This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1. Total Pigment Extração de espinafre folhas <ol><li> Homogeneizar um punhado de folhas de espinafre (~ 20 g) em 100 ml de tampão de frio Moagem (ver Tabela 1), utilizando um misturador de 20 seg. </li><li> Filtrar a solução através de duas camadas de tecido de nylon com um diâmetro de poro de 20 ^ m e centrifuga-se o filtrado a 1500 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o pellet contendo os cloroplastos com um artistas moles paint brush em 1 ml de tampão de lavagem frio (ver Tabela 1). Uma vez que o sedimento é ressuspendido, adicionar 50 ml de tampão de lavagem e centrifugar a solução a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento (tilacóides) em 50 ml de tampão de lavagem (ver Tabela 1). </li><li> Centrifuga-se a solução a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante completamente. Neste ponto, realizar os seguintes passos no escuro, para evitar a oxidação do pigmento. </li&gt; <li> Adicionar ~ 20 ml de acetona a 80% tamponada com Na 2 CO 3 (ver Tabela 1) para extrair os pigmentos. Deixar a solução em gelo durante 10 min, vortex ocasional. </li><li> Sedimentar os componentes celulares por centrifugação a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Se os pigmentos não são totalmente extraído, o sedimento terá uma cor verde e passo 1.6 deve ser repetido. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante para um funil de separação. Adicionar 0,4 volumes de éter dietílico, agitar vigorosamente e abrir a válvula para ventilar o gás. </li><li> Adicionar 0,8 volumes de 0,33 M de NaCl e misturar vigorosamente. Permitir ~ 10 min para separar as duas camadas. A fase de éter no topo contém os pigmentos extraídos. Remover a fase inferior transparente. NOTA: Se a separação não é clara, congelar e descongelar a solução para melhorar a separação de fases. </li><li> Remover o éter vertendo-a da parte superior do funil de separação para um recipiente de vidro adequado. Seco, adicionando uma colher de gransulfato de sódio anidro ular. Agitar a solução e permitir a ~ 5 min para o dessecante para absorver a água a partir do éter. NOTA: Repita este passo se o sulfato de sódio aparece completamente aglutinados; deve haver alguns cristais de livre flutuação quando o éter é suficientemente seco. Se uma camada de água de formas, remover esta com uma pipeta de Pasteur, antes de se adicionar sulfato de sódio anidro adicional. </li><li> Decantar o éter a um novo recipiente de vidro, deixando o sulfato de sódio sólido para trás. </li><li> Evapora-se o éter num speedvac rotativo ou sob uma corrente de N 2. </li><li> Dissolve-se os pigmentos completamente em 10 ml de acetona a 100%. </li><li> Dilui-se uma pequena quantidade (~ 3 mL) em 1 ml de 80% de acetona e medir o espectro de absorção e determinar a / b clorofila e o rácio de concentração Chl com o método descrito por Porra et al. (1989) 15. </li><li> Alíquotas e secar os pigmentos em um speedvac rotativo ou sob N 2 córrego até a acetona éevaporado completamente. Armazenar os pigmentos se a -80 ° C. </li></ol> 2. extração de carotenóides Espinafre <ol><li> Siga os passos 1.1 a 1.5. Neste ponto, realizar os seguintes passos no escuro, para evitar a oxidação do pigmento. </li><li> Ressuspender o sedimento em tilacoide ~ 50 ml de etanol a 96% tamponado com Na 2 CO 3 (ver Tabela 1) para extrair os pigmentos. Deixar a solução em gelo durante 5 min. </li><li> Sedimentar os componentes celulares por centrifugação a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Se os pigmentos não são totalmente extraído, o sedimento terá uma cor verde e passo 2.2 deve ser repetido. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e adiciona-se 0,1 volume de 80% KOH (w / v), para iniciar a saponificação. </li><li> Deixar a solução a 4 ° CO / N, bem tapado e protegida da luz. </li><li> Recolher a solução para um funil de separação. Adicionar 1 volume de éter dietílico e agitar suavemente. </li><li> Adicionar 0,8 volumes de 0,33 M NaCl e misture delicadamente. Permitir ~ 10 min para separar as duas camadas. A fase de éter de laranja em cima contém carotenóides saponificados. Remover a fase inferior verde por drenagem através da torneira de passagem do funil. </li><li> Adicionar 3 volumes de água e agitar suavemente para remover o hidróxido de potássio. Permitir que as camadas se separem. NOTA: Se a fase superior aspecto turvo, adicionar uma pequena quantidade de cloreto de sódio (por exemplo, 3 g de NaCl em 200 ml de solução) e agitar suavemente para dissolver. </li><li> Remover a fase inferior por