This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer&#8217;s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).

Effectuer toutes les procédures et protocoles impliquant des animaux conformément aux National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Les procédures décrites ici ont été examinés et approuvés par le Baylor College of Medicine institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. virus adéno-associé (AAV) vecteurs de réplication incompétent pour la livraison du transgène dans le cerveau de rongeurs sont approuvés pour le niveau de biosécurité 1 utilisation. Consultez le site Web CDC pour la publication du gouvernement américain &quot;prévention des risques biotechnologiques en microbiologie et biomédicales Laboratories (BMBL)&quot; qui détaille les exigences spécifiques concernant les procédures de protection et de transport de virus appropriés. Vérifiez auprès du personnel de sécurité vétérinaire et environnementale locale pour connaître les exigences spécifiques de procédures institutionnelles pour utilisant des virus. Règlement concernant les pièces de la procédure, la quarantaine, et l&#39;identification des cages de risque biologique varient selon les institutions. 1. Prépare P0 chiots et Foster mères <ol><li> Fournir haute chow de graisse pour toutes les femmes enceintes et allaitantes de soutenir les besoins énergétiques de la reproduction et la lactation. </li><li> Dans la soirée, mettre en place une cage d&#39;élevage en ajoutant une ou deux femelles en bonne santé à la cage d&#39;un mâle résident unique. Le lendemain matin, vérifiez les femmes pour une prise d&#39;accouplement et de séparer les femmes des hommes, si une prise est présente. <ol><li> Utilisez mères adoptives pour élever les petits à partir d&#39;un fond génétique avec les caractéristiques maternelles pauvres (par exemple, C57BL / 6 ou C3HeJ). Mères adoptives acceptent chiots d&#39;une autre portée si les chiots sont nés transférés dans les quatre jours de la litière propre de la mère nourricière. </li><li> Mettre en place une cage d&#39;accouplement séparé à l&#39;aide ICR femelles ou FVB à côté des éleveurs expérimentaux, afin que les deux groupes de femmes accouchent à peu près au même moment. </li></ol></li><li> Les femelles livrer dans 19 ± 1 jours à compter de la date de la prise, en fonction de la souche de fond. Trois jours avant dIVRAISON (16 jours après la date de prise), placer la femme enceinte dans une cage propre avec du matériel de nidification frais et un abri couvert. </li><li> Vérifiez nouveaux-nés deux fois par jour à partir 2 jours avant la date prévue de l&#39;accouchement (17 jours après la date de prise). Examinez la cage avec un minimum de stress pour les mères en regardant à travers le fond de la présence de nouveau-nés roses. Souris délivrent des petits le matin, mais en de rares occasions prononcera dans l&#39;après-midi. </li><li> Planifiez à pratiquer des injections dès que les chiots sont allaitent (qui sera évident par les taches de lait visibles), ou dans les 6 heures de la naissance, selon la première éventualité. </li></ol> 2 Préparer l&#39;équipement pour injection <ol><li> Préparer une seringue d&#39;injection de 10 pi avec une aiguille de 32 G pour les nouveau-nés généraux P0. Si vous effectuez injection stéréotaxique, monter la seringue dans le bras manipulateur. </li><li> Si vous utilisez un cadre stéréotaxique pour préparations injectables, refroidir le stade néonatal à 4-8 ° C en ajoutant 100% ethanet d&#39;utilisation de la neige carbonique dans le réservoir à l&#39;extrémité avant du bloc. Maintenir la température au-dessus de 1 ° C pour éviter les gelures des chiots. </li></ol> 3 Préparer les dilutions virales pour injection <ol><li> Préparer un trypan solution de colorant bleu de 1% (20x stock). </li><li> Préparer des aliquotes 5-25 ul de virus adéno-associé (AAV) de bouillon dans une enceinte de sécurité biologique de classe 2. Placez ces aliquotes à -80 ° C pour une utilisation ultérieure. Eviter les cycles de congélation-décongélation supplémentaires que cela entraîne la transduction du virus à perdre leur efficacité. </li><li> Retirer une aliquote de l&#39;AAV de -80 ° C congélateur et placer sur la glace à dégeler. </li><li> Préparation de la solution pour injection virale par le virus de dilution dans une solution saline de phosphate de 1x glacée tamponnée (PBS). Commencer avec une dilution en série de dix fois (10 oct-10 août particules virales / hémisphère) pour l&#39;optimisation de la configuration initiale de transduction. </li><li> Ajouter 20x bleu trypan à la solution de l&#39;AAV à une concentration finale de 0,05%. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Mise en scène du nouveau-nés pour injection <ol><li> Placer une petite plaque d&#39;aluminium sur la glace pour refroidir. Placer une tâche chiffon sec sur le dessus de la plaque pour protéger la peau du chiot à partir du métal froid. Cela sert comme une surface froide plat pour anesthésier et injecter les chiots. </li><li> Préparer un coussin chauffant approprié pour garder souriceaux nouveau-nés au chaud avant et après l&#39;injection. </li><li> Une fois que les nouveau-nés ont commencé à infirmière, d&#39;éliminer environ la moitié d&#39;entre eux de la cage et laisser l&#39;autre moitié avec leur mère. Placez les petits recueillies sur le coussin chauffant en attendant injection. REMARQUE: Si la mère biologique ne se soucie pas pour les chiots, retirez la litière de la cage immédiatement et placer les chiots sur un coussin chauffant à attendre injection. Cette situation peut se produire avec la première portée née à C57BL / 6 femelles ou avec d&#39;autres souches consanguines qui ont des caractéristiques de reproduction pauvres. Dans cette situation, les taches de lait ne seront pas visibles sur nouveau-nés. </li><li>Transférer un chiot de la coussin chauffant sur la plaque de métal froid pour induire une hypothermie anesthésie. Attendez 2-3 min pour le chiot à devenir pleinement anesthésiés. Confirmez l&#39;anesthésie en pressant très doucement une patte et surveiller l&#39;absence de mouvement ou la respiration. </li></ol> 5. injection de l&#39;AAV à des souris nouveau-né <ol><li> Gratuit main d&#39;injection intracrânienne de l&#39;AAV à des souris nouveau-né: <ol><li> Charge 5 ul de AAV dilué avec 0,05% de bleu trypan dans la seringue d&#39;injection. </li><li> Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Identifier les points d&#39;injection à 5.2 de la distance à partir de la suture lambda à chaque oeil. Site d&#39;injection de remplacement est située à environ 0,8 à 1 mm latéralement à partir de la suture sagittale, à mi-chemin entre le bregma et lambda. Ces points de repère sont visibles à travers la peau à P0. </li><li> Marquer le point d&#39;injection avec un stylo de laboratoire non-toxique. </li><li> Tenez la seringue