートします。 </li><li> 2分間0.25％トリプシン-EDTAで細胞を処理し、増殖培地を8mlを添加することによりトリプシンの酵素活性を不活性化することにより2日間播種後の実験のために細胞を回収する。 </li><li> 5×10 5細胞/ mlの最終濃度になるようにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（のCa 2 +およびMgなしDPBS、1倍、2 +）で200×gで再懸濁し、5分間の遠心分離により細胞をペレット化。 </li></ol> 2デバイスの設計と製作注：マスク、マスタ金型捏造とプロセスを囲むマイクロチャネルは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ鋳造法は、通常の実験室ベンチトップ上で実行することができるが、クリーンルームの内部に行われるべきである。 <ol><li> AutoCADのと、図1に示すように、マイクロ流体デバイスを設計します。デバイスは、（L = 7ミリメートルW =40μmであり、H = 70μm）を、複数の注入ポート、粗いフィルターと2平行な長方形の慣性中心にチャンネルの入口で構成する必要があります。個別のストレートチャンネルは、アルミニウム電極用の穴を介して2つとは別に800μmで配置されている5エレクトロポレーションチャンバー（W C = 400μm）で構成されています。二つの横方向に隣接したエレクトロポレーションチャンバーは、負極用の穴を共有しています。二つのストレートチャンネルは、エレクトロポレーション領域の下流にある出口に合流する。 </li><li> LinkCADを使用してGDSIIファイルに微細パターンを持つCADファイルを変換します。 5 &quot;×5&quot;フォトマスクブランク上に微細なパターンを書くレーザーマスク描画装置を用いた。製造業者のプロトコルに従って、マスクを開発する。 NOTE：マスク開発プロセスは、フォトレジストの現像、クロムエッチングおよびレジスト除去を含む。代替的に、高解像度の透明度（&gt;2万解像度）に印刷微細パターンが第三者の製造業者から購入し、フォトマスクとして使用することができる。フォトマスク上の最終的なマイクロスケールの機能は、ネガ型フォトレジストの極性を一致させるために透明でなければならない。 </li><li> 70μmの最終的な厚さを有するように、2000rpmで4インチシリコンウェハー上にネガ型フォトレジストスピンコートを有する標準ソフトリソグラフィー技術23を用いて、デバイス設計の鋳型を製造する。 </li><li> 95℃で20分間、ネガ型フォトレジストを有するウェーハをプリベーク。 </li><li>ウェハマスクに連絡し、マスクアライナを使用して、80秒間UV源（17.4 MJ / cm 2）とにさらす。 </li><li> SU-8現像液中で4分間露光したウェハを開発する。 </li><li>測定表面形状を使用して、フォトレジストの厚さを開発しました。 </li><li>エージェント（シリコーンエラストマーキット）を硬化するエラストマーの1の割合とPDMSレプリカを生成するために、鋳型に混合物を注ぐ。徹底10をミックス。 30分間の鋳造エラストマーを脱ガスし、2時間70℃のオーブン中で、脱気したエラストマーとの鋳型を硬化させる。 </li><li>ピンバイスを使って入口、出口及び電極挿入用の金型とパンチ穴からマイクロ流路パターンを硬化したPDMSレプリカを剥離する。注：ピンバイスの通常の切刃径がしっかりと所定の位置にPEEKチューブ（1/32のOD」）とアルミニウム電極（0.029のOD」）を保持するための十分な0.76ミリメートル、である必要があります。 </li><li>それぞれ、ガラス75 Wの高周波電力および酸素分圧で7秒間の酸素プラズマクリーナーで処理スライド500ミリトールにPDMSレプリカを接合することによって囲まれたマイクロ流体チャネルを作成する。 </li></ol> 3フロー実験<ol><li>インサートアルミニウム電極マイクロチャネル内のホールを介して指定の場所へ（0.029 &quot;OD）と出口PEEKチューブ（1/32「OD）（ 図3Bを参照）。 </li><li>アルミニウム電極への高電圧短方形波パルスを生成するための18責任の電気機器を接続PDMSモールド中の溶液を流すと接触している（ 図3C参照 ）。注：装置は、パルス発生器と、社内に構築高電圧アンプで構成する必要があります18。 </li><li> （ 図3A参照 ）は、4つの50ml遠心個別DPBSを含むチューブに、細胞および生体分子の溶液、および空気式流量制御システムに接続されたそれぞれのバイアルホルダーに各チューブを取り付けるを準備する。18 </li><li>マイクロ流体デバイス内の各入口穴にバイアルホルダーから入口PEEKチューブを接続します。 </li><li>電気FIEを有するために100 Vに、方形波パルス、Vの大きさを設定するldは強度は、E = V / Lの電子 、電気室全体で0.7 kVの/ cmのと同等である。注：ここで、L eは正および負の電極が流動する溶液と接触している2点間の距離である（ 図1を参照）。 </li><li> 40 psiの圧力調整器を設定します。注：単一の手動調整可能な窒素源が均一にすべてのサンプルバイアルを加圧するために使用され、高速マニホールドが適時特注のLabVIEWソフトウェアを使用して、個別のソリューションポートを活性化するために利用される18 </li><li>バルブ制御のために、 バルブランナーラベル特注のLabVIEWソフトウェアを開き、操 ​​作する権利を有するドロップダウンメニューから実行]をクリックします。 </li><li>各対応するバルブのアイコンをクリックすることで、バルブの電源をオンにします。注：それが活性化されると、バルブのアイコンが緑色に点灯します。アクティブなアイコンをクリックすると、非アクティブにし、バルブを閉じます。閉弁アイコンがグレーに変わります。 </li><li> （DPBSリザーバー用のバルブを開けすなわち、1.5分間の安定な細胞トラップ渦発生に必要な主要な流速に洗浄液）。 </li><li> 30秒（ すなわち 、細胞捕捉ステップ）のためのエレクトロポレーションチャンバー内のトラップ細胞に対する細胞溶液を洗浄溶液から活性溶液ポートを切り替えます。 </li><li>ソリューション切り替えステップ中の破壊されていない流れを確保するために、細胞捕捉工程の前に10秒間、同時にデバイスを介して両方の洗浄および細胞のソリューションフロー。注：この簡潔な並行流ステップは、各ソリューション切り替えステップで繰り返されるべきである。 </li><li>洗浄ポートの電源を入れ、非捕捉された混入細胞を除去するために、20秒間のデバイスをフラッシュします。 </li><li>デバイスに関心のある第一の分子（3,000 Daの中性及びアニオン性デキストラン分子の0.2 mg / mlの70,000 Daのニュートラルデキストラン分子の1.5 mg / mlの）を含有する溶液を注入する。 </li><li>速やかに注入した後5短パルス（Δtは2秒間隔で30ミリ秒=）を適用分子溶液およびオシロスコープを使用してリアルタイムに印加される電気パルスの大きさおよび持続時間を監視します。 </li><li>配信される追加の分子の数な回数だけ繰り返し手順3.10。各分子送達のために、余分な分子を除去するために100秒間洗浄溶液でデバイスをフラッシュし、その後、分子溶液に100秒間細胞をインキュベート。 </li><li> 5 psiの下の運転圧力を低下させることにより、下流解析のために、96ウェルプレート内の細胞を解放します。注：100細胞を用いた溶液約100μlを各リリースから収集されます。 </li><li>実験的には、フローサイトメトリーのために十分な細胞を収集するために3.16三回を通じて3.9ステップ実行します。 </li><li> 228×gで5分間処理された細胞を含む96ウェルプレートを遠心する。 </li><li>過剰な蛍光分子を含有する上清を取り除きます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のためにDPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li>分子のuのためのフローサイトメーターでのロードセル効率分析をptake。 </li></ol>