drenagem através da torneira de passagem do funil. </li><li> Siga os passos de 1,10-1,13. </li><li> Dilui-se uma pequena quantidade (~ 3 mL) em 1 ml de 80% de acetona e medir o espectro de absorção a 440 nm de 80% de acetona. Para determinar a concentração de, utilizar o coeficiente médio de extinção para os carotenóides (ε 440 = 255) 16 na seguinte fórmula: carro [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (caminho óptico) = 1 cm. </li><li> Alíquotas e secar o carotenoids em um speedvac ou sob N 2 fluxo até que todos dietílico foi evaporado. Armazenar os pigmentos se a -80 ° C. </li></ol> 3. pigmento total e carotenóides Extração de Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Crescer C. reinhardtii em meio TAP sólido 17 em uma placa de Petri por espalhar uma pequena quantidade de líquido de cultura sobre a superfície. Crescer sob fluxo iluminação contínua de 20 mmol fotos PSA m -2 s -1 até uma camada verde de células é visível. </li><li> Utilizando uma ansa de inoculação estéril, colher uma pequena quantidade de C. reinhardtii, a partir do meio TAP sólido e colocou as células em 500 ml de meio de TAP 17, num balão de 1 L. Crescer a cultura a 25 ° C com 170 rpm de agitação sob um fluxo contínuo de iluminação 20 umol fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Após 5-6 dias, a cultura deve chegar ao fim da fase logarítmica (6 x 10 6 células / mlou 2-2,5 densidade óptica a 750 nm). Centrifuga-se a cultura a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Para a extração de pigmento total, siga os passos 1,6-1,15. </li><li> O rendimento do extracto total de pigmento a partir de 500 mL de cultura de crescimento de C. completo reinhardtii é de cerca de 5 ml de solução com uma concentração de 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Para a extração de carotenóides, siga os passos 2,2-2,12. </li></ol> 4. purificação de corpos de inclusão <ol><li> O clone da sequência de codificação da proteína de interesse LHC num vector de expressão que resulta em um C-terminal His fundidos usando procedimentos padrão de biologia molecular. Transformar este construto em E. estirpe hospedeira de E. coli, tal como BL21 (DE3). </li><li> Preparar tampão de lise, tampão detergente, tampão Triton, TE (Tabela 1), 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 18 de meio LB com os antibióticos apropriados. </li><li> Escolha um single E. colónia coli contendo o clone de expressão a partir de uma placa recentemente riscada em ~ 5 ml de meio LB com os antibióticos apropriados utilizando procedimentos padrão 6. Crescer a 37 ° C com 220 rpm de agitação durante pelo menos 16 horas. </li><li> Adicionar 2,5 ml de S / N de cultura num balão de Erlenmeyer de 1 L com 250 ml de LB suplementado com o antibiótico apropriado. </li><li> Crescer as células durante 2-3 horas (ou até que a OD 600 é ~ 0,6) a 37 ° C a 220 rpm. </li><li> Adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM. Continuar a crescer as células a 37 ° C com 220 rpm de 3-4 horas. </li><li> Centrifuga-se a cultura durante 10 min a 5000 xg, a 4 ° C em um tubo de centrífuga previamente pesado. Descartar o sobrenadante cuidadosamente e determinar o peso do sedimento de pesagem novo e subtraindo o peso do tubo de centrifugação. </li><li> Ressuspender o E. coli sedimento de células em 0,8 ml / g de tampão de lise por vórtice vigoroso. NOTA: Como alternativa, o sedimento de células podem ser congeladas a -80C para uso posterior. Se começando com um sedimento congelado, deixar descongelar completamente antes de adicionar o tampão de lise. </li><li> Adicionar 2 mg de lisozima por grama de células, e incuba-se em gelo molhado com vórtice ocasional durante 30 min. </li><li> Adiciona-se 20 ug / ml de DNAse, 10 mM de MgCl2, NaCl a 1 mM, 20 ug / ml de RNAse. Vortex e colocar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão frio de detergente por grama de células. Misturar bem e manter a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Transferência para tubos de centrífuga de 2 ml (dividida em dois tubos, se necessário). Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão frio Triton e voltar a suspender as pelotas por sons (3 pulsos x 5 seg poder x 50%, com intervalos de 20 segundos). NOTA: Tenha o tubo em um copo pequeno cercado por água gelada para manter a frio durante a sonorização. No caso de múltiplos tubos, combinar os corpos de inclusão novamente suspensas num tubo após a ressuspensão. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 12.000xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Repita o passo 4.13 e 4.14 duas vezes. </li><li> Ressuspender os corpos de inclusão em 1 ml de TE frio com sonificação para uma lavagem final para remover o tampão de Triton. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de frio TE por sonificação. </li><li> Avaliar a concentração de proteínas por meio de métodos padrão tais como o ensaio de Bradford 19. Armazenar alíquotas dos corpos de inclusão a -20 ° C. </li></ol> 5. Reconstituição Este protocolo resulta tipicamente 1-2 ml de proteína reconstituída com uma DO de 4, quando a absorvância é medida na região do Qy (600-750 nm). Quantidade pode ser ajustado como desejado, embora cuidados devem ser tomados para manter as proporções adequadas durante o procedimento. <ol><li> Prepare as seguintes soluções, conforme descrito na Tabela 1: 2x Reconstituição buffer, 20% OG, 2 M de KCl, TE. Execute o seguinte sPET na penumbra. </li><li> Ressuspender 800 ug de Corpos de Inclusão LHC em um total de 400 ul de TE, em um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Adicionar 400 mL da 2x Tampão de Reconstituição e vortex brevemente. </li><li> Adicionar 0,6 mL de β-mercaptoetanol (estoque de 14,8 M) para ter uma concentração final de 10 mM. Aquece-se a proteína por 1 min a 98 ° C. Vortex e brevemente lugar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Ressuspender 500 mg do total de pigmentos de clorofila secas mais 80 mg pigmentos carotenóides em 30 mL 100% EtOH por vórtex vigorosamente durante 1 minuto ou coloque em um banho de ultra-sons para 1-2 min. </li><li> Girar a mistura de pigmento ~ 30 seg a 15800 xg, a 4 ° C e confirmar que não há nenhum sedimento. Se houver um sedimento, repetir vórtex e / ou sonificação. Importante: Após a ressuspensão e centrifugação, adicionar imediatamente pigmento para a proteína, ou pode agregar e terá de ser novamente suspensas novamente. </li><li> Lentamente adicione a mistura de pigmentos para a proteína, enquanto arrefecida vórtex. Continue a vortex 5-10 sCE e coloque o tubo no gelo molhado. Tenha cuidado para não vortex com muita força, como a proteína pode transbordar o topo do tubo. </li><li> Adicionar 94 ul de 20% de octilo β-D-glucopiranósido (OG) (concentração final 2%), vortex brevemente e manter em gelo 10 min. </li><li> Adicionar 90 mL de KCl 2 M (concentração final de 150-200 mM), vortex brevemente e manter em gelo 20 min. NOTA: preparação da coluna (Secção 6) pode ser iniciado nesta altura. </li><li> Rotação durante 10 minutos a 15.800 xg, a 4 ° C. Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete (precipitado LDS) para um tubo de 10 ml. Manter frio e protegida da luz. </li></ol> 6. níquel Coluna Purificação <ol><li> Preparar as seguintes soluções, tal como descrito na Tabela 1: tampão de OG, tampão de lavagem de OG, tampão de eluição. </li><li> Conectar uma coluna de Ni-Sepharose (1 ml), ou equivalente a uma bomba peristáltica, assegurando que nenhum ar fica dentro da coluna durante este passo e os seguintes passos. </li><li> Defina a velocidade de tele bombear a 1 ml / min e lavar a coluna com 5-10 ml de água para remover a solução de armazenamento. </li><li> Equilibrar a coluna com 3-4 ml de tampão de OG. </li><li> Adicionar 3-4 ml de tampão de OG para a amostra de proteína e carga para a coluna. NOTA: se a proteína foi sentado no gelo por mais de 10 minutos após a remoção da LDS, girar novamente a 15.800 xg a 4 ° C durante 1 min para remover qualquer precipitação LDS adicional. </li><li> Lavar a coluna com 5 ml de tampão de OG. </li><li> Lavar a coluna com 2 ml de tampão de lavagem com OG. </li><li> Eluir a proteína ligada com tampão de eluição de 3 ml. Recolhe-se o eluato verde que contém a proteína reconstituída. NOTA: Este é geralmente de cerca de 1 ml no total. </li></ol> 7 Sacarose Centrifugação Gradiente <ol><li> Preparar as seguintes soluções, tal como descrito na Tabela 1: solução de sacarose, 0,06% β-MS, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Preencha tubos de ultracentrífuga com a solução de sacarose e congelamento a -20 ° CO / N or -80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li><li> Remover o tubo do congelador e deixar descongelar imperturbado a 4 ° C. NOTA: O processo de congelação / descongelação cria um gradiente de 0,1 a 1 M de sacarose. Um tubo de 15 ml, tipicamente cerca de degelo em 3 h. </li><li> Cuidadosamente remover a partir do topo do mesmo volume que a fracção verde eluída a partir da coluna de Sepharose de níquel no passo 6.8. Em seguida, coloque a amostra reconstituída em cima lentamente para evitar a perturbação do gradiente. </li><li> Tubos de equilíbrio e rotação em 200.000 xg a 4 ° C em uma ultracentrífuga usando um SW-41 ou SW-60 rotor basculante para 18 horas, a abrandar aceleração e parada, sem freios. </li><li> Retire cuidadosamente o gradiente do suporte do tubo com uma pinça. Usando uma seringa com uma agulha longa que tem uma abertura romba para recolher a fracção do topo. NOTA: Como alternativa, recolher fracções da parte inferior do tubo de perfuração com uma agulha e recolher gotas. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

