This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

The authors declare no conflict of interest

Мембранные белки не так легко учиться. Выделение нативных белков мембран затруднено необходимостью для растворения липидный бислой с моющими средствами, которые могут повредить белок и удалить основные кофакторов. Эти белки также могут присутствовать на низком уровне в биологических мембранах, или смешивать с тесно связанных белков, как и в случае с легкими комплексов заготовки, что делает очистку отдельных комплексов сложных. Гетерологическая экспрессии белка в E. палочка и в пробирке восстановления дает возможность избежать этих проблем. В пробирке восстановление и очистка свернутых белков приводит к комплексам, которые обладают характеристиками, очень похожие на те, из нативных комплексов 20,21,23 и, следовательно, может быть использован для изучения комплексов, которые не могут быть очищены до гомогенности 24 - 27. Этот метод использует шпинат, который легко attainabле круглый год, в качестве источника для общего пигментных и каротиноидов препаратов. Для некоторых reconstitutions белков родных к морским водорослям, использование пигментов, выделенных из водорослей является предпочтительным в силу различных композиций пигмента. КХЛ соотношение / б и Хл отношение / автомобиль остается тем же, независимо от источника пигмента. Важно понимать, что эффективность восстановления, как правило, около 35% 28. При этом необходимо, чтобы удалить не связанный пигменты и развернутую апопротеина из раствора после восстановления. Протокол очистки двухступенчатый представлена ​​в этом протоколе (см также приводит). Тем не менее, следует отметить, что ступенчатый градиент сахарозы не допускает полное разделение апо- и голо-белка. Для большинства анализов, это не является проблемой, так как апопротеин не содержит пигментов и, таким образом, не мешает функциональных измерений. Тем не менее, в случае, если необходимо полностью удалить апопротеина от фрдействия, содержащий восстановленный комплекс (например, для расчета пигмент к белковой стехиометрии), анионные обменная колонна может использоваться (см Passarini др., 2009 29 для более подробной информации). Способность сложите рекомбинантных белков свет уборки с изолированными пигментов в пробирке дает возможность &quot;манипулировать&quot; комплексы, изменив реконституции «окружение» различными способами, изменяя тем самым характеристики полученного комплекса. Например, изменение состава пигмента во время восстановления может привести в комплексе с измененной композиции пигмента. Эта функция может быть использована для изучения влияния различных пигментов на структуру и стабильность комплекса. Обычно подготовка пигментом, полученным из шпината имеет A / B соотношение Хл 3: 1 и / автомобиль соотношение Хл 2,9: 1. Это отношение обычно производит восстановленный белок с теми же свойствами, что и птельной один. Тем не менее, регулировка отношение A / B Chl при добавлении очищенной Chl А или В могут влиять на связывание различных пигментов в связи с изменением селективности сайтов связывания 30 - 33. Это возможно потому, что большинство пигментов сайтов связывания не полностью селективным в отношении Chl A или B Chl, но совместимо с обоими, хотя и с различной аффинностью 10,30,34. Аналогичным образом, сайты связывания каротиноидов также показали, чтобы иметь возможность разместить более одного вида ксантофилл 8,35 - 38. Различные reconstitutions из CP26, другой пигмент-белкового комплекса высших растений, с использованием различных композиций пигментов приведены в таблице 2 39. Эти reconstitutions были использованы для оценки сродства связывающих сайтов для конкретных пигментов 39. Интересно отметить, что для того, чтобы получить комплекс с тем же пигментом сomposition как нативной, отношение Chl A / B из смеси пигмента должно быть 3: 1. Это, кажется, место для всех LHC комплексов высших растений 20,40. Сочетание молекулярной биологии с техникой реконституции позволяет свойства Хл-связывающего комплекса, который будет изучаться более подробно. Важность различных белковых доменов на стабильность и складывания комплексов или их участие в белок-белковых взаимодействий, были определены путем усечения апопротеина или выполнение случайного мутагенеза 8,41 - 44. Остатки одной аминокислоты, важные для координации различных пигментов может быть изменено с помощью сайт-направленного мутагенеза для анализа свойств отдельных пигментов или оценить их вклад в функции и устойчивости комплексной 10,28,29,45 - 52. На рисунке 6 показан восстановленный Lhcb4 (CP29) смутация гистидин в положении 216 53. Сравнение пигментного состава дикого типа и мутантных комплексов показывает, что мутация вызывает потерю одного Хл молекула, указывая, что целевой сайт размещает Хл в комплексе WT. Различия спектров поглощения WT и мутанта, на нормализации к содержанию пигмента, также показывает, поглощающие свойства утраченного пигмента. В этом случае, разница можно увидеть в главном пика при 680 нм, что свидетельствует о КХЛ координируется His216 поглощает на этой длине волны (для более подробной информации об этом мутанта и спектроскопические свойства см Mozzo др. 2008 53). Анализ мутаций также может быть использован для определения влияния окружающей среды на спектроскопических свойств пигментов 54. В заключение, легкие белки уборки легко могут быть восстановлены в пробирке в результате пигмента-Proteiп комплексы с очень похожими свойствами в родных комплексов. Таким образом, трудности выделения нативных белков устранены, в то же время обеспечивая белковый препарат с высоким выходом и чистотой для дальнейшего исследования. Важность соотношении 3: 1 Хл а / б в производстве аутентичный комплекс подчеркивается, и примеры восстановленного дикого типа и мутантных ВД приведены для иллюстрации применения техники.

