Name: in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1 Totale Pigmento Estrazione da foglie di spinaci <ol><li> Omogeneizzare una manciata di foglie di spinaci (~ 20 g) in 100 ml di freddo Grinding Buffer (vedi Tabella 1) con un frullatore per 20 sec. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso due strati di tessuto di nylon con un diametro dei pori di 20 micron e centrifugare il filtrato a 1.500 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet contenente i cloroplasti con un morbido artisti pennello di vernice in 1 ml di tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1). Una volta che il pellet viene risospeso, aggiungere 50 ml di tampone di lavaggio e centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet (tilacoidi) in 50 ml di tampone di lavaggio (vedi Tabella 1). </li><li> Centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e rimuovere completamente il surnatante. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l&#39;ossidazione del pigmento. </li&gt; <li> Aggiungi ~ 20 ml di acetone 80% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi tabella 1) per estrarre i pigmenti. Lasciare la soluzione in ghiaccio per 10 minuti, vortex di tanto in tanto. </li><li> Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 1.6 deve essere ripetuto. </li><li> Raccogliere il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere 0,4 volumi di dietiletere, agitare vigorosamente e aprire la valvola di sfogo del gas. </li><li> Aggiungere 0,8 volumi di 0,33 M NaCl e mescolare energicamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea sopra contiene i pigmenti estratti. Rimuovere la fase inferiore chiara. NOTA: Se la separazione non è chiara, congelare e scongelare la soluzione per migliorare la separazione di fase. </li><li> Rimuovere l&#39;etere versandolo dall&#39;alto della imbuto separatore in un contenitore di vetro adatto. Secco con l&#39;aggiunta di un cucchiaio di granlare solfato di sodio anidro. Agitare la soluzione e lasciare ~ 5 min per l&#39;essiccante per assorbire l&#39;acqua dall&#39;etere. NOTA: Ripetere questo passaggio se il solfato di sodio appare completamente raggruppata insieme; ci dovrebbero essere alcuni cristalli liberi di fluttuare quando l&#39;etere è sufficientemente asciugato. Se si forma un velo d&#39;acqua, rimuovere questo con una pipetta Pasteur prima di aggiungere ulteriore solfato di sodio anidro. </li><li> Decantare l&#39;etere di un nuovo contenitore di vetro, lasciando il solfato di sodio solido dietro. </li><li> Si evapora l&#39;etere in un speedvac rotativo o sotto flusso di N 2. </li><li> Sciogliere i pigmenti completamente in 10 ml di acetone 100%. </li><li> Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento e determinare l&#39;a / b rapporto Chl e la concentrazione di Chl con il metodo descritto da Porra et al. (1989) 15. </li><li> Aliquota e asciugare i pigmenti in una speedvac rotativo o sotto N 2 fino a quando il flusso di acetone ècompletamente evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. </li></ol> 2 Estrazione di carotenoidi da spinaci <ol><li> Seguire i passaggi da 1.1 a 1.5. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l&#39;ossidazione del pigmento. </li><li> Risospendere il pellet tilacoidi in ~ 50 ml di etanolo al 96% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi Tabella 1) per estrarre i pigmenti. La soluzione viene lasciata in ghiaccio per 5 min. </li><li> Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 2.2 deve essere ripetuto. </li><li> Raccogliere il surnatante e aggiungere 0,1 volume del 80% KOH (w / v) per avviare saponificazione. </li><li> Lasciare la soluzione a 4 ° CO / N, ben chiuso e al riparo dalla luce. </li><li> Raccogliere la soluzione in un imbuto separatore. Aggiungere 1 volume di etere etilico e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 0,8 volUmes di 0,33 M NaCl e mescolare delicatamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea arancione sulla parte superiore contiene i carotenoidi saponificati. Rimuovere la fase inferiore verde drenando attraverso il rubinetto dell&#39;imbuto. </li><li> Aggiungere 3 volumi di acqua e mescolare delicatamente per rimuovere l&#39;idrossido di potassio. Lasciare che gli strati si separino. NOTA: Se la fase superiore appare torbido, aggiungere una piccola quantità di NaCl (ad esempio, 3 g di NaCl in 200 ml di soluzione) e miscelare delicatamente per sciogliere. </li><li> Rimuovere la fase inferiore di drenaggio attraverso il rubinetto dell&#39;imbuto. </li><li> Seguire i passaggi da 1,10-1,13. </li><li> Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento a 440 nm nel 80% acetone. Per determinare la concentrazione, utilizzare l&#39;estinzione media coefficiente per i carotenoidi (ε 440 = 255) 16 nel seguente formula: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (cammino ottico) = 1 cm. </li><li> Aliquota e asciugare il carotenoids in un speedvac o sotto N 2 torrente fino a quando tutti etere etilico è stato evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. </li></ol> 3 Totale pigmento e carotenoide Estrazione da Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Grow C. reinhardtii su terreno solido TAP 17 in una capsula di Petri diffondendo una piccola quantità di coltura liquido sulla superficie. Crescere sotto illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1 fino a uno strato verde di cellule è visibile. </li><li> Utilizzando un&#39;ansa da inoculo sterile, raccogliere una piccola quantità di C. reinhardtii dal mezzo TAP solida e mettere le cellule in 500 ml di TAP media 17 in un pallone da 1 L. Far crescere la coltura a 25 ° C con 170 giri al minuto, agitando sotto un&#39;illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1. </li><li> Dopo 5-6 giorni, la cultura dovrebbe raggiungere la fine della fase logaritmica (6 x 10 6 cellule / mlo 2-2,5 densità ottica a 750 nm). Centrifugare la cultura a 4.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Per l&#39;estrazione totale del pigmento, seguire i passaggi 1,6-1,15. </li><li> La resa di estratto totale pigmento a partire da 500 ml di coltura piena crescita di C. reinhardtii è di circa 5 ml di soluzione con una concentrazione di 0,5 mg Chl a + b / ml. </li><li> Per l&#39;estrazione carotenoidi, seguire i passaggi 2,2-2,12. </li></ol> 4 Purificazione di corpi di inclusione <ol><li> Clonare la sequenza codificante della proteina LHC di interesse in un vettore di espressione che si traduce in un C-terminale sua tag fuso utilizzando le procedure di biologia molecolare standard. Trasforma questo costrutto in E. ceppo ospite coli come BL21 (DE3). </li><li> Preparare il tampone di lisi, tampone detergente, buffer di Triton, TE (Tabella 1), 1 M isopropilici β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e terreno LB 18 con gli antibiotici appropriati. </li><li> Scegli una single E. coli colonia contenente il clone di espressione da un piatto appena striato in ~ 5 ml di terreno LB con gli antibiotici appropriati utilizzando le procedure standard 6. Crescere a 37 ° C con 220 rpm agitazione per almeno 16 ore. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di O / N cultura in un pallone da 1 L Erlenmeyer con 250 ml di LB integrate con l&#39;antibiotico appropriato. </li><li> Crescere le cellule per 2-3 ore (o fino a quando l&#39;OD 600 è ~ 0.6) a 37 ° C a 220 giri al minuto. </li><li> Aggiungi IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Continua a crescere le cellule a 37 ° C con 220 giri 3-4 ore. </li><li> Centrifugare la coltura per 10 min a 5000 xga 4 ° C in una provetta da centrifuga pre-pesato. Eliminare il supernatante a fondo e determinare il peso del pellet pesando di nuovo e sottraendo il peso provetta da centrifuga. </li><li> Risospendere il E. pellet di cellule coli in 0,8 ml / g di tampone di lisi nel vortex vigorosa. NOTA: In alternativa, il pellet cellulare può essere congelato a -80C per un uso successivo. Se a partire da un pellet congelato, lasciar scongelare completamente prima di aggiungere il tampone di lisi. </li><li> Aggiungere 2 mg di lisozima per grammo di cellule, e incubare in ghiaccio con vortex occasionale per 30 min. </li><li> Aggiungere 20 mg / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 mg / ml RNAsi. Vortex e mettere in ghiaccio per 30 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone detergente a freddo per grammo di cellule. Mescolare bene e tenere RT per 5 min. </li><li> Trasferimento a 2 ml provette da centrifuga (diviso in due tubi, se necessario). Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone freddo Triton e risospendere completamente il pellet da sonicazione (3 impulsi x 5 sec x 50% di potenza con intervalli di 20 sec). NOTA: Avere il tubo in un piccolo bicchiere circondato da acqua ghiacciata per mantenerlo freddo durante la sonificazione. Nel caso di più tubi, combinare i corpi di inclusione risospeso in una provetta dopo risospensione. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 12.000xga 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Ripetere il punto 4.13 e 4.14 due volte. </li><li> Risospendere i corpi di inclusione in 1 ml di freddo TE con sonification per un lavaggio finale per rimuovere il buffer di Triton. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di freddo TE di sonificazione. </li><li> Valutare la concentrazione di proteine ​​con metodi standard come il saggio Bradford 19. Conservare aliquote dei corpi di inclusione a -20 ° C. </li></ol> 5. Ricostituzione Questo protocollo produce tipicamente 1-2 ml di proteine ​​ricostituito con un diametro esterno di 4 quando assorbanza viene misurata nella regione Qy (600-750 nm). Quantità può essere regolata a piacere, anche se occorre prestare attenzione per mantenere i rapporti corretti durante la procedura. <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: 2x Tampone di ricostituzione, il 20% OG, 2 M KCl, TE. Eseguire il seguente sPTO in penombra. </li><li> Risospendere 800 mg di corpi di inclusione LHC in un totale di 400 microlitri TE in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. Aggiungere 400 ml di tampone di ricostituzione 2x e vortex brevemente. </li><li> Aggiungere 0,6 ml di β-mercaptoetanolo (archivio 14.8 M) per avere una concentrazione finale di 10 mM. Riscaldare la proteina per 1 min a 98 ° C. Vortex brevemente e posto a temperatura ambiente per 3 min. </li><li> Risospendere 500 mg del totale dei pigmenti di clorofilla secchi più 80 mg pigmenti carotenoidi in 30 microlitri 100% EtOH vigorosamente vortex per 1 minuto o posto in un bagno sonicatore per 1-2 min. </li><li> Gira la miscela pigmento ~ 30 sec a 15.800 xg a 4 ° C e verificare che non vi è alcun pellet. Se c&#39;è un pellet, ripetere vortex e / o sonicazione. IMPORTANTE: Dopo la risospensione e centrifuga, aggiungere subito pigmento alla proteina, oppure può aggregare e dovrà essere risospeso di nuovo. </li><li> Aggiungere lentamente la miscela pigmento alla proteina raffreddato mentre vortex. Continuare a vortice 5-10 sec provetta e collocarla sul ghiaccio bagnato. Fare attenzione a non vortice troppo energicamente come la proteina può traboccare la parte superiore del tubo. </li><li> Aggiungere 94 ml di 20% Octyl β-D-glucopiranoside (OG) (concentrazione finale 2%), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 10 min. </li><li> Aggiungere 90 ml di KCl 2 M (concentrazione finale 150-200 mM), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 20 min. NOTA: Preparazione della colonna (sezione 6) possono essere avviati in questo momento. </li><li> Spin per 10 min a 15.800 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet (precipitato LDS) in una provetta da 10 ml. Mantenere freddo e al riparo dalla luce. </li></ol> 6 Nickel colonna di purificazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: tampone OG, buffer di risciacquo OG, tampone di eluizione. </li><li> Collegare una colonna Ni-Sepharose (1 ml) o equivalente ad una pompa peristaltica assicurare che l&#39;aria penetri all&#39;interno della colonna durante questa fase e le seguenti operazioni. </li><li> Impostare la velocità di tsi pompa a 1 ml / min e risciacquare la colonna con 5-10 ml di acqua per rimuovere la soluzione di archiviazione. </li><li> Equilibrare la colonna con 3-4 ml di tampone OG. </li><li> Aggiungere 3-4 ml di tampone OG al campione proteico e carico alla colonna. NOTA: se la proteina è stato seduto sul ghiaccio per più di 10 minuti dopo la rimozione di LDS, girare di nuovo a 15.800 xg a 4 ° C per 1 min per rimuovere qualsiasi precipitazione LDS aggiuntivo. </li><li> Lavare la colonna con 5 ml di tampone OG. </li><li> Lavare la colonna con 2 ml di tampone OG risciacquo. </li><li> Eluire le proteine ​​con 3 ml di tampone di eluizione. Raccogliere il eluire verde che contiene la proteina ricostituita. NOTA: Questo è di solito di circa 1 ml in totale. </li></ol> 7 centrifugazione in gradiente di saccarosio <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: soluzione di saccarosio, 0,06% β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Riempire i tubi ultracentrifuga con la soluzione di saccarosio e congelare a -20 ° CO / N or -80 ° C per almeno 1 ora. </li><li> Togliere la provetta dal freezer e lasciare scongelare indisturbati a 4 ° C. NOTA: Il processo di congelamento / scongelamento crea un gradiente 0,1-1 M saccarosio. Un tubo da 15 ml si scioglie di solito in circa 3 ore. </li><li> Rimuovere con cautela dalla parte superiore lo stesso volume la frazione verde eluito dalla colonna Sepharose nichel al punto 6.8. Poi caricare il campione ricostituito in cima lentamente per evitare di disturbare il gradiente. </li><li> Saldo tubi e centrifugare a 200.000 xg a 4 ° C in un&#39;ultracentrifuga utilizzando un rotore secchio SW-41 o SW-60 oscillante per 18 ore, impostare a rallentare l&#39;accelerazione e arresto senza freni. </li><li> Togliere la sfumatura dal supporto tubo con una pinza. Utilizzare una siringa con un ago lungo che ha una apertura smussato per raccogliere la frazione dall&#39;alto. NOTA: In alternativa, raccogliere frazioni dal fondo forando il tubo con un ago e di raccolta gocce. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Le proteine ​​di membrana non sono così facili da studiare. Isolamento delle proteine ​​di membrana native è complicata dalla necessità di solubilizzare il doppio strato lipidico con detergenti, che possono danneggiare le proteine ​​e rimuovere cofattori essenziali. Queste proteine ​​possono essere presenti anche a bassi livelli nelle membrane biologiche, o essere mescolato con proteine ​​strettamente correlate, come nel caso dei complessi di raccolta della luce, che rende la purificazione dei singoli complessi difficili. Espressione della proteina eterologa in E. coli e ricostituzione in vitro offre la possibilità di evitare questi problemi. ricostituzione in vitro e purificazione di proteine ​​ripiegate risultati in complessi che possiedono caratteristiche molto simili a quelle dei complessi nativi 20,21,23 e quindi può essere usato per studiare complessi che non possono essere purificate all&#39;omogeneità 24 - 27. Questo metodo utilizza spinaci, che è facilmente attainabtutto l&#39;anno le, come fonte per il totale dei pigmenti carotenoidi e preparati. Per alcune ricostruzioni di proteine ​​native per le alghe, l&#39;uso di pigmenti purificati dalle alghe è preferito a causa di diverse composizioni pigmento. L&#39;a / b rapporto Chl e rapporto / auto Chl rimane lo stesso indipendentemente dalla fonte pigmento. È importante rendersi conto che l&#39;efficienza della ricostituzione è di solito intorno al 35% 28. Quindi è necessario rimuovere i pigmenti non vincolato e l&#39;apoproteina spiegato dalla soluzione dopo la ricostituzione. Un protocollo di purificazione a due fasi è presentato in questo protocollo (vedi anche i risultati). Tuttavia, va notato che la fase gradiente di saccarosio non permette la completa separazione di apo e olo-proteina. Per la maggior parte delle analisi questo non è un problema, in quanto la apoproteina non contiene pigmenti e quindi non interferisce con le misurazioni funzionali. Tuttavia, nel caso sia necessario rimuovere completamente l&#39;apoproteina dal frazione contenente il complesso ricostituito (per esempio, per calcolare il pigmento di proteina stechiometria), una colonna di scambio anionico può essere usato (vedere Passarini et al 2009 29 per i dettagli.). La capacità di ripiegare le proteine ​​ricombinanti di raccolta luce con pigmenti isolate in vitro offre la possibilità di &quot;manipolare&quot; i complessi modificando la ricostituzione &quot;ambiente&quot; in vari modi, cambiando così le caratteristiche del complesso risultante. Ad esempio, modificando la composizione del pigmento durante la ricostituzione può risultare in un complesso con la composizione del pigmento alterato. Questa caratteristica può essere utilizzata per studiare l&#39;influenza vari pigmenti hanno sulla struttura e la stabilità del complesso. Solitamente la preparazione pigmento ottenuto da spinaci ha un rapporto Chl a / b di 3: 1 e un rapporto / auto Chl di 2,9: 1. Questo rapporto produce tipicamente una proteina ricostituita con le stesse proprietà del native uno. Tuttavia, la regolazione del rapporto Chl a / b con l&#39;aggiunta di una o purificato Chl b può influenzare il legame di differenti pigmenti dovuti al variare selettività dei siti di legame 30-33. Ciò è possibile perché la maggior parte dei siti di legame di pigmento non sono completamente selettivo per Chl una o Chl b, ma può alloggiare, sebbene con differente affinità 10,30,34. In modo simile, i siti di legame di carotenoidi sono stati anche dimostrato di essere in grado di ospitare più di una specie xantofilla 8,35 - 38. Diverse ricostruzioni di CP26, un altro complesso pigmento-proteina di piante superiori, utilizzando varie composizioni di pigmento sono riportati nella tabella 2 39. Queste ricostruzioni sono stati utilizzati per valutare l&#39;affinità di siti per particolari pigmenti 39 vincolante. È interessante notare che, al fine di ottenere un complesso con lo stesso pigmento composizione come quella nativa, il rapporto Chl a / b della miscela pigmento deve essere di 3: 1. Questo sembra essere il caso per tutti i complessi LHC di piante superiori 20,40. La combinazione di biologia molecolare con la tecnica ricostituzione permette le proprietà di un complesso Chl vincolante da studiare più dettagliatamente. L&#39;importanza dei diversi domini proteici sulla stabilità e la piegatura dei complessi, o il loro coinvolgimento nelle interazioni proteina-proteina, sono stati determinati troncando il apoproteina o l&#39;esecuzione di mutagenesi casuale 8,41 - 44. Residui amminoacidici singolo importanti per il coordinamento dei diversi pigmenti possono essere modificati mediante mutagenesi sito-diretta per analizzare le proprietà dei singoli pigmenti o valutare il loro contributo alla funzione e la stabilità del complesso 10,28,29,45 - 52. La figura 6 mostra ricostituiti Lhcb4 (CP29) conuna mutazione della istidina in posizione 216 53. Un confronto della composizione pigmento di tipo selvatico e complessi mutanti mostra che la mutazione induce la perdita di una Chl una molecola, che indica che il sito mirato ospita un un Chl nel complesso WT. Le differenze degli spettri di assorbimento di WT e mutanti, sulla normalizzazione al contenuto di pigmento, mostra anche le proprietà di assorbimento del pigmento perduta. In questo caso, la differenza può essere visto nel picco principale a 680 nm, che indica che la Chl a coordinato da His216 assorbe a questa lunghezza d&#39;onda (per maggiori dettagli su questo mutante e le proprietà spettroscopiche vedono Mozzo et al. 2008 53). L&#39;analisi di mutazione può anche essere usato per determinare l&#39;effetto dell&#39;ambiente sulle proprietà spettroscopiche dei pigmenti 54. In conclusione, le proteine ​​di raccolta della luce possono facilmente essere ricostituito in vitro con conseguente pigmento-Protein complessi con proprietà molto simili a complessi nativi. In questo modo, le difficoltà di isolare proteine ​​native sono eliminati, offrendo anche la preparazione di proteine ​​con elevata resa e purezza per ulteriori studi. L&#39;importanza di un 3: 1 Chl rapporto a / b nella produzione di un complesso autentica è sottolineato, ed esempi di tipo selvatico ricostituito e LHCs mutanti sono forniti per illustrare le applicazioni della tecnica.