As proteínas da membrana não são tão fáceis de estudar. O isolamento de proteínas de membrana nativa é complicado pela necessidade de solubilizar a bicamada lipídica com detergentes, o que pode danificar a proteína e remover cofactores essenciais. Estas proteínas também pode estar presente em níveis baixos em membranas biológicas, ou ser misturado com as proteínas intimamente relacionadas, como no caso dos complexos de colheita de luz, que faz com que a purificação dos complexos individuais difíceis. Expressão de proteínas heterólogas em E. coli e na reconstituição in vitro oferece a possibilidade de evitar estes problemas. in vitro reconstituição e purificação de proteínas dobradas resultados em complexos que possuem características muito semelhantes às dos complexos nativos 20,21,23 e, portanto, pode ser usado para estudar os complexos que não podem ser purificados até à homogeneidade 24 - 27. Este método utiliza o espinafre, a qual é facilmente attainable durante todo o ano, como uma fonte para o pigmento e carotenóides totais preparativos. Para algumas reconstituições de proteínas nativas em algas, a utilização de pigmentos purificados a partir de algas é preferido devido a diferentes composições de pigmento. O a / b razão Chl e relação / carro Chl permanece a mesma, independentemente da fonte de pigmento. É importante perceber que a eficiência da reconstituição é geralmente cerca de 35% 28. Assim, é necessário remover os pigmentos não-ligados e a apoproteína desdobrado a partir da solução depois da reconstituição. Um protocolo de purificação de dois passos é apresentado neste protocolo (ver também os resultados). No entanto, deve notar-se que o passo do gradiente de sacarose não permite a separação completa de apo e holo-proteína. Para a maioria das análises isto não é um problema, a apoproteína, como não contêm pigmentos e, portanto, não interferem com as medições funcionais. No entanto, no caso de ser necessário remover completamente a apoproteína do fração contendo o complexo reconstituído (por exemplo, para calcular o pigmento a estequiometria de proteína), uma coluna de permuta aniónica podem ser utilizados (ver Passarini et al. 2009 29 para detalhes). A capacidade para redobrar proteínas recombinantes de colheita de luz, com pigmentos isoladas in vitro, oferece a oportunidade de &quot;manipular&quot; os complexos modificando a reconstituição &quot;ambiente&quot; de vários modos, alterando assim as características do complexo resultante. Por exemplo, alterando a composição do pigmento durante a reconstituição pode resultar em um complexo com a composição de pigmento alterada. Esta característica pode ser utilizada para estudar a influência vários pigmentos têm sobre a estrutura e a estabilidade do complexo. Normalmente, a preparação do pigmento obtido de espinafre tem um a / b clorofila proporção de 3: 1 e uma proporção / chl carro de 2,9: 1. Este rácio tipicamente produz uma proteína reconstituída com as mesmas propriedades que o nAtive um. No entanto, o ajuste de um a / b clorofila proporção pela adição de uma purificado Chl ou b podem influenciar a ligação de diferentes pigmentos, devido à variação de selectividade dos locais de ligação de 30-33. Isto é possível porque a maior parte dos locais de ligação de pigmentos não são completamente selectivas para clorofila a ou clorofila b, mas pode acomodar ambos, embora com diferente afinidade 10,30,34. De um modo semelhante, os locais de ligação de carotenóides, também foram exibidas para ser capaz de acomodar mais do que uma espécie de xantofila 8,35 - 38. Diferentes reconstituições de CP26, outro complexo pigmento-proteína de plantas superiores, usando várias composições de pigmento estão apresentados na Tabela 2 39. Estas reconstituições foram usadas para avaliar a afinidade dos sítios de ligação específicos de pigmentos 39. É interessante notar que a fim de obter um complexo com o mesmo pigmento composição como uma nativa, a clorofila a relação a / b da mistura de pigmentos deve ser de 3: 1. Este parece ser o caso para todos os complexos do LHC de plantas superiores 20,40. A combinação de