Фотосинтетический аппарат растений и водорослей включают интегральные мембранные белки, которые связываются хлорофилла а (хл), B (хл б) и каротиноиды (CAR). Эти пигмент-белковых комплексов активны в сбор световой энергии и передачи этой энергии возбуждения в реакционных центров, где он используется для продвижения разделение зарядов 2. Они также участвуют в регуляторных механизмов обратной связи, которые защищают фотосинтетический аппарат от высокого легкого вреда 3,4. Комплексы свет уборки (ВД) состоят из большого семейства родственных белков в растениях и водорослях 5. Однородная очистка каждого члена семьи была осложнена высокой аналогичных химических и физических свойств комплексов. Кроме того, процедуры очистки часто приводит к потере пигментов или других потенциальных кофакторов, таких как липиды. В пробирке восстановление представиTS мощный метод для решения этих проблем. БАК, связанный с фотосистемы II (LHC-II) был впервые восстанавливали в пробирке Plumley и Шмидта в 1987 году 1. Исследователи экстрагировали очищенная от липидов и пигментов белок отдельно от хлоропластах растений, а затем в сочетании тепловой денатурированного белка с пигментами в присутствии литий додецилсульфата (СПД), а затем с помощью трех циклов замораживания и оттаивания 1. Они показали, что спектральные свойства восстановленного LHC комплексов были очень похожи на комплексов, выделенных из растений. Легкость воссоздания LHC пигмент-белковых комплексов, вероятно, связано с некоторой присущей функцией самосборки, наряду с трудностями в изоляции очищенные комплексы из организмов, привели к быстрому принятию метода другими исследователями. Восстановление фотосинтезирующих белков экспрессия в Escherichia coli (кишечная палочка) было достигнуто Полсен и коллегами в 1990 году 6. У Е.палочки, сверхэкспрессированный мембранные белки, как правило, содержится в телец включения, какие объекты их очистки. Восстановление достигается за счет тепловой денатурации из телец включений, содержащих рекомбинантный белок в присутствии LDS, с последующим добавлением пигментов который инициирует свертывание белка. Складные из LHCII комплекса состоит из двух этапов: первый, хлорофилл связан менее чем за 1 мин; Второй, хлорофилл б связан и стабилизируется в течение нескольких минут 7. В дополнение к предоставлению понимание динамики складных, в пробирке восстановления в сочетании с сайт-направленного мутагенеза позволило выявить специфических аминокислот, важных для стабильности (например, 8,9) или координации пигмента (например, 10). Манипуляция рефолдинга условия от регулировки таких параметров, как пигментного состава или моющих средств также определили элементы Criticaл для правильного складывания, например, требование ксантофиллов для LHCII комплекса (например, 1,11). Кроме того, исследование свойств отдельных пигментов, связанных с комплексов стало возможным с помощью комплексов восстанавливают в естественных условиях (например, 10). Метод, описанный здесь начинается с выделения пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) из шпината и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Выражение и очистки LHC белка из Е. палочка в форме телец включения затем подробно, с последующим восстановлением из LHC и последующей очистки методом аффинной колонке Ni. На конечной стадии, восстановленные комплексы дополнительно очищали центрифугированием в градиенте сахарозы, чтобы удалить свободные пигменты и развернутую апобелка. Этот протокол представляет собой оптимизированный процедуру, включающую несколько модификаций, которые были введены различными лабораториями болееВремя 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

В растениях и зеленых водорослей, свет захватывается светособирающих комплексов (ВД), семейства интегральных мембранных белков, которые координируют хлорофиллов и каротиноидов. В естественных условиях, эти белки сложил с пигментами образуют комплексы, которые вставляются в мембрану тилакоида хлоропласта. Высокое сходство в химических и физических свойств членов семьи, вместе с тем, что они могут легко потерять пигменты в процессе выделения, делает их очистки в нативном состоянии сложной. Альтернативный подход для получения гомогенных препаратов ВД был разработан Plumley и Шмидта в 1987 году 1, который показал, что можно было восстановить эти комплексы в пробирке, исходя из очищенного пигментов и развернутых апопротеинов, в результате комплексов, обладающих свойствами, очень похожих на что из родной комплексы. Это открыло путь к использованию бактериальных выраженных рекомбинантных белков для в пробирке </eм&gt; восстановление. Способ восстановление является мощным по различным причинам: (1) чистые препараты отдельных комплексов могут быть получены, (2) композиция пигмента может управляться, чтобы оценить их вклад в структуру и функцию, (3) рекомбинантные белки могут быть заменен на изучение функциональной Роль отдельных остатков (например, пигментные сайты связывания) или домена белка (например, белок-белковое взаимодействие, складывающиеся). Этот метод был оптимизирован в нескольких лабораториях и применяется в большинстве из светособирающих комплексов. Протокол, описанный здесь подробности метода воссоздания светособирающих комплексов в пробирке в настоящее время используются в нашей лаборатории, и примеры, описывающие применение метода предусмотрены.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Экстракорпоральное возобновлении деятельности светособирающих комплексов растений и зеленых водорослей

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K Views.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Одиночных молекул изображений ядерного транспорта

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

Биохимические Восстановление стероидных рецепторов • Hsp90 белковые комплексы и Реактивация связывания лигандов

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

Восстановление β-катенина ухудшение<em&gt; Xenopus</em&gt; Яйцо Экстракт

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Измерение пространственных и временных Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Сигналы в Arabidopsis растений

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Создание клоновых культуры одноклеточные водоросли спрягать

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...