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+large+molecules+into+viable+fibroblasts+by+electroporation+Optimization+of+loading+and+identification+of+labeled+cellular+compartments.">Introduction of large molecules into viable fibroblasts by electroporation Optimization of loading and identification of labeled cellular compartments.</a> Experimental Cell Research. 200, 227-234 (1992).</li><li>Verspohl, E. 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著者らは、開示することは何もない。

スループットおよび多分子送達の効率の新しい並列化エレクトロポレーションプラットフォーム、10倍の増強に以前に開発単室システムが提供する全ての利点に加えて、達成された。18以前は利用可能なメリットは、（i）予備精製が含まれる生存能力増強のための均一なサイズ分布、（ii）の正確かつ個別分子の投薬管理、および（iii）低い運用電流を有する細胞を標的とする。これ?...

近年では、細胞外分子のサイトゾル送達を容易にするために、電気パルスの使用は、哺乳動物細胞を操作する魅力的な手段となっている。1もエレクトロポレーションと呼ばれるこのプロセスは、可逆的にアクセスするために、本 ​​質的に膜不透過性分子を可能にする、細胞膜を透過性に細胞の細胞内環境に。実質的に任意の分子がエレクトロポレーションを用いた細胞の任意のタイプの膜に一時的に作成細孔を介してサイトゾルに導入することができ、この技術はより再現性であると報告されており、普遍的に適用、およびウイルス媒介化学を含む他の方法よりも効率的であるため細胞が生存し、そのまま保ちながら光学的ア ​​プローチ2-3この技術は、蛍光分子を導入する4医薬品5および核酸6-7利用されている。これらの利点を考えると、エレクトロポレーションは、一般的な労働力として採用されているDNAトランスフェクションのためのatory技術、 インビボ遺伝子治療8および細胞ワクチン接種の研究。成功したエレクトロポレーションに必要な電界強度が密接に細胞の直径と相関するので、従来のエレクトロポレーションシステムは、同時に、サイズが大きな不均一性を有するサンプルのための実用的な効率および生存率を達成することは依然としては困難である。さらに、これらのシステムは、複数の分子量の正確な制御は、バルク確率的分子送達プロセスへの依存に起因して配信されることはできない。9にこれらの問題に対処するために、多くのグループが、より低いポレーション電圧の利点を提供する、マイクロ流体エレクトロポレーション·プラットフォームを開発したより良いトランスフェクション効率、細胞死亡率の大幅な削減、および複数の分子を送達する能力。10〜13これらの利点は、電極ピッチマイクロエレクトロポレーションシステムの小さなフットプリントにより可能となった長さは飛躍的に成功した配信のために必要な電圧を減少させ、サブミリメートルである。さらに、これらのマイクロエレクト​​ロポレーションシステムは、均一な電界分布を得ることができ、迅速に送達効率を高めつつ、縮小細胞死を生じ、発生した熱を放散する。これらのマイクロチップのための透明な材料を利用し、さらに迅速なパラメータ変更のためのエレクトロポレーションプロセスのその場観察ができます。2,12しかし、投与量の制御とmolecular-と携帯依存のパラメータ制御の正確な新興研究および治療 ​​用途のために必要、6、 14-16は依然として未解決のまま。 この研究は、標的細胞の予め選択された同一集団に順次複数の分子を送達することができるマイクロ流体渦アシストエレクトロポレーションシステムを提示する。均一なサイズ分布を有する細胞は、以前に報告されたSiを用いたエレクトロポレーションの前に単離されるぜ選択的捕捉機構。17-18与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーションの効率および拡張生存率の小さい変化が達成された、均一なサイズ分布を有することにより、 図19さらに、連続的に横切る分子の均一な送達のために許可されたマイクロスケールの渦を用いて捕捉された細胞を撹拌結果と一致する全体細胞質ゾルは、以前に別の渦アシストエレクトロポレーションプラットフォームを使用して報告した。20このシステムは広範囲の分子量を有する巨大分子をに配信された、一般的に生物学的用途で利用される分子の広い範囲に適用可能であることを示すために転移性乳癌細胞。また、リアルタイムのプロセス監視の助けを借りて、この作品はelectrporation中の分子配信のメカニズムについての長年の論争に終止符を打つためのより多くの証拠を提供し、主に拡散媒介対電気泳動媒介されている。14 </sup&gt;他のエレクトロポレーションシステムとは異なり、このプラットフォームは、一意的に正確なマルチ分子送達、高分子送達効率、最小の細胞死、サイズ、送達分子の電荷の広いスパン、ならびにエレクトロポレーションのリアルタイム可視化を組み合わせた利点を提供するプロセス。これらの機能を考えると、開発したエレクトロポレーションシステムは、セルラーリプログラミング研究、6,14,21-22薬物送達用途10,19およびエレクトロ分子配信メカニズムの深い理解のために必要とするアプリケーションのための汎用ツールとして実用的な可能性を秘めています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1056">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:475px;">MDA-MB-231 cancer cell line</td>
			<td style="width:297px;">American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td style="width:119px;">HTB-26</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Leibovitz&#8217;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">10-045-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:475px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Trypsin</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Flow Cytometer easyCyte HT</td>
			<td style="width:297px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">0500-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Oxygen Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:297px;">Technics Micro-RIE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dektak 6M surface profiler</td>
			<td style="width:297px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">KMPR 1050</td>
			<td style="width:297px;">Microchem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Nitrogen gas</td>
			<td style="width:297px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">High Pressure Regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td>6162K22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Downstream regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">4000K563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">high-speed 3/2way-8 valve manifold</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Inline Check Valve</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">CV3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">5/32&#34; OD x 3/32&#34;ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td>PU-156F-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/4&#34; OD X 0.17&#34; ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td style="width:119px;">PU-250PB-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/16&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;">P1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/32&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">PEEK tubing unions</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Pulse Generator</td>
			<td style="width:297px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">8110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Aluiminum Wire</td>
			<td style="width:297px;">Bob Martin Company</td>
			<td style="width:119px;">6061 ALUM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">oscilloscope</td>
			<td style="width:297px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSO3062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">T75 culture flask</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3329</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

それは物理的に細胞内に非浸透性の外因性分子プローブを導入するための非常に強力な技術であるため、エレクトロポレーションは、過去数年間でますます注目を受けている。この作品は、精密な分子に依存するパラメータ制御で、哺乳動物細胞への複数の分子送達を行うことが可能なマイクロ流体電気穿孔プラットフォームを報告します。均一なサイズ分布を有する細胞を単離するシステムの能力は、与えられた電界強度あたりのエレクトロポレーション効率のより少ない変動を可能にする;したがって、サンプルの生存率を高めた。また、そのプロセスの可視化機能は、効率向上のために、その場で迅速な分子デリバリーパラメータ調整を可能にする、リアルタイムで蛍光分子の取り込み過程を観察することができます。報告されたプラットフォームの膨大な機能を表示するには、異なるサイズおよび電荷（3,000 70,000 DaでMWを有する、例えばデキストラン）を持つ巨大分子であったすべての試験した分子に対して高い送達効率（&gt; 70％）で転移性乳癌細胞に送達する。開発プラットフォームは、オンチップエレクトロポレーション技術は有益である研究分野の拡大に使用するための可能性を証明した。

開発された並列マイクロ流体エレクトロは、転移性乳癌細胞を生きたに多様なサイズと電荷を持つ高分子を送達した。成功した分子の送達は、定性的にその場で電気穿孔周回細胞の蛍光強度の変化を監視することによって決定し、フローサイトメトリー分析によって定量的測定によって確認した。 図4Aは、処理された細胞の90％が70,000 Daの中性デキストランを取り込むこと...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K ビュー.  Harvard University. マイクロ流体渦補助エレクトロポレーション·プラットフォームは、正確かつ独立した投与量制御を備え​​た同一の細胞集団への複数の分子の順次配信のために開発されました。分子の送達効率および加工細胞の生存率を向上させるために支援エレクトロポレーションの前に、システムのサイズベースの標的細胞精製工程。 

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

生物工学

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

DNAワクチンの送達のための新しいアプローチとしてタトゥー皮膚

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific molecular mechanisms are identified, new therapeutic strategies can be developed to treat abnormalities in specific behaviors caused by degenerative diseases or aging of the nervous system. The marine snail Aplysia californica is well suited for the investigations of cellular and molecular basis of behavior because neural circuitry underlying a specific behavior could be easily determined and the individual components of the circuitry could be easily manipulated. These advantages of Aplysia have led to several fundamental discoveries of neurobiology of learning and memory. Here we describe a preparation of the Aplysia nervous system for the electrophysiological and molecular analyses of individual neurons. Briefly, ganglion dissected from the nervous system is exposed to protease to remove the ganglion sheath such that neurons are exposed but retain neuronal activity as in the intact animal. This preparation is used to carry out electrophysiological measurements of single or multiple neurons. Importantly, following the recording using a simple methodology, the neurons could be isolated directly from the ganglia for gene expression analysis. These protocols were used to carry out simultaneous electrophysiological recordings from L7 and R15 neurons, study their response to acetylcholine and quantitating expression of CREB1 gene in isolated single L7, L11, R15, and R2 neurons of Aplysia.

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Marine snail Aplysia californica has been widely used as a neurobiology model for the studies on cellular and molecular basis of behavior. Here a methodology is described for exploring the nervous system of Aplysia for the electrophysiological and molecular analyses of single neurons of identified neural circuitry.

アプリジア 単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone fusion. Large doses of highly potent biological agents are required due to growth factor instability as a result of rapid enzymatic degradation as well as carrier inefficiencies in localizing sufficient amounts of growth factor at implant sites. Hence, strategies that prolong the stability of growth factors such as BMP-2/NELL-1, and control their release could actually lower their efficacious dose and thus reduce the need for larger doses during future bone regeneration surgeries. This in turn will reduce side effects and growth factor costs. Self-assembled PECs have been fabricated to provide better control of BMP-2/NELL-1 delivery via heparin binding and further potentiate growth factor bioactivity by enhancing in vivo stability. Here we illustrate the simplicity of PEC fabrication which aids in the delivery of a variety of growth factors during reconstructive bone surgeries.

Self-assembled polyelectrolyte complexes (PEC) fabricated from heparin and protamine were deposited on alginate beads to entrap and regulate the release of osteogenic growth factors. This delivery strategy enables a 20-fold reduction of BMP-2 dose in spinal fusion applications. This article illustrates the benefits and fabrication of PECs.

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

自家条件で間葉系幹細胞の培養および配信：整形外科アプリケーションのためのスマートなアプローチ

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

要約

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バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

DNAワクチンの送達のための新しいアプローチとしてタトゥー皮膚

3次元細胞培養のための自己申告足場

アプリジア単一ニューロンの電気生理学的・分子的解析のための神経節の準備

siRNAの治療を送達するための多孔質シリコンマイクロ粒子

マルチモーダル分子イメージングアプリケーションのためのBiofunctionalizedプルシアンブルーナノ粒子

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

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マイクロスケール渦アシストシーケンシャル分子送達用エレクトロポ

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