biologia molecular, com a técnica de reconstituição permite que as propriedades de um complexo de ligação a clorofila a ser estudado em mais detalhe. A importância dos diferentes domínios de proteínas na estabilidade e dobramento dos complexos, ou o seu envolvimento nas interações proteína-proteína, foram determinados por truncar a apoproteína ou realizar mutagênese aleatória 8,41 - 44. Resíduos de aminoácidos standard importantes para a coordenação das diferentes pigmentos pode ser alterado através de mutagénese dirigida ao local, de modo a analisar as propriedades de pigmentos individuais ou avaliar a sua contribuição para a função e estabilidade do complexo de 10,28,29,45 - 52. Figura 6 mostra reconstituído Lhcb4 (CP29) comuma mutação da histidina na posição 216 53. Uma comparação da composição de pigmento de tipo selvagem e mutantes de complexos indica que a mutação induz a perda de uma molécula de clorofila a, indicando que o sítio alvo acomoda um um Chl no complexo WT. As diferenças do espectro de absorção de WT e mutantes, mediante a normalização para o teor de pigmentos, também mostra as propriedades de absorção do pigmento perdido. Neste caso, a diferença pode ser visto no pico principal a 680 nm, o que indica que a clorofila a coordenada por His216 absorve a este comprimento de onda (para mais detalhes sobre este mutante e as propriedades espectroscópicas ver Mozzo et al. 2,008 53). Análise de mutação também pode ser utilizado para determinar o efeito do ambiente nas propriedades espectroscópicas dos pigmentos 54. Em conclusão, as proteínas de colheita de luz pode facilmente ser reconstituída in vitro, resultando em pigmento-protein complexos com propriedades muito semelhantes aos complexos nativos. Deste modo, as dificuldades de isolamento de proteínas nativas são eliminados, ao mesmo tempo, proporcionando a preparação de proteínas com elevado rendimento e grau de pureza para mais estudos. A importância de uma proporção 3: a / b clorofila 1 na produção de um complexo autêntico é enfatizado, e exemplos de tipo selvagem reconstituído e CLS mutantes são fornecidos para ilustrar as aplicações da técnica.

O aparato fotossintético das plantas e algas incluem proteínas integrais de membrana que se ligam clorofila a (chl a), b (chl b) e carotenóides (carro). Estes complexos proteína-pigmento são ativos na captação de energia luz e transferir essa energia de excitação para os centros de reação, onde é usado para promover a separação de carga 2. Eles também estão envolvidos em mecanismos de feedback reguladoras que protegem o aparato fotossintético contra danos luz alta 3,4. Os complexos de colheita de luz (CLS) são constituídos por uma grande família de proteínas relacionadas de plantas e algas 5. A purificação homogênea de cada membro da família tem sido complicada pelas propriedades químicas e físicas muito semelhantes dos complexos. Além disso, os procedimentos de purificação, muitas vezes resultam em perda de pigmentos ou de outros co-factores potenciais, tais como lípidos. In vitro represen reconstituiçãots um poderoso método para ultrapassar estes problemas. O LHC associada com fotossistema II (LHC-II) foi reconstituído primeiro in vitro por Plumley e Schmidt em 1987 1. Os investigadores proteína extraída delipidado e pigmentos separadamente a partir de cloroplastos de plantas e, em seguida, combinada a proteína desnaturada com calor pigmentos na presença de lítio dodecilsulfato (LDS), seguido por três ciclos de congelamento e descongelamento 1. Eles demonstraram que as propriedades espectrais dos complexos reconstituídos LHC foram muito semelhantes para os complexos purificados a partir de plantas. A facilidade de reconstituição de complexos proteína-pigmento LHC, provavelmente devido a alguma característica de auto-montagem inerente, juntamente com a dificuldade de isolar complexos purificados a partir de organismos, levou à rápida adoção do método por outros pesquisadores. A reconstituição de proteínas fotossintéticas expresso em Escherichia coli (E. coli) foi obtida por Paulsen e colegas em 1990 6. Em E.coli, as proteínas da membrana sobreexpressos são normalmente contidos em corpos de inclusão, que as respectivas instalações de purificação. A reconstituição é conseguido através de desnaturação térmica dos corpos de inclusão contendo a proteína recombinante na presença de LDS, seguido pela adição de pigmentos, que inicia o enrolamento de proteínas. Dobragem do complexo LHCII é um processo de dois passos: primeiro, a clorofila é ligado em menos de 1 min; segundo, a clorofila b é obrigado e estabilizado ao