L&#39;apparato fotosintetico delle piante e alghe comprendono proteine ​​integrali di membrana che legano clorofilla a (chl a), b (chl b) e carotenoidi (auto). Questi complessi pigmento-proteina sono attive in energia luminosa raccolta e il trasferimento di energia di eccitazione che ai centri di reazione, dove viene utilizzato per promuovere la separazione di carica 2. Essi sono anche coinvolti in meccanismi di feedback regolatori che proteggono l&#39;apparato fotosintetico dai danni luce alta 3,4. I complessi di raccolta della luce (LHCs) sono costituiti da una grande famiglia di proteine ​​correlate nelle piante e alghe 5. La purificazione omogenea di ciascun membro della famiglia è stata complicata dalle proprietà chimiche e fisiche molto simili complessi. Inoltre, le procedure di purificazione causano spesso la perdita di pigmenti o altri potenziali cofattori, come i lipidi. In vitro rappre ricostituzionets un potente metodo per superare questi problemi. L&#39;LHC associato Fotosistema II (LHC-II) è stato ricostituito in vitro da Plumley e Schmidt nel 1987 1. I ricercatori hanno estratto proteico delipidato e pigmenti separatamente dai cloroplasti vegetali, e poi combinati proteina calore denaturato con pigmenti in presenza di Litio Dodecyl Sulfate (LDS), seguito da tre cicli di congelamento e scongelamento 1. Essi hanno dimostrato che le proprietà spettrali dei complessi LHC ricostituiti erano molto simili a complessi purificati dalle piante. La facilità di ricostituire LHC complessi pigmento-proteina, probabilmente a causa di qualche funzione di auto-assemblaggio inerente, insieme con la difficoltà di isolare complessi purificati da organismi, ha portato alla rapida adozione del metodo da altri ricercatori. La ricostituzione delle proteine ​​fotosintetiche sovraespresse in Escherichia coli (E. coli) è stato raggiunto da Paulsen e colleghi nel 1990 6. In E.coli, proteine ​​di membrana sovraespresse sono in genere contenute in corpi di inclusione, che loro servizi di depurazione. Ricostituzione è ottenuta attraverso denaturazione termica dei corpi di inclusione contenenti la proteina ricombinante in presenza di LDS, seguita dall&#39;aggiunta di pigmenti che avvia il ripiegamento delle proteine. Pieghevole del complesso LHCII è un processo in due fasi: in primo luogo, la clorofilla a è legato in meno di 1 minuto; secondo, clorofilla b è legato e stabilizzato nell&#39;arco di diversi minuti 7. Oltre a fornire comprensione delle dinamiche pieghevoli, in ricostituzione vitro in combinazione con mutagenesi sito-diretta ha permesso l&#39;individuazione di specifici aminoacidi importanti per la stabilità (ad esempio, 8,9) o coordinamento pigmento (ad esempio, 10). Manipolazione delle condizioni regolando parametri quali la composizione del pigmento o detergenti ripiegamento hanno inoltre individuato elementi critical per la corretta piegatura, come l&#39;obbligo di xantofille per il complesso LHCII (es, 1,11). Inoltre, studio delle proprietà dei singoli pigmenti legati ai complessi &#39;stato possibile utilizzando complessi ricostituiti in vivo (ad esempio, 10). Il metodo qui descritto inizia con isolamento di pigmenti (clorofille e carotenoidi) dal spinaci e il verde alga Chlamydomonas reinhardtii. L&#39;espressione e la purificazione di una proteina LHC da E. coli in forma di corpi di inclusione viene poi dettagliato, seguita dalla ricostituzione di LHC e successiva purificazione mediante colonna di affinità Ni. Nella fase finale, i complessi ricostituite sono ulteriormente purificati mediante centrifugazione su gradiente di saccarosio per rimuovere i pigmenti liberi e apoproteina spiegato. Questo protocollo rappresenta un procedimento ottimizzato incorpora varie modifiche che sono state introdotte da diversi laboratori oltretempo 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Nylon cloth&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>Soft artists paint brush&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &amp;beta;-D-glucopyranoside</td><td>Sigma</td><td>O8001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP medium</td><td></td><td></td><td>see reference 17</td></tr><tr><td>LB medium</td><td></td><td></td><td>see reference 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

