This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).

1. total Pigmento Extracción de hojas de espinaca <ol><li> Homogeneizar un puñado de hojas de espinaca (~ 20 g) en 100 ml de tampón de molienda en frío (ver Tabla 1) con una batidora durante 20 segundos. </li><li> Filtrar la solución a través de una de dos capas de tela de nylon con un diámetro de poro de 20 micras y se centrifuga el filtrado a 1.500 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento que contiene los cloroplastos con un artista suaves pintar pincel en 1 ml de tampón de lavado refrigerado (ver Tabla 1). Una vez que el sedimento se volvió a suspender, añadir 50 ml de tampón de lavado y centrifugar la solución a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y suavemente resuspender el precipitado (tilacoides) en 50 ml de tampón de lavado (ver la Tabla 1). </li><li> Centrifugar la solución a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante por completo. En este punto, llevar a cabo los siguientes pasos en la oscuridad, para evitar la oxidación del pigmento. </li&gt; <li> Añadir ~ 20 ml de acetona al 80% tamponada con Na 2 CO 3 (ver Tabla 1) para extraer los pigmentos. Dejar la solución en hielo durante 10 min, vórtice de vez en cuando. </li><li> Se precipitan los componentes celulares por centrifugación a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Si los pigmentos no están totalmente extraídos, el pellet tendrá un color verde y el paso 1.6 se debe repetir. </li><li> Recoger el sobrenadante en un embudo de decantación. Añadir 0,4 volúmenes de éter dietílico, agitar vigorosamente y abra la válvula para ventilar el gas. </li><li> Añadir 0,8 volúmenes de NaCl 0,33 y mezclar enérgicamente. Permitir ~ 10 min para las capas se separen. La fase de éter en la parte superior contiene los pigmentos extraídos. Retire la fase inferior clara. NOTA: Si la separación no es clara, congelar y descongelar la solución para mejorar la separación de fases. </li><li> Eliminar el éter mediante el vertido desde la parte superior del embudo de decantación en un recipiente de vidrio adecuado. Dry añadiendo una cucharada de gransulfato de sodio anhidro ular. Agitar la solución y permitir ~ 5 min para el desecante para absorber agua del éter. NOTA: Repita este paso si el sulfato de sodio aparece completamente agrupó; debe haber algunos cristales de libre flotación cuando el éter se seca suficientemente. Si se forma una capa de agua, suprimir este con una pipeta Pasteur antes de añadir sulfato de sodio anhidro adicional. </li><li> Decantar el éter a un nuevo recipiente de vidrio, dejando el sulfato de sodio sólido atrás. </li><li> Se evapora el éter en un SpeedVac giratorio o bajo una corriente de N 2. </li><li> Disolver los pigmentos completamente en 10 ml de acetona al 100%. </li><li> Diluir una pequeña cantidad (~ 3 l) en 1 ml de 80% de acetona y medir los espectros de absorción y determinar una relación de la Chl / b y la concentración de Chl con el método descrito por Porra et al. (1989) 15. </li><li> Alícuota y seque los pigmentos en un Speedvac rotatorio o bajo corriente de N2 hasta que la acetona esevaporado completamente. Guarde los pigmentos secos a -80 ° C. </li></ol> 2. Extracción de carotenoides de la espinaca <ol><li> Siga los pasos 1.1 a 1.5. En este punto, llevar a cabo los siguientes pasos en la oscuridad, para evitar la oxidación del pigmento. </li><li> Resuspender el precipitado tilacoide en ~ 50 ml de etanol 96% tamponado con Na 2 CO 3 (ver Tabla 1) para extraer los pigmentos. Dejar la solución en hielo durante 5 min. </li><li> Se precipitan los componentes celulares por centrifugación a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Si los pigmentos