longo de vários minutos 7. Além de proporcionar uma visão da dinâmica de dobragem, na reconstituição in vitro combinada com mutagénese dirigida para o local permitiu a identificação de aminoácidos específicos importantes para a estabilidade (por exemplo, 8,9) ou a coordenação de pigmento (por exemplo, 10). Manipulação de redobramento condições de ajustar os parâmetros tais como a composição pigmento ou detergentes também identificaram elementos critical para a dobragem adequada, tais como a exigência de Xantofilas para o complexo LHCII (por exemplo, 1,11). Além disso, a investigação das propriedades de pigmentos individuais ligados aos complexos foi possível utilizando complexos reconstituídos in vivo (por exemplo, 10). O método descrito aqui começa com o isolamento de pigmentos (clorofilas e carotenóides) a partir de espinafres e a alga verde Chlamydomonas reinhardtii. A expressão e purificação de uma proteína a partir de E. LHC coli na forma de corpos de inclusão é então descrito, seguindo-se a reconstituição de LHC e subsequente purificação por coluna de afinidade com Ni. No último passo, os complexos reconstituídos são ainda purificado por centrifugação em gradiente de sacarose para remover pigmentos livres e apoproteína desdobrado. Este protocolo representa um procedimento otimizado incorporando várias modificações que foram introduzidas por diferentes laboratórios maistempo 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Nas plantas e algas verdes, a luz é capturado pelos complexos absorvedores da luz (CLS), uma família de proteínas de membrana integrais que coordenam clorofilas e carotenóides. In vivo, estas proteínas são dobradas com pigmentos para formar complexos que são inseridas na membrana de tilacoide do cloroplasto. A alta similaridade nas propriedades químicas e físicas dos membros da família, junto com o fato de que eles podem facilmente perder pigmentos durante o isolamento, faz sua purificação em estado nativo desafiador. Uma abordagem alternativa para a obtenção de preparações homogéneas de CLS foi desenvolvido por Plumley e Schmidt em 1987 1, que demonstraram que era possível reconstituir estes complexos in vitro, a partir de pigmentos de apoproteínas purificadas e desdobradas, resultando em complexos com propriedades muito semelhantes às do nativa complexos. Isto abriu o caminho para a utilização de proteínas recombinantes expressas bacterianas in vitro </em&gt; reconstituição. O método de reconstituição é poderosa por várias razões: (1) preparações de complexos puros individuais podem ser obtidos, (2) a composição de pigmento pode ser controlado para avaliar a sua contribuição para a estrutura e função, (3) as proteínas recombinantes podem ser mutados para estudar o funcional papel dos resíduos individuais (por exemplo, locais de ligação de pigmento) ou domínio da proteína (por exemplo, a interacção proteína-proteína, dobragem). Este método foi optimizado em vários laboratórios e aplicada à maior parte dos complexos de luz-colheita. O protocolo descrito aqui detalha o método de reconstituição de complexos de luz-colheita in vitro atualmente utilizados em nosso laboratório, e exemplos que descrevem aplicações do método são fornecidos.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K visualizações.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

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Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparação de Desenvolvimento e Adultos Drosophila Brains e retina de imagens ao vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Biologia

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Única molécula-Imaging dos Transportes Nuclear

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Reconstituição bioquímica de receptor de esteróide • Hsp90 Complexos de Proteínas e Reativação da ligação do ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

Análise in vitro de PDZ-dependentes Complexos Macromoleculares CFTR Sinalização

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Reconstituição de β-catenina degradação na<em&gt; Xenopus</em&gt; Extrato de ovo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medindo espacial e temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstituição funcional e atividade do canal Medidas de purificada tipo selvagem e mutante CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

A validação de um modelo de camundongo para Disrupt Complexos LINC de um modo específico de célula

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

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