This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

The authors declare no conflict of interest

חלבוני קרום הם לא כל כך קלים ללמוד. בידוד של חלבונים בממברנה ילידים הוא מסובך בשל צורך solubilize bilayer השומנים עם חומרי ניקוי, אשר יכול לגרום נזק לחלבון ולהסיר cofactors החיוני. חלבונים אלו עשויים גם להיות נוכחים ברמות נמוכות בממברנות ביולוגיות, או להיות מעורב עם חלבונים הקשורים באופן הדוק, כמו במקרה של מתחמי קצירת האור, שגורם לטיהור של מתחמים בודדים קשים. ביטוי חלבון Heterologous בE. coli ובכינון מחדש חוץ גופית מציע את האפשרות להימנע מבעיות אלה. במבחנה הכינון מחדש וטיהור של תוצאות חלבונים מקופלות במתחמים שיש להם מאפיינים דומים מאוד לאלו של מתחמי ילידי 20,21,23 ולכן יכול לשמש כדי לחקור מתחמים שלא יכול להיות מטוהר להומוגניות 24 - 27. שיטה זו משתמשת בתרד, אשר בקלות attainabבכל ימות שנה le, כמקור לסך הכנות פיגמנט וקרוטנואידים. עבור חלק reconstitutions של חלבונים האם של אצות, שימוש בפיגמנטים מטוהרים מאצות הוא מועדף בשל יצירות פיגמנט שונות. / היחס ב Chl וChl היחס / מכונית נשארים זהה, ללא קשר למקור פיגמנט. חשוב להבין כי היעילות של הכינון מחדש היא בדרך כלל סביב 35% 28. לכן יש צורך להסיר את הפיגמנטים שאינם כבולים וapoprotein פרש מהפתרון לאחר הכינון מחדש. פרוטוקול טיהור שני שלבים מוצג בפרוטוקול זה (ראה גם תוצאות). עם זאת, יש לציין כי צעד שיפוע סוכרוז אינו מאפשר הפרדת apo- והולו-חלבון המלאה. עבור רוב הניתוחים זה לא בעיה, כפי שapoprotein אינו מכיל פיגמנטים ולכן אינו מפריע למדידות פונקציונליות. עם זאת, במקרה זה יש צורך להסיר apoprotein באופן מלא מfrפעולה המכילה את הקומפלקס מחדש (לדוגמא, כדי לחשב את הפיגמנט לstoichiometry חלבון), ניתן להשתמש בעמודת מטבע אניוני (ראה Passarini et al. 2009 29 לפרטים נוספים). היכולת לקפל חלבוני קצירת אור רקומביננטי עם פיגמנטים מבודדים במבחנה מספק הזדמנות &quot;לתמרן&quot; מתחמים על ידי שינוי &quot;הסביבה&quot; הכינון מחדש בדרכים שונות, וכך לשנות את המאפיינים של המתחם וכתוצאה מכך. לדוגמא, שינוי בהרכב פיגמנט במהלך הכינון מחדש יכול לגרום מורכב עם הרכב פיגמנט שונה. תכונה זו יכולה להיות מנוצלת כדי ללמוד את ההשפעה שיש לי פיגמנטים שונים על המבנה והיציבות של המתחם. בדרך כלל הכנת פיגמנט המתקבלת מתרד יש שיעור כלורופיל / b של 3: 1 וChl יחס / מכונית של 2.9: 1. יחס זה בדרך כלל מייצר חלבון מחדש עם אותם המאפיינים כמו nיצירתי אחד. עם זאת, התאמה של היחס / b Chl על ידי התוספת של Chl מטוהר או ב יכולה להשפיע על הכריכה של פיגמנטים שונים בשל שונה הסלקטיביות של אתרי הקישור 30-33. זה אפשרי משום שרוב אתרי פיגמנט מחייבים הם לא לגמרי סלקטיבית לChl או Chl ב, אבל יכול להכיל את שניהם, אם כי עם זיקה שונה 10,30,34. באופן דומה, אתרי קישור קרוטנואידים הוצגו גם להיות מסוגל להכיל מיני Xanthophyll יותר מאחד 8,35 - 38. reconstitutions שונה של CP26, אחר מורכב פיגמנט חלבון של צמחים גבוהים יותר, תוך שימוש ביצירות פיגמנט שונים מוצג בטבלה 2 39. reconstitutions אלה שמשו כדי להעריך את הזיקה של אתרי קישור לפיגמנטים מסוימים 39. זה מעניין לציין כי על מנת להשיג מורכב עם אותו ג פיגמנטomposition כילידים אחד, Chl היחס / b של תערובת פיגמנט חייב להיות 3: 1. זה נראה להיות מקרה לכל מתחמי LHC של צמחים גבוהים יותר 20,40. השילוב של ביולוגיה מולקולרית עם טכניקת הכינון מחדש מאפשר את התכונות של מורכב Chl מחייב להיחקר ביתר פירוט. החשיבות של תחומים חלבון שונים על היציבות וקיפול של מתחמים, או מעורבותם באינטראקציות בין חלבונים, נקבעה על ידי מקצץ apoprotein או ביצוע mutagenesis האקראי 8,41 - 44. ניתן לשנות שאריות חומצת אמינו בודדת חשובות לתיאום של פיגמנטים שונים דרך מכוון mutagenesis אתר על מנת לנתח את המאפיינים של פיגמנטים בודדים או להעריך את תרומתם לתפקוד והיציבות של 10,28,29,45 המורכבים - 52. איור 6 מראה מחדש Lhcb4 (CP29) עםמוטציה של היסטידין בעמדת 216 53. השוואה של הרכב הפיגמנט של wildtype ומתחמי מוטציה מראה כי המוטציה גורמת לאובדן של אחד Chl מולקולה, המצביע על כך באתר הממוקד להכיל Chl במתחם WT. ההבדלים של ספקטרום הקליטה של ​​WT ומוטציה, על נורמליזציה לתוכן פיגמנט, גם מציג את מאפייני הקליטה של ​​פיגמנט שאבד. במקרה זה, ההבדל שניתן לראות בשיא העיקרי ב680 ננומטר, המצביע על כך Chl מתואם על ידי His216 סופג באורך גל זה (לפרטים נוספים על מוטציה זו והתכונות ספקטרוסקופיות לראות Mozzo et al. 2008 53). גם ניתוח מוטציה יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעה של הסביבה על התכונות ספקטרוסקופיות של פיגמנטים 54. לסיכום, יכולים בקלות להיות משוחזר חלבוני קצירת אור במבחנה וכתוצאה מכך פיגמנט-proteiמתחמי n עם מאפיינים דומים מאוד למתחמי ילידים. בדרך זו, את הקשיים של בידוד חלבוני ילידים בוטלו, גם בעת מתן הכנת חלבון עם תשואה גבוהה וטוהר למחקר נוסף. חשיבותו של יחס 3: / b Chl 1 בהפקת מורכבת אותנטי יודגש, ודוגמאות של wildtype מחדש וLHCs מוטציה ניתנות להמחשת יישומים של הטכניקה.

מנגנון הפוטוסינתזה של צמחים ואצות כוללים חלבונים נפרד קרום שקושרים כלורופיל (CHL), ב (CHL ב) וקרוטנואידים (מכונית). מתחמי פיגמנט החלבון אלה הם פעילים בקצירת אנרגיית אור ומעביר שאנרגיית העירור למרכזי התגובה, שבו נעשה בו שימוש כדי לקדם את תשלום ההפרדה 2. הם גם מעורבים במנגנוני משוב רגולציה המגנים על מנגנון הפוטוסינתזה מפני נזק אור הגבוה 3,4. מתחמי קצירת האור (LHCs) מורכבים ממשפחה גדולה של חלבונים הקשורים בצמחים ואצות 5. הטיהור הומוגנית של כל אחד מבני המשפחה כבר מסובכת על ידי התכונות כימיות ופיסיות דומות מאוד של מתחמים. בנוסף, הליכי טיהור לעתים קרובות לגרום לאובדן של פיגמנטים או cofactors הפוטנציאלי האחר כגון שומנים. במבחנה represen הכינון מחדשts שיטה רבת עוצמה כדי להתגבר על בעיות אלה. LHC הקשורים Photosystem II (LHC-II) הוקם מחדש ראשון במבחנה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1. החוקרים שחולצו חלבון ופיגמנטים delipidated בנפרד מכלורופלסטים מפעל, ולאחר מכן בשילוב חלבון החום מפוגל עם פיגמנטים בנוכחות ליתיום Dodecyl סולפט (LDS), ואחריו שלושה מחזורים של הקפאה להפשרה 1. הם הראו שהתכונות ספקטרליות של מתחמי LHC מחדש היו מאוד דומות למתחמים מטוהרים מצמחים. קלות מחדש של מתחמי פיגמנט חלבון LHC, סביר להניח בשל כמה תכונת הרכבה עצמית טבועה, יחד עם הקושי בבידוד מתחמים מטוהרים מאורגניזמים, הובילו לאימוץ מהיר של השיטה על ידי חוקרים אחרים. הכינון מחדש של חלבונים פוטוסינתטיים ביתר בEscherichia coli (E. coli) הושג על ידי פאולסן ועמיתים בשנת 1990 6. בתוך א &#39;coli, חלבוני קרום ביטוי יתר כלולים בדרך כלל בגופי הכללה, שמתקני הטיהור שלהם. הכינון מחדש מושגת באמצעות denaturation חום של גופי ההכללה המכילים חלבון רקומביננטי בנוכחות LDS, ואחריו התוספת של פיגמנטים היוזמת את קיפול החלבונים. קיפול של מתחם LHCII הוא תהליך בן שני שלבים: ראשון, כלורופיל כרוך בדקות פחות מ 1; שני, כלורופיל b מאוגדת והתייצבה מעל 7 מספר דקות. בנוסף לאספקת תובנה הדינמיקה מתקפל, בכינון מחדש חוץ גופית בשילוב עם מכוון mutagenesis אתר אפשר זיהוי של חומצות אמינו ספציפיות חשובות ליציבות (לדוגמא, 8,9) או תיאום פיגמנט (למשל, 10). גם מניפולציה של קיפול מחדש של תנאים על ידי התאמת פרמטרים כמו הרכב פיגמנט או בדטרגנטים זיהו critica אלמנטיםl לקיפול נכון, כגון הדרישה של Xanthophylls למורכב LHCII (למשל, 1,11). בנוסף, החקירה של התכונות של פיגמנטים בודדים קשורים למתחמים הייתה אפשרית באמצעות מתחמים מחדש in vivo (למשל, 10). השיטה המתוארת כאן מתחילה עם בידוד של פיגמנטים (chlorophylls וקרוטנואידים) מתרד וreinhardtii Chlamydomonas האצה הירוק. הביטוי וטיהור של חלבון LHC מE. coli בצורה של גופי הכללה לאחר מכן מפורט, ואחריו את הכינון מחדש של LHC וטיהור שלאחר מכן לפי עמודה זיקת Ni. בשלב האחרון, מתחמים מחדש הם מטוהרים עוד יותר על ידי צנטריפוגה שיפוע סוכרוז כדי להסיר פיגמנטים חופשיים וapoprotein פרש. פרוטוקול זה מייצג הליך מותאם בשילוב כמה שינויים שהוכנסו על ידי מעבדות שונות על פניזמן 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

בצמחים ואצות ירוקות, אור הוא נתפס על ידי מתחמי אור הקציר (LHCs), משפחה של חלבוני קרום נפרד שירכזו chlorophylls וקרוטנואידים. בחי, חלבונים אלה מקופלים עם פיגמנטים ליצירת קומפלקסים אשר מוכנסים בקרום thylakoid של הכלורופלסט. הדמיון הגבוה בתכונות כימיות ופיסיות של בני המשפחה, יחד עם העובדה שהם יכולים בקלות לאבד את הפיגמנטים בבידוד, עושה הטיהור שלהם במדינה האם של מאתגרת. גישה חלופית כדי להשיג הכנות הומוגנית של LHCs פותחה על ידי Plumley ושמידט בשנת 1987 1, שהראה כי ניתן היה להקים מחדש מתחמים אלה במבחנה החל מפיגמנטים מטוהרים וapoproteins פרש, וכתוצאה מכך מתחמים עם מאפיינים מאוד דומים לזה של ילידים מתחמים. זה פתח את הדרך לשימוש בחלבוני רקומביננטי הביעו חיידקים במבחנה </eהכינון מחדש מ &#39;&gt;. שיטת הכינון מחדש היא חזקה מסיבות שונות: (1) ניתן להשיג הכנות טהורות של מתחמים בודדים, (2) הרכב פיגמנט יכול להיות מבוקר על מנת להעריך את תרומתם למבנה ותפקוד, (3) יכולים להיות מוטציה חלבונים רקומביננטי ללמוד פונקציונלי תפקיד של השאריות בודדות (לדוגמא, אתרי פיגמנט מחייב) או תחום חלבון (למשל, אינטראקציה בין חלבונים, קיפול). שיטה זו כבר מותאמת במספר מעבדות ומוחלת על רוב מתחמי אור הקציר. הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השיטה של הבנייה מחדש מתחמי אור קציר במבחנה המשמשים כיום במעבדה שלנו, ודוגמאות המתארות יישומים של השיטה מסופקות.

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae at JoVE.com

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

in-vitro-reconstitution-light-harvesting-complexes-plants-green

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.0K Views.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

Video: In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

מולקולה בודדת הדמיה התחבורה גרעיני

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

מיפוי מבוסס AFM של תכונות אלסטיות של קירות תא: ברקמות, נייד, והחלטות subcellular

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

הכינון מחדש של השפלה β-catenin ב<em&gt; Xenopus</em&gt; חלץ ביצה

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בצמחים ארבידופסיס

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...