Nelle piante e alghe verdi, la luce viene catturato dai complessi luce-raccolta (LHCs), una famiglia di proteine ​​integrali di membrana che coordinano clorofille e carotenoidi. In vivo, queste proteine ​​sono piegati con pigmenti per formare complessi che vengono inseriti nella membrana tilacoidale del cloroplasto. L&#39;elevata somiglianza nelle proprietà chimiche e fisiche dei membri della famiglia, unitamente al fatto che essi possono facilmente perdere pigmenti durante l&#39;isolamento, rende la loro purificazione in uno stato nativo impegnativo. Un approccio alternativo per ottenere preparazioni omogenee di LHCs è stato sviluppato da Plumley e Schmidt nel 1987 1, che ha mostrato che era possibile ricostituire questi complessi in vitro a partire da pigmenti purificati e apoproteine ​​spiegate, con conseguente complessi con proprietà molto simili a quelle del nativo complessi. Questo apre la strada all&#39;uso delle proteine ​​ricombinanti espresse batteriche in vitro </em&gt; ricostituzione. Il metodo di ricostituzione è potente per vari motivi: (1) le preparazioni pure di singoli complessi possono essere ottenuti, (2) la composizione del pigmento può essere controllato per valutare il loro contributo alla struttura e funzione, (3) le proteine ​​ricombinanti possono essere mutati per studiare il funzionale ruolo dei singoli residui (ad esempio, siti di legame pigmento) o dominio proteine ​​(ad esempio, l&#39;interazione proteina-proteina, pieghevole). Questo metodo è stato ottimizzato in vari laboratori e applicato alla maggior parte dei complessi di luce raccolta. Il protocollo qui descritto in dettaglio il metodo di ricostituzione complessi luce-raccolta in vitro attualmente in uso nel nostro laboratorio, e sono forniti esempi che descrivono applicazioni del metodo.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K Views.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Water in Oil Emulsions: A New System for Assembling Water-soluble Chlorophyll-binding Proteins with Hydrophobic Pigments