no están totalmente extraídos, el pellet tendrá un color verde y el paso 2.2 se debe repetir. </li><li> Recoger el sobrenadante y añadir 0,1 volumen de 80% de KOH (w / v) para iniciar la saponificación. </li><li> Deje la solución a 4 ° CO / N, bien tapado y protegido de la luz. </li><li> Recoger la solución en un embudo de separación. Añadir 1 volumen de éter dietílico y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 0,8 volumes de M NaCl 0,33 y mezclar suavemente. Permitir ~ 10 min para las capas se separen. La fase de éter de naranja en la parte superior contiene los carotenoides saponificados. Eliminar la fase inferior verde mediante el drenaje a través de la llave de paso del embudo. </li><li> Añadir 3 volúmenes de agua y mezclar suavemente para eliminar el hidróxido de potasio. Deje que las capas se separen. NOTA: Si la fase superior aparece turbia, agregue una pequeña cantidad de NaCl (por ejemplo, 3 g de NaCl en 200 ml de solución) y girar suavemente para que se disuelvan. </li><li> Eliminar la fase inferior mediante el drenaje a través de la llave de paso del embudo. </li><li> Siga los pasos 01.10 a 01.13. </li><li> Diluir una pequeña cantidad (~ 3 l) en 1 ml de 80% de acetona y medir los espectros de absorción a 440 nm en 80% de acetona. Para determinar la concentración, utilice la extinción media de coeficiente para los carotenoides (ε 440 = 255) 16 en la siguiente fórmula: coches [/ ml mg] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (camino óptico) = 1 cm. </li><li> Alícuota y seque el carotenoids en un Speedvac o bajo corriente de N2 hasta que todo dietiléter se ha evaporado. Guarde los pigmentos secos a -80 ° C. </li></ol> 3. total de pigmentos carotenoides y Extracción de Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Crecer C. reinhardtii en medio TAP sólido 17 en una placa de Petri mediante la difusión de una pequeña cantidad de cultivo líquido sobre la superficie. Crecer bajo flujo de iluminación continua de 20 mol fotos PSA m -2 s -1 hasta una capa verde de las células es visible. </li><li> Con un asa de inoculación estéril, cosecha una pequeña cantidad de C. reinhardtii del medio TAP sólida y poner las células en 500 ml de medio TAP 17 en un matraz de 1 L. Mantener el cultivo a 25 ° C con 170 rpm de agitación bajo un flujo de iluminación continua de 20 mol fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Después de 5-6 días, la cultura debe llegar hasta el final de la fase logarítmica (6 x 10 6 células / mlo 2-2,5 densidad óptica a 750 nm). Se centrifuga el cultivo a 4.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Para la extracción total de pigmentos, siga los pasos 1.6 a 1.15. </li><li> El rendimiento de extracto total de pigmento a partir de 500 ml de cultivo de crecimiento completo de C. reinhardtii es de alrededor de 5 ml de solución con una concentración de 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Para la extracción de carotenoides, siga los pasos 2.2 a 2.12. </li></ol> 4. Purificación de Cuerpos de Inclusión <ol><li> Clonar la secuencia de codificación de la proteína LHC de interés en un vector de expresión que da como resultado una C-terminal de His fusionada usando procedimientos estándar de biología molecular. Transformar este constructo en E. coli cepa huésped tal como BL21 (DE3). </li><li> Preparar tampón de lisis, tampón detergente, tampón Tritón, TE (Tabla 1), 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y medio LB 18 con los antibióticos apropiados. </li><li> Elija una single E. colonia coli que contiene el clon de expresión de una placa recién estriada en ~ 5 ml de medio LB con los antibióticos apropiados utilizando procedimientos estándar 6. Crecer a 37 ° C con agitación 220 rpm durante al menos 16 h. </li><li> Añadir 2,5 ml de la O / N de cultivo en un matraz Erlenmeyer de 1 L con 250 ml de LB suplementado con el antibiótico apropiado. </li><li> Cultivar las células durante 2-3 horas (o hasta que la DO 600 es ~ 0,6) a 37 ° C a 220 rpm. </li><li> Añadir IPTG a una concentración final de 1 mM. Continuar creciendo las células a 37 ° C con 220 rpm 04.03 h. </li><li> Centrifugar la cultura durante 10 minutos a 5000 xga 4 ° C en un tubo de centrífuga previamente pesada. Descartar el sobrenadante a fondo y determinar el peso del pellet pesando de nuevo y restando el peso del tubo de centrífuga. </li><li> Resuspender el E. sedimento celular coli en 0,8 ml / g de tampón de lisis por agitación vigorosa. NOTA: Alternativamente, el sedimento de células se puede congelar a -80C para su uso posterior. Si se comienza con una bolita de helado, dejar descongelar completamente antes de añadir el tampón de lisis. </li><li> Añadir 2 mg de lisozima por gramo de células, e incubar en hielo húmedo con agitación en vórtex ocasional durante 30 min. </li><li> Añadir 20 mg / ml de DNAsa, 10 mM de MgCl 2, NaCl 1 mM, 20 mg / ml de ARNasa. Vortex y poner en hielo durante 30 min. </li><li> Añadir 2 ml de tampón de detergente frío por gramo de células. Mezclar bien y mantener la temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Transferir a tubos de centrífuga de 2 ml (dividida en dos tubos si es necesario). Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C para sedimentar los cuerpos de inclusión. </li><li> Añadir 1 ml de tampón frío Triton y resuspender completamente el sedimento mediante sonicación (3 pulsos x 5 seg x 50% de potencia con intervalos de 20 seg). NOTA: Tenga el tubo en un vaso de precipitados pequeño rodeado de agua con hielo para mantenerlo frío durante el tratamiento con ultrasonidos. En el caso de múltiples tubos, combinar los cuerpos de inclusión se volvieron a suspender en un tubo después de la resuspensión. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 12.000xga 4 ° C para que sedimenten los cuerpos de inclusión. </li><li> Repita el paso 4.13 y 4.14 dos veces. </li><li> Resuspender los cuerpos de inclusión en 1 ml de TE frío con sonificación para un lavado final para eliminar el tampón Triton. Centrifugar durante 10 min a 12.000 xg a 4 ° C para sedimentar los cuerpos de inclusión. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de TE frío por sonificación. </li><li> Evaluar la concentración de proteínas por métodos estándar tales como el ensayo de Bradford 19. Tienda alícuotas de los cuerpos de inclusión a -20 ° C. </li></ol> 5. Reconstitución Este protocolo produce típicamente 1-2 ml de la proteína reconstituida con un diámetro exterior de 4 cuando se mide la absorbancia en la región Qy (600-750 nm). La cantidad puede ajustarse según se desee, aunque se debe tener cuidado para mantener las proporciones adecuadas durante el procedimiento. <ol><li> Preparar las siguientes soluciones que se describen en la Tabla 1: 2x tampón de reconstitución, el 20% OG, 2 M KCl, TE. Realice el siguiente steps con poca luz. </li><li> Resuspender 800 g de cuerpos de inclusión del LHC en un total de 400 l TE en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Añadir 400 l de la 2x tampón de reconstitución y agitar brevemente. </li><li> Añadir 0,6 l de β-mercaptoetanol (14,8 M de stock) para tener una concentración final de 10 mM. Calentar la proteína durante 1 min a 98 ° C. Brevemente Vortex y lugar a TA durante 3 min. </li><li> Resuspender 500 mg del total de pigmentos de clorofila secos más 80 mg pigmentos carotenoides en 30 l 100% EtOH por agitación vigorosa durante 1 min o lugar en un baño de ultrasonido durante 1-2 minutos. </li><li> Gira la mezcla de pigmento y 30 segundos a 15.800 xga 4 ° C y confirmar que no hay pellet. Si hay un pellet, repetir vórtex y / o sonicación. IMPORTANTE: Después de la resuspensión y centrifugado, añadir inmediatamente pigmento a la proteína, o puede agregar y tendrá que volver a suspenderse de nuevo. </li><li> Poco a poco agregue la mezcla de pigmentos a la proteína enfriado mientras vortex. Continúe vórtice 5-10 sec y colocar el tubo en hielo húmedo. Tenga cuidado de no agite con demasiada fuerza ya que la proteína puede desbordar la parte superior del tubo. </li><li> Añadir 94 l de 20% de octilo β-D-glucopiranósido (OG) (concentración final 2%), vórtice brevemente y mantener en hielo 10 min. </li><li> Añadir 90 l de KCl 2 M (concentración final 150 a 200 mM), agitar brevemente y mantener en hielo 20 min. NOTA: preparación de la columna (Sección 6) se pueden iniciar en este momento. </li><li> Girar durante 10 minutos a 15.800 xga 4 ° C. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el sedimento (precipitado LDS) a un tubo de 10 ml. Mantener frío y protegido de la luz. </li></ol> 6. columna de purificación de níquel <ol><li> Preparar las siguientes soluciones según se describe en la Tabla 1: Tampón de OG, tampón de enjuague OG, tampón de elución. </li><li> Conectar una columna de Ni-Sepharose (1 ml) o equivalente a una bomba peristáltica asegurar que el aire no se mete dentro de la columna durante este paso y los pasos siguientes. </li><li> Ajuste la velocidad de tque la bomba de 1 ml / min y enjuagar la columna con 5-10 ml de agua para eliminar la solución de almacenamiento. </li><li> Equilibrar la columna con 3-4 ml de tampón de OG. </li><li> Añadir 3-4 ml de tampón de OG a la muestra de proteína y la carga a la columna. NOTA: si la proteína se ha sentado en el hielo durante más de 10 minutos después de la eliminación de LDS, girar de nuevo a 15.800 xga 4 ° C durante 1 min para eliminar cualquier precipitación LDS adicional. </li><li> Lavar la columna con 5 ml de tampón de OG. </li><li> Lavar la columna con 2 ml de tampón de enjuague OG. </li><li> Se eluye la proteína unida con 3 ml de tampón de elución. Recoger el eluido verde que contiene la proteína reconstituida. NOTA: Esto es generalmente cerca de 1 ml en total. </li></ol> 7. centrifugación en gradiente de sacarosa <ol><li> Preparar las siguientes soluciones según se describe en la Tabla 1: Solución de sacarosa, 0,06% β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Llenar los tubos de ultracentrífuga con la solución de sacarosa y la congelación a -20 ° CO / N or -80 ° C durante al menos 1 hora. </li><li> Retirar el tubo del congelador y dejar descongelar imperturbable a 4 ° C. NOTA: El proceso de congelación / descongelación crea un gradiente de 0,1 a 1 M de sacarosa. Un tubo de 15 ml se descongela típicamente en aproximadamente 3 h. </li><li> Retire cuidadosamente de la parte superior el mismo volumen que la fracción verde se eluyó de la columna de Sepharose de níquel en el paso 6.8. A continuación, cargue la muestra reconstituida lentamente en la parte superior para evitar molestar a la pendiente. </li><li> Se equilibran los tubos y centrifugado a 200.000 xg a 4 ° C en una ultracentrífuga utilizando un rotor de cubeta SW-41 o SW-60 oscilante durante 18 horas, ajuste para frenar la aceleración y detención sin frenos. </li><li> Retire cuidadosamente el gradiente desde el soporte del tubo con unas pinzas. Use una jeringa con una aguja larga que tiene una abertura romo para recoger la fracción de la parte superior. NOTA: Alternativamente, recoger las fracciones de la parte inferior perforando el tubo con una aguja y la recolección de gotas. </li></ol>

The authors declare no conflict of interest

Las proteínas de membrana no son tan fáciles de estudiar. Aislamiento de proteínas de membrana nativas se complica por la necesidad de solubilizar la bicapa lipídica con detergentes, que puede dañar la proteína y eliminar cofactores esenciales. Estas proteínas también pueden estar presentes en niveles bajos en las membranas biológicas, o ser mezclado con proteínas estrechamente relacionadas, como en el caso de los complejos de recolección de luz, que hace que la purificación de complejos individuales difíciles. La expresión de proteínas heterólogas en E. coli y en la reconstitución in vitro ofrece la posibilidad de evitar estos problemas. In vitro reconstitución y purificación de proteínas plegadas resultados en los complejos que poseen características muy similares a las de los complejos nativos 20,21,23 y por lo tanto puede ser utilizado para estudiar complejos que no puede ser purificado hasta homogeneidad 24 - 27. Este método utiliza la espinaca, que es fácilmente attainabLe año, como una fuente para las preparaciones de pigmento total y carotenoides. Para algunas reconstituciones de proteínas nativas a las algas, se prefiere el uso de pigmentos purificados a partir de algas debido a las diferentes composiciones de pigmentos. La proporción Chl / b y la relación / Chl coche sigue siendo el mismo, independientemente de la fuente de pigmento. Es importante darse cuenta de que la eficiencia de la reconstitución es por lo general alrededor del 35% 28. Por lo tanto, es necesario eliminar los pigmentos no unido y la apoproteína desplegada de la solución después de la reconstitución. Un protocolo de purificación de dos etapas se presenta en este protocolo (ver también los resultados). Sin embargo, debe observarse que la etapa de gradiente de sacarosa no permite la separación completa de apo y holo-proteína. Para la mayoría de los análisis esto no es un problema, ya que la apoproteína no contiene pigmentos y por lo tanto no interfiere con las mediciones funcionales. Sin embargo, en caso de que sea necesario para eliminar completamente la apoproteína de la fracción que contiene el complejo reconstituido (por ejemplo, para calcular el pigmento a la estequiometría de proteína), una columna de intercambio aniónico se puede utilizar (ver Passarini et al. 2.009 29 para más detalles). La capacidad se repliegue proteínas recombinantes de recolección de luz con pigmentos aislados in vitro ofrece una oportunidad de &quot;manipular&quot; los complejos mediante la modificación de la reconstitución &quot;medio ambiente&quot; de varias maneras, cambiando así las características del complejo resultante. Por ejemplo, el cambio de la composición de pigmento durante la reconstitución puede resultar en un complejo con composición de pigmento alterada. Esta característica puede ser utilizada para estudiar la influencia diversos pigmentos tienen en la estructura y la estabilidad del complejo. Por lo general, la preparación de pigmento obtenido a partir de la espinaca tiene una relación a / b Chl de 3: 1 y una relación de / coche Chl de 2,9: 1. Esta proporción típicamente produce una proteína reconstituida con las mismas propiedades que el nAtive uno. Sin embargo, el ajuste de la relación a / b Chl por la adición de Chl purificado A o B puede influir en la unión de diferentes pigmentos debido a la variación de selectividad de los sitios de unión 30 a 33. Esto es posible porque la mayoría de los sitios de unión de pigmentos no son completamente selectivo para Chl una o Chl b, pero puede acomodar tanto, aunque con diferente afinidad 10,30,34. De manera similar, los sitios de unión de carotenoides también mostraron ser capaces de acomodar más de una especie de xantofila 8,35 - 38. Diferentes reconstituciones de CP26, otro complejo proteína-pigmento de las plantas superiores, utilizando diversas composiciones de pigmento se muestran en la Tabla 2 39. Se utilizaron estas reconstituciones para evaluar la afinidad de los sitios de unión particulares pigmentos 39. Es interesante observar que con el fin de obtener un complejo con el mismo pigmento cOMPOSICIÓN como el nativo, la Chl relación a / b de la mezcla de pigmento debe ser 3: 1. Este parece ser el caso para todos los complejos LHC de plantas superiores 20,40. La combinación de la biología molecular con la técnica de la reconstitución permite que las propiedades de un complejo Chl-unión a ser estudiados en más detalle. La importancia de los diferentes dominios de la proteína en la estabilidad y el plegamiento de los complejos, o su participación en las interacciones proteína-proteína, se han determinado truncando la apoproteína o realizar mutagénesis aleatoria 8,41 - 44. Residuos de aminoácidos Individual importantes para la coordinación de los diferentes pigmentos se pueden modificar a través de mutagénesis dirigida al sitio con el fin de analizar las propiedades de los pigmentos individuales o evaluar su contribución a la función y la estabilidad del complejo 10,28,29,45 - 52. La figura 6 muestra reconstituyeron Lhcb4 (CP29) conuna mutación de la histidina en la posición 216 53. Una comparación de la composición de pigmento de tipo salvaje y mutantes complejos muestra que la mutación induce la pérdida de una molécula de Chl a, indicando que el sitio diana acomoda una un Chl en el complejo WT. Las diferencias de los espectros de absorción de WT y mutante, en la normalización de el contenido de pigmento, también muestra las propiedades de absorción del pigmento perdido. En este caso, la diferencia se puede ver en el pico principal a 680 nm, lo que indica que la Chl a coordinado por His216 absorbe a esta longitud de onda (para más detalles sobre este mutante y las propiedades espectroscópicas ver Mozzo et al. 2008 53). Análisis de la mutación también se puede utilizar para determinar el efecto del medio ambiente sobre las propiedades espectroscópicas de los pigmentos 54. En conclusión, las proteínas de recolección de luz fácilmente se pueden reconstituir in vitro resulta en pigmento protein complejos con propiedades muy similares a los complejos nativas. De esta manera, se eliminan las dificultades de aislar proteínas nativas, mientras que también la entrega de preparación de proteína con alto rendimiento y pureza en estudio. La importancia de una proporción de 3: a / b 1 Chl en la producción de un complejo auténtico se acentúa, y los ejemplos de tipo salvaje reconstituido y cachés de host local mutantes se proporcionan para ilustrar aplicaciones de la técnica.

El aparato fotosintético de las plantas y las algas incluyen proteínas integrales de membrana que se unen clorofila a (Chl a), b (CHL b) y carotenoides (coche). Estos complejos pigmento-proteína están activos en energía de la luz solar y transferir esa energía de excitación a los centros de reacción, donde se utiliza para promover la separación de la carga 2. Ellos también están involucrados en los mecanismos de retroalimentación reguladoras que protegen el aparato fotosintético de daños luz alta 3,4. Los complejos de aprovechamiento de luz (cachés de host local) se componen de una gran familia de proteínas relacionadas en plantas y algas 5. La purificación a homogeneidad de cada miembro de la familia se ha visto complicada por las propiedades químicas y físicas muy similares de los complejos. Además, los procedimientos de purificación a menudo resultan en la pérdida de pigmentos u otros cofactores potenciales, tales como lípidos. Reconstitución in vitro represents un poderoso método para superar estos problemas. El LHC asociado con el Fotosistema II (LHC-II) se reconstituyó primero in vitro por Plumley y Schmidt en 1987 1. Los investigadores extrajeron proteínas sin lípidos y pigmentos por separado de los cloroplastos de la planta, y luego combinar la proteína desnaturalizada por calor con pigmentos en presencia de litio dodecil sulfato (LDS), seguido de tres ciclos de congelación y descongelación 1. Ellos mostraron que las propiedades espectrales de los complejos LHC reconstituidos fueron muy similares a los complejos purificados a partir de plantas. La facilidad de reconstitución de los complejos de pigmento-proteína LHC, probablemente debido a alguna característica de auto-ensamblaje inherente, junto con la dificultad de aislar complejos purificados a partir de organismos, condujo a la rápida adopción del método por otros investigadores. La reconstitución de proteínas fotosintéticas sobreexpresados ​​en Escherichia coli (E. coli) se logró mediante Paulsen y sus colegas en 1990 6. En E.coli, proteínas de membrana sobreexpresados ​​son típicamente contenidos en cuerpos de inclusión, que las instalaciones de su purificación. La reconstitución se logra a través de desnaturalización por calor de los cuerpos de inclusión que contienen la proteína recombinante en presencia de LDS, seguido por la adición de pigmentos que inicia el plegado de proteínas. Plegable del complejo LHCII es un proceso de dos pasos: primero, la clorofila a se une en menos de 1 min; segundo, la clorofila b se une y se estabilizó durante varios minutos 7. Además de proporcionar una idea de la dinámica de plegado, en la reconstitución in vitro combinado con mutagénesis dirigida al sitio ha permitido la identificación de aminoácidos específicos importantes para la estabilidad (por ejemplo, 8,9) o la coordinación de pigmento (por ejemplo, 10). La manipulación de replegamiento condiciones mediante el ajuste de parámetros como la composición del pigmento o detergentes también han identificado elementos critical para plegamiento apropiado, tales como el requisito de xantofilas para el complejo LHCII (por ejemplo, 1,11). Además, la investigación de las propiedades de los pigmentos individuales unidos a los complejos ha sido posible usando complejos reconstituidos in vivo (por ejemplo, 10). El método descrito aquí comienza con el aislamiento de pigmentos (clorofilas y carotenoides) de la espinaca y la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. La expresión y purificación de una proteína a partir de E. LHC coli en forma de cuerpos de inclusión se detalla a continuación, seguido de la reconstitución de LHC y posterior purificación por columna de afinidad de Ni. En el paso final, los complejos reconstituidos se purificaron adicionalmente por centrifugación en gradiente de sacarosa para eliminar pigmentos libres y apoproteína desplegada. Este protocolo representa un procedimiento optimizado que incorpora varias modificaciones que se han introducido por diferentes laboratorios mástiempo 1,6,10,12 -14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;HisTrap HP</td>
			<td style="width:115px;">GE Healthcare</td>
			<td>17-5247-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon cloth&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>20 &#956;m pores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soft artists paint brush&#160;</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NONIDET P-40</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta-DM</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>D4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Milk Powders</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNAase</td>
			<td style="width:115px;">ThermoScientific</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sonicator</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Octyl &#946;-D-glucopyranoside</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td>O8001&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultracentrifuge XL</td>
			<td style="width:115px;">Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TAP medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LB medium</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>see reference 19</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro reconstitution of light-harvesting complexes of plants and green algae

En las plantas y las algas verdes, la luz es capturada por los complejos captadores de luz (cachés de host local), una familia de proteínas integrales de membrana que coordinan las clorofilas y carotenoides. In vivo, estas proteínas se pliegan con pigmentos para formar complejos que se insertan en la membrana tilacoide del cloroplasto. La alta similitud en las propiedades químicas y físicas de los miembros de la familia, junto con el hecho de que pueden perder fácilmente pigmentos durante el aislamiento, hace que su purificación en un estado nativo desafiante. Un enfoque alternativo para obtener preparaciones homogéneas de cachés de host local fue desarrollado por Plumley y Schmidt en 1987 1, que mostró que era posible reconstituir estos complejos in vitro a partir de pigmentos purificados y apoproteínas desplegadas, dando como resultado complejos con propiedades muy similares a la de la nativa complejos. Esto abrió el camino para el uso de proteínas recombinantes expresadas por bacterias in vitro </em&gt; reconstitución. El método de la reconstitución es potente por varias razones: (1) las preparaciones puras de los complejos individuales pueden ser obtenidos, (2) la composición de pigmento puede ser controlado para evaluar su contribución a la estructura y función, (3) las proteínas recombinantes pueden ser mutados para estudiar el funcional papel de los distintos residuos (por ejemplo, sitios de unión de pigmento) o proteína de dominio (por ejemplo, la interacción proteína-proteína, plegable). Este método ha sido optimizado en varios laboratorios y se aplica a la mayoría de los complejos captadores de luz. El protocolo descrito aquí se detalla el método de reconstituir los complejos captadores de luz in vitro utilizados actualmente en nuestro laboratorio, y ejemplos que describen aplicaciones del método se proporcionan.

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In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

En Vitro Reconstitución de complejos captadores de luz de Plantas y Algas

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

18.1K vistas.  VU University Amsterdam. This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

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Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&amp;#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Investigación

Biología

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a crucial role in transepithelial fluid homeostasis1-3. CFTR has been implicated in two major diseases: cystic fibrosis (CF)4 and secretory diarrhea5. In CF, the synthesis or functional activity of the CFTR Cl- channel is reduced. This disorder affects approximately 1 in 2,500 Caucasians in the United States6. Excessive CFTR activity has also been implicated in cases of toxin-induced secretory diarrhea (e.g., by cholera toxin and heat stable E. coli enterotoxin) that stimulates cAMP or cGMP production in the gut7.
Accumulating evidence suggest the existence of physical and functional interactions between CFTR and a growing number of other proteins, including transporters, ion channels, receptors, kinases, phosphatases, signaling molecules, and cytoskeletal elements, and these interactions between CFTR and its binding proteins have been shown to be critically involved in regulating CFTR-mediated transepithelial ion transport in vitro and also in vivo8-19. In this protocol, we focus only on the methods that aid in the study of the interactions between CFTR carboxyl terminal tail, which possesses a protein-binding motif [referred to as PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motif], and a group of scaffold proteins, which contain a specific binding module referred to as PDZ domains. So far, several different PDZ scaffold proteins have been reported to bind to the carboxyl terminal tail of CFTR with various affinities, such as NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (CFTR-associated ligand), Shank2, and GRASP20-27. The PDZ motif within CFTR that is recognized by PDZ scaffold proteins is the last four amino acids at the C terminus (i.e., 1477-DTRL-1480 in human CFTR)20. Interestingly, CFTR can bind more than one PDZ domain of both NHERFs and PDZK1, albeit with varying affinities22. This multivalency with respect to CFTR binding has been shown to be of functional significance, suggesting that PDZ scaffold proteins may facilitate formation of CFTR macromolecular signaling complexes for specific/selective and efficient signaling in cells16-18.
Multiple biochemical assays have been developed to study CFTR-involving protein interactions, such as co-immunoprecipitation, pull-down assay, pair-wise binding assay, colorimetric pair-wise binding assay, and macromolecular complex assembly assay16-19,28,29. Here we focus on the detailed procedures of assembling a PDZ motif-dependent CFTR-containing macromolecular complex in vitro, which is used extensively by our laboratory to study protein-protein or domain-domain interactions involving CFTR16-19,28,29.

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), an epithelial chloride channel, has been reported to interact with various proteins and regulate important cellular processes; among them the CFTR PDZ motif-mediated interactions have been well documented. This protocol describes methods we developed to assemble a PDZ-dependent CFTR macromolecular signaling complex in vitro.

Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &amp;#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

La reconstitución de la degradación de β-catenina en<em&gt; Xenopus</em&gt; Extracto de Huevo

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medición Espacial y Temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en plantas de Arabidopsis

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitución funcional y la actividad del canal Las mediciones de Purificada Wildtype y mutante CFTR Proteína

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validación de un modelo de ratón para interrumpir LINC Complejos en una celda de manera específica

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. Thus, it is extremely important to develop techniques to establish clonal cultures. In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of a conjugating alga. Water samples are collected from the field. Subsequently, cells are isolated using a glass capillary pipette, placed in media, and grown under conditions suitable for generating a clonal culture.

In this article, we demonstrate the establishment of clonal cultures of unicellular conjugating algal species collected from a natural field site.

Establecimiento de una cultura clónica de algas unicelulares de conjugación

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.