カリフォルニア大学バークレー校の博士ケントマクドナルドの優しさと寛大さが大幅に高く評価されています。私たちは、非常に有用な提案のための匿名査読に感謝します。バーチ·スミスラボは、テネシー大学からのスタートアップ資金によってサポートされています。

注：QFS手順は、ユーザが十分な注意と注意を必要とし、私たちは、適用上の注意と注意事項としてここにこれらの安全上の注意を強調表示します。 HPFラン用1.Preparation <ol><li>サンプル調製を開始する前に、製造業者の指示に従って、高圧冷凍庫の電源をオンにします。 注：このプロトコルで使用されるHPFユニットがWohlwendコンパクト02単位（ 図1A）で、HPFの実行前には開始することができる起動手順の1時間半に約1かかります。 <ol><li> Wohlwendコンパクト02高圧冷凍庫に切り替える。 <ol><li> &quot;1&quot;から&quot;0&quot;メインスイッチを回すことにより、機器のスイッチを入れる。 </li><li>マシンに圧縮空気を解放します。 </li><li>マシンに液体窒素をリリースします。 </li><li> &quot;SYSTEMドライUP」ボタンを押します。 </li><li> 30分後、「本稿では、Webを押してくださいMドライUP」ボタンを押します。 </li><li>計器のスイッチを入れる「ON / OFF」ボタンを押します。 </li><li> 「窒素」ボタンを押します。 </li><li> 「DRIVE IN」ボタンはすでに点灯している場合でも、マシンは20分間冷却して。 </li><li>ボタン &quot;でドライブ&quot;が点灯。 </li><li>ボタン &quot;でドライブ」を押します。 </li><li> 「AUTO」ボタンを押します。 </li><li> 「SYSTEM READY」ボタンが点灯します。 </li><li>圧力室に温度と圧力プローブを配置し、ピンを使用して固定します。 </li><li> 「JET AUTO」ボタンを押します。このステップは、必要に応じて圧力上昇と温度低下であることをチェックする。基本的に試運転。シャープは、温度に低下し、圧力の急激な増加は、（ 図1B）が期待されている。 </li><li>さらに2つのジェットのサイクルを実施する。 </li></ol></li></ol></li></ol> Receiviのため2。準備ngの冷凍サンプル<ol><li>保有者が完全に覆われるように（ 図1C）、（安全上の警告を参照のこと）、液体窒素で冷凍バイアルホルダーを含む断熱箱を埋める。 注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。 </li><li>液体窒素（ 図1C）でアルミニウム管ホルダーにFS培地を含むバイアルの適切な数を配置します。最大4つのディスクは、このプロトコルでは、単一のサンプルを含む各単一の凍結バイアルに配置することができます。 注：バイアルはダイヤモンドひっくり返されたスクライブし、非常に柔らかい鉛筆のような鋭利な器具で標識する必要があります。 <ol><li> QFS中の固定剤のためには、1％のOsO 4及びアセトン9中の0.1％酢酸ウラニルを使用しています。大量に溶液を調製し、液体窒素中で凍結クリオバイアルとストアに1.5ミリリットルのアリコートを分注する。 注：のOsO 4及び酢酸ウラニルを処理するための安全に関する警告に従ってください。 注：のOsO 4 </suB&gt;と酢酸ウラニル危険な化学物質であり、クローズドつま先の靴、白衣や手袋などの適切な保護具（P​​PE）を装着したままドラフト内で処理する必要があります。 注：QFSのためのサンプルを保持するために使用されるクライオバイアルチューブはのOsO 4の漏れを避けるために、QFSの間に密封されたままであることを確実にするためにハードにOリングを持っている必要があります。 </li></ol></li><li>ペーストが滑らかになるまで、爪楊枝又は他のそのような器具を用いて10％メタノールの約等量のパン酵母を混合することにより、酵母ペーストを準備します。酵母ペーストは、細胞外凍結保護剤として作用し、試料キャリア内の試料の周りの空間を充填するために使用される。ペーストの量はサンプル数に依存する。 10サンプルまたはより少ない用ペースト（1ml）をマイクロ遠心管中で混合することができる。 </li></ol>サンプルの3。高圧凍結<ol><li>植物から興味のある葉（または他の組織）を外し、静かにdentaの作品の上に置きますlのワックス又は他の切断面。葉からサンプルを切断するために2.0mm以下所望の大きさのパンチを使用してください。ピンセットで軽くサンプルを処理し、可能な限り迅速に動作します。 </li><li>解剖顕微鏡下での作業、型試料キャリア0.2ミリ側にリーフディスクを配置し、酵母ペーストで完全に覆う。ディスクが完全に満たされていることを確認し、ペーストが細かい絵筆（ 図2）を用いてペーストを滑らかにすることにより、ホルダの縁と同じ高さ。 </li><li>試料ホルダーにキャリアを配置します。タイプB検体キャリア、平らな面を下にしたサンプルをカバー。 注：試料ホルダーは、乾燥し、室温であるべきである。 </li><li>試料ホルダーにサンプルを取り、機械に挿入し、1〜2秒で完了するはずです &quot;JET AUTO」ボタンを押すと、冷凍サイクルを開始。 </li><li>可能な限り迅速に作業を、機械からホルダーを取り外し、SAMPを保持するチップを置くルHPFマシンの上に絶縁されたボックス内の液体窒素に変換する。それらを冷却する液体窒素中で鉗子の二対の先端を浸し。 注：凍結後、キャリアは、液体窒素冷却した鉗子で処理する必要があります。ウォーム（室温）鉗子は、多くの場合、cryotechniquesの失敗の原因となっています。 </li><li> FS培地を含むクリオバイアルを開き、箱の側面に蓋を置く。液体窒素で冷却したピンセットを用いて、そっとディスクは、液体窒素または蒸気中に常にあることを確認、試料ホルダからディスクを取り出します。液体窒素蒸気での作業、1予冷した鉗子でFSチューブを保持し、FSのバイアル中にホルダーを配置するために、他を使用しています。背面のFSバイアル​​の蓋をねじ込みます。いないトラップのバイアル内の任意の液体窒素の操作を行います。 注：、QFS用のクライオバイアルに液体窒素がバイアル中に閉じ込められていないことを確実にするためのサンプルを転送する。液体窒素は温暖化とあらゆるTrappeの間に700倍に拡大しdは、液体窒素はこの時間の間に爆発を引き起こす可能性があります。 </li><li>すべての希望するサンプルが凍結されるまで繰り返して3.7に3.1を繰り返します。サンプルの同じタイプを含む複数のリーフディスクを同じバイアルに入れることができる。試料ホルダーを乾燥させ、凍結実行の間に室温に戻しする必要があることに注意してください。すぐにこれを行うには、ブロードライヤーでそれを加熱し、タッチでその温度を監視します。 </li></ol>フリーズ交代のため4。準備<ol><li>完全に10分間、または核沸騰が止まるまで液体窒素中でアルミニウムヒーターブロックを浸す。これが起こっているが、FSチャンバー（ 図3）として使用される容器の底にドライアイス（1-2センチ）の層を配置します。発泡スチロール容器またはアイスバケットを砕いたドライアイス又はペレットと一緒に、FSのために使用することができる。 </li><li>すぐにヒータブロックの中段に温度プローブと一緒にサンプルを含むクリオバイアルを挿入します。必ずその上に蓋FSメディアがFS中に漏れないようにバイアルをしっかりとねじ止めされている。温度の記録を開始します。 <ol><li>それはチューブの底に達するようにクリオバイアルの上部を通って熱電対を配置することによって、温度プローブを作る。液体が漏れるないように樹脂でチューブのふたを密封。各QFSの実行の開始時に1.5ミリリットルのアセトンでチューブを埋める。 </li></ol></li><li>絶縁cryoglovesや大きな鉗子を使用して、ヒーターブロックからすべての液体窒素を注ぐ。クリオバイアルを注ぎないように注意してください。 注：液体窒素を取り扱う際に使用してPPEはcryoglovesとゴーグルを含む。 </li><li> QFS室においてドライアイスの層へのバイアルを含むブロックを配置します。チューブが水平に横になったが、わずかな上向きに傾斜しているように、ブロックが置かれていることを確認します。正しいクリオバイアルを使用する場合に漏れがあってはなりません。 </li><li> FS管が覆われるようにそれがする必要はありませんが、ドライアイスでQFS室をパックブロックの上部をカバーしています。チャンバーに蓋を置きます。 </li></ol> 5。クイックFS 注：のOsO 4の漏れが誤って他の予防措置にもかかわらず、発生した場合にはドラフト内でQFSの実行を行います。 <ol><li>ドラフト内でプラットフォームロータリーシェーカー上QFS室を置き、120分間125 rpmで回転する。この間、ブロックの温度は、約-80℃に次第に増加するはずである。攪拌は、より良い、FSのための成分の混合を確実にします。 注：ドラフト中シェーカーの配置とヒュームフードドアの位置がQFS手順全体を通して、サンプルの一貫した温暖化を確実にするために実行するたびQFSのために同じである必要があります。 </li><li>チャンバからドライアイスを取り出し、さらに1時間振盪し続ける。 注：温度が約-15℃〜-20℃に増加するはずである。 </li><li> QFS室からのサンプルおよび温度プローブを外し、上に置くさらに10〜15分間、室温でシェーカーまで、それらが室温に達する。温度の記録を停止します。 </li><li> FSの間に、HPFマシンをオフにしてください。 <ol><li> HPFマシンは窒素を充填されている間に、液体窒素タンクのタップを閉じます。 </li><li> 「窒素」ボタンを押します。 </li><li>赤い &quot;PISTON DOWN」ライトが消灯するまで待ちます。 </li><li> 「ON / OFF」ボタンを押します。 </li><li> &quot;SYSTEMドライUP」ボタンを押します。 </li><li>マシンへの圧縮空気の供給を遮断する。 </li><li> 12時間の最小値の後、（存在する水分の乾燥を確実にするため） &quot;0&quot;から &quot;1&quot;にメインスイッチを回すことにより、マシンのスイッチを切る。 </li></ol></li></ol> 6ポストFS処理<ol><li>慎重に有毒廃棄物の適切な容器にプラスチック製ホールピペットと場所で、FSメディアを取り出します。 注：のOsO 4及び酢酸ウラニルは危険な化学物質であるクローズドつま先の靴、白衣や手袋などの適切な保護具（P​​PE）を装着したままとドラフト内で処理する必要があります。 </li><li>洗浄サンプル、100％アセトンで4回。最初の2回の洗浄を収集し、有毒廃棄物容器内に配置します。 </li><li>細かい鉗子を使用して、所有者からの組織サンプルを削除します。これが行われているようにアセトンで湿ったサンプルを保管し、破損のサンプルを回避するために、非常に静かに動作します。 注：これは珍しいことではないし、それが実際に酵母ペーストは、この時点でサンプルから離れて落ちる有することが有用であり得る。葉組織がまだ緑である間酵母ペーストは通常​​、非常に濃い茶色です。 </li><li>アセトンを含むクリオバイアル内のサンプルを収集します。通常のプロトコールに従ってTEM用サンプル調製（浸潤と埋め込み）を続行します。 </li></ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Embedding+Methods+into+Epoxy+and+LR+White+Resins+for+Morphological+and+Immunological+Analysis+of+Cryofixed+Biological+Specimens.">Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens.</a> Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).</li><li>McDonald, K. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues.">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここで紹介するプロトコルの成功は、ユーザーに大きく依存します。まず、先進的な製造は、すべての必要な材料が容易に入手でき、全体のHPF-QFSの実行を完了するのに十分な量であることを保証するために必要とされている。第二に、これにより、ユーザは、組織の天然状態への変更を最小限に抑え、試料の取り扱いを最小限にする効率的な方法でのステップ·ツーステップから移動し、す?...

細胞の超微細構造の私たちの知識は、数ナノメートル1の範囲の内容を解決することができ、電子顕微鏡から主に来る。サンプル調製は時間がかかり、面倒なプロトコルを必要とし、開業医からいくつかの専門知識を要求するように分解能TEMで非常に強力であるにもかかわらず、ユーザーフレンドリーとはみなされません。サンプルの伝統的な固定は、樹脂中に埋め込み、次いで重金属で染色した超薄切片を作製するために切片化、脱水を含むさらなる処理の前に、アルデヒドおよび四酸化オスミウムの使用を組み合わせている。しかしながら、化学的な固定は、最終的にいくつかの細胞区画2に影響を与える膜へのタンパク質凝集及び脂質1の損失、および変更を含むアーティファクトを生成することが知られている。これらのアーティファクトは、主に、室温3、4、5で固定し、脱水の遅い速度に起因する。 、7。HPFが低下し、20度の水の凝固点を低下させる氷結晶の核生成及び成長を遅くし、細胞成分を本質的に6固定されているように、生物学的サンプル中の水の粘度を増大させることであるミリ秒単位の非常に高圧（210 MPa以上2,100バール）の下で、液体窒素とサンプルの温度、。適切に行われると、HPFは、細胞の超微細構造に大きな損傷を引き起こす可能性があり、大きな氷結晶の形成を防止する。 HPFは、生物学的溶質7の典型的な濃度で100〜200ミクロンの厚さのサンプルを固定するために使用することができる。多数の物理学の口コミHPF、 たとえば 1、7,8の基礎となる原則があります。 HPF後、試料を低温でインキュベートする（-78.5°C〜-90＆＃176; C）は、一般的に数日間、四酸化オスミウムなどの化学固定剤を含有する液体有機溶媒の存在下で行われる。この低い温度では、サンプル中の水、有機溶媒、典型的にはアセトンまたはメタノール1,9によって置換される。したがって、このプロセスは、凍結置換（FS）と呼ばれている。次いで、試料を次第に温め、この時間の間、通常は四酸化オスミウムおよび酢酸ウラニル9と、固定されている。低温での架橋は1を固定化された分子を固定するという利点を有する。 FSしたがって、改良された超微細構造の保存をもたらし、特に、室温で通常の化学的固定により固定したものに比べて優れた品質、抗原性の良好な保存のサンプルを生成し、未結合の細胞成分10,11の損失を減少させた。 最もFSは、典型的には数日間まで、長期間にわたって行われる。これは、特にトゥルーである植物標本12、13、14の電子。マクドナルドやウェッブによって開発された最近のプロトコルは大幅に数時間から15数日からFSのための時間を削減します。スーパークイックFS（SQFS）でサンプルが90分で処理されている間、それらの急速凍結置換（QFS）手順では、FSは、3時間かけて行われる。これらの方法により作製したサンプルの品質は、従来のFSプロトコルによって得られたものに匹敵する。私たちは、HPF後に植物試料の下流処理のためQFSプロトコルを採用しています。 QFSおよびSQFSではなく、高価な市販のFSマシンの一般的なラボ機器を使用するため、これは、時間だけでなく、お金ではないだけを保存することが証明されています。 植物組織は、多くの場合、TEMの準備をすることは非常に挑戦的である。平均して、植物細胞、細菌細胞または動物細胞のいずれよりも大きくしている。疎水性のワックス状のキューティクル、厚い細胞壁、有機酸、加水分解酵素とフェノールcを含む大きな水で満たされた空胞の存在総細胞体積16の最大90％を占め、曝気スペースの存在は、深刻なシステム17の熱伝導率を低下させることができるompounds。さらに、植物の場合には、試料の厚さは、ほとんどの場合は20μm、化学的固着の使用の制限を超えています。これらの厚さで、水の低い熱伝導率は、サンプルの中心に凍結速度を超える-10,000°C /秒のを防止する。その速度は、有害な六角形の氷の形成（10〜15ナノメートルよりも低い密度と大きな氷結晶）8を回避するために必要とされる。サンプルの適切な凍結およびその後のFSの両方に同時に、これらの課題を提示。それにもかかわらず、低温固定は植物試料を固定するための最良の方法です。ここで植物組織試料のHPF-QFSのためのプロトコルが提示される。これは、モデル種のシロイヌナズナに焦点を当て、またベンサミアナタバコで使用されてきた。典型的な結果は、HPF-QFSはSAを生成することを実証わずかな時間での伝統的なHPF-FSに匹敵する品質のmples。適切な調整で、このプロトコルは、他の比較的厚い生物学的試料のために使用することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

1940透過型電子顕微鏡（TEM）ので、生物学的材料の超高分解能画像で生物を提供している。しかし、理由もアーチファクトのない試料の調製の経験を求めて、面倒で時間がかかるのプロトコルにより、TEMはユーザーフレンドリーな技術とはみなされません。 TEMのための伝統的なサンプル調製は、細胞構造を維持するために化学固定剤を使用した。高圧凍結することにより細胞の超微細構造の完全性に有害な氷の形成を制限し、非常に速い冷却速度を生成するために、高圧下での生体サンプルの低温固定である。高圧凍結し、凍結置換は、現在TEM用樹脂切片における最高品質のモフォロジーを製造するための最適な方法である。これらのメソッドは、通常、薄い切片のTEMのための従来の処理に関連する成果物を最小限に抑えます。低温固定した後、サンプル中の凍結された水が液体で置き換えられる低温での有機溶媒は、プロセスは、凍結置換と呼ばれる。凍結置換は、典型的には、専用の高価な設備で数日間にわたって行われる。最近の技術革新ではなく通常の2日間で、プロセスは3時間で完了することを可能にする。これは、典型的には、浸潤およびセクショニングの前にエポキシ樹脂中に包埋を含む試料調製のいくつかのより多くの日が続く。ここでは、植物試料の固定は時間内で達成されることを可能にする、高圧凍結急速凍結置換を組み合わせたプロトコルを提示する。プロトコルは、容易に他の組織または生物を操作するために適合させることができる。植物組織が原因曝気スペースと水の氷のない凍結を妨げる水で満たされた空胞の存在のために、特別な関心事である。また、化学的固定化のプロセスは、組織内の深いへの化学物質の浸透を妨げ、細胞壁のために、植物では特に長いです。植物組織は、したがって粒子フィルタであるularly挑戦が、このプロトコルは、信頼性があり、最高品質のサンプルを生成する。

以下に示す結果は、HPFのためWohlwendコンパクト02（ 図1A）を使用して得られている。この装置の1つの主な利点は、試料キャリア及びその所有者の使いやすさである。他の楽器を使用する場合は、マクドナルド、2人のユーザーが、他の凍結を行い、FSへの転送が9をクリオバイアルながら試料を調製する試料調製とHPF、1を行うべきであると推奨しています。しかし、Wohlwend標...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

タンデム高圧凍結および透過型電子顕微鏡のための植物組織の急速凍結置換

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K ビュー.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

生物学電子顕微鏡でのフリーズフラクチャー/フリーズエッチングの基本技術要素

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

生物学

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

プランジ凍結：透過型電子顕微鏡での懸濁細胞の超微細構造と免疫学的研究のためのツール

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

問題のあるプラント、卵菌類、および真菌サンプルのための電子顕微鏡（SEM）プロトコルをスキャン

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

フラッシュとフリーズ：電子顕微鏡でメンブレンダイナミクスをキャプチャするために新しい技術

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

透過電子顕微鏡用小型サンプル準備

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

新しいロボットシステム、スポティトンを用いた時間分解研究のためのクライオ電子微視的グリッドの準備

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.