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. Their functionality critically depends on their specific organization within large and elaborate multisubunit transmembrane protein complexes. In order to understand at the molecular level how these complexes facilitate solar energy conversion, it is essential to understand protein-pigment, and pigment-pigment interactions, and their effect on excited dynamics. One way of gaining such understanding is by constructing and studying complexes of Chls with simple water-soluble recombinant proteins. However, incorporating the lipophilic Chls and BChls into water-soluble proteins is difficult. Moreover, there is no general method, which could be used for assembly of water-soluble proteins with hydrophobic pigments. Here, we demonstrate a simple and high throughput system based on water-in-oil emulsions, which enables assembly of water-soluble proteins with hydrophobic Chls. The new method was validated by assembling recombinant versions of the water-soluble chlorophyll binding protein of Brassicaceae plants (WSCP) with Chl a. We demonstrate the successful assembly of Chl a using crude lysates of WSCP expressing E. coli cell, which may be used for developing a genetic screen system for novel water-soluble Chl-binding proteins, and for studies of Chl-protein interactions and assembly processes.

This manuscript describes a simple and high-throughput method for assembling water-soluble proteins with hydrophobic pigments that is based on water-in-oil emulsions. We demonstrate the effectiveness of the method in the assembly of native chlorophylls with four variants of recombinant water-soluble-chlorophyll binding proteins (WSCPs) of Brassica plants expressed in E. coli.

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine ​​clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Chlorophylls (Chls) and bacteriochlorophylls (BChls) are the primary cofactors that carry out photosynthetic light harvesting and electron transport. ...

Ricerca

Chimica

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy transfer processes in the thylakoid membrane of chloroplasts. The light harvesting antenna of diatoms, the so called fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP), are required for the light absorption and efficient transfer to the photosynthetic reaction centers as well as for photo-protection from excessive light. The switch between these two functions is a long-standing matter of research. Many of these studies have been carried out with FCP in detergent micelles. For interaction studies, the detergents have been removed, which led to an unspecific aggregation of FCP complexes. In this approach, it is hard to discriminate between artifacts and physiologically relevant data. Hence, more valuable information about FCP and other membrane bound light harvesting complexes can be obtained by studying protein-protein interactions, energy transfer and other spectroscopic features if they are embedded in their native lipid environment. The main advantage is that liposomes have a defined size and a defined lipid/protein ratio by which the extent of FCP clustering is controlled. Further, changes in the pH and ion composition that regulate light harvesting in vivo can easily be simulated. In comparison to the thylakoid membrane, the liposomes are more homogenous and less complex, which makes it easier to obtain and understand spectroscopic data. The protocol describes the procedure of FCP isolation and purification, liposome preparation, and incorporation of FCP into liposomes with natural lipid composition. Results from a typical application are given and discussed.

Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids

Here, we present a protocol to isolate fucoxanthin chlorophyll a/c binding proteins (FCP) from diatoms and incorporate them into liposomes with natural lipid compositions to study excitation energy transfer upon ion composition changes.

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

The photosynthetic performance of plants, algae and diatoms strongly depends on the fast and efficient regulation of the light harvesting and energy ...

Biochimica

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within the chloroplasts, the thylakoid membrane system houses all the photosynthetic pigments, reaction center complexes, and most of the electron carriers, and is responsible for light-dependent ATP synthesis. Over 90% of chloroplast proteins are encoded in the nucleus, translated in the cytosol, and subsequently imported into the chloroplast. Further protein transport into or across the thylakoid membrane utilizes one of four translocation pathways. Here, we describe a high-yield method for isolation of transport-competent thylakoids from peas (Pisum sativum), along with transport assays through the three energy-dependent cpTat, cpSec1, and cpSRP-mediated pathways. These methods enable experiments relating to thylakoid protein localization, transport energetics, and the mechanisms of protein translocation across biological membranes.

We present protocols herein for high-yield isolation of physiologically active thylakoids and protein transport assays for the chloroplast twin arginine translocation (cpTat), secretory (cpSec1), and signal recognition particle (cpSRP) pathways.

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and organization of these complexes is highly dynamic on both long and short time scales due to processes that adapt photosynthesis to changing environmental conditions (i.e., non-photochemical quenching, state transitions, and the long-term response). Historically, these processes have been described spectroscopically in terms of changes in chlorophyll fluorescence, and spectroscopy remains a vital method for monitoring photosynthetic parameters. There are a limited number of ways in which the underlying protein complex dynamics can be visualized. Here we describe a fast and simple method for the high-resolution separation and visualization of thylakoid complexes, native green gel electrophoresis. This method is coupled with time-correlated single photon counting for detailed characterization of the chlorophyll fluorescence properties of bands separated on the green gel.

Here we present a protocol to separate solubilized thylakoid complexes by Native Green Gel electrophoresis. Green gel bands are subsequently characterized by Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) and basic steps for data analysis are provided.

Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Ambiente

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Biologia

Purification of Active Photosystem I-Light Harvesting Complex I from Plant Tissues

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a large membrane protein complex coordinating hundreds of light harvesting and electron transport factors and is the most efficient light harvesting system found in nature. Photons absorbed by the four LHCA antenna proteins that make up LHCI are transferred through excitonic interaction to the PSI core reaction center and are used to facilitate light-driven charge separation across the thylakoid membrane, providing reducing power and energy for carbon fixation in photoautotrophic organisms. The high quantum efficiency of PSI makes this complex an excellent model to study light-driven energy transfer. In this protocol, plant tissue is mechanically homogenized, and the chloroplasts are separated from the bulk cellular debris by filtration and centrifugation. The isolated chloroplasts are then osmotically lysed, and the thylakoid membranes are recovered via centrifugation and solubilized using the detergent n-dodecyl-beta-maltoside. The solubilized material is loaded onto an anion exchange column to collect most of the chlorophyll-containing complexes. Larger complexes are precipitated from the solution, resuspended in a small volume, and loaded on sucrose gradients to separate the major chlorophyll-containing complexes. The resulting sucrose gradient fractions are characterized to identify the band of interest containing PSI-LHCI. This protocol is highly similar to the protocol used in the crystallization of plant PSI-LHCI with some simplifications and relies on methods developed over the years in the lab of Nathan Nelson.

<meta charset="utf8"></head><body>Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

This protocol describes the isolation of Photosystem I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) from plant tissues. PSI along with PSII is responsible for the conversion of light to chemical energy in oxygenic photoautotrophs and has a quantum efficiency of ~1, making it a target for studying light-driven energy transfer.

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

This method is used to isolate Photosystem I (PSI) together with the Light Harvesting Complex I (LHCI), its native antenna, from plants. PSI-LHCI is a ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex composition under different conditions. In this protocol the approach is demonstrated by comparing the composition of the protein complex responsible for cyclic electron flow (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isolated from genetically different strains. The procedure comprises the isolation of thylakoid membranes, followed by their separation into multiprotein complexes by sucrose density gradient centrifugation, SDS-PAGE, immunodetection and comparative, quantitative mass spectrometry (MS) based on differential metabolic labeling (14N/15N) of the analyzed strains. Detergent solubilized thylakoid membranes are loaded on sucrose density gradients at equal chlorophyll concentration. After ultracentrifugation, the gradients are separated into fractions, which are analyzed by mass-spectrometry based on equal volume. This approach allows the investigation of the composition within the gradient fractions and moreover to analyze the migration behavior of different proteins, especially focusing on ANR1, CAS, and PGRL1. Furthermore, this method is demonstrated by confirming the results with immunoblotting and additionally by supporting the findings from previous studies (the identification and PSI-dependent migration of proteins that were previously described to be part of the CEF-supercomplex such as PGRL1, FNR, and cyt f). Notably, this approach is applicable to address a broad range of questions for which this protocol can be adopted and e.g. used for comparative analyses of multiprotein complex composition isolated from distinct environmental conditions.

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

The described comparative, quantitative proteomic approach aims at obtaining insights into the composition of multiprotein complexes&#160;under different conditions and is demonstrated by comparing genetically different strains. For quantitative analysis equal volumes of different fractions from a sucrose density gradient are mixed and analyzed by mass spectrometry.

Un nuovo approccio per l&#39;analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su<sup&gt; 15</sup&gt; N metabolica Etichettatura e quantitativa Spettrometria di Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

Un nuovo approccio per l'analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine ​​clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi

Isolando e incorporando luce-raccolta di antenne da diatomea Cyclotella Meneghiniana in liposomi con i lipidi Thylakoid

Isolamento dei tilacoidi fisiologicamente attivo e il loro uso nelle analisi di trasporto energia-dipendente della proteina

Separazione di spinaci Thylakoid complessi proteici da nativo verde Gel elettroforesi e caratterizzazione di banda utilizzando Time-Correlated Single Photon Counting

Indagare tessuti e risposte fitocromo organo-specifici utilizzando FACS-Cell-assistita di tipo profili specifici di espressione in Arabidopsis thaliana

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

Un nuovo approccio per l'analisi comparativa dei multiproteico Complessi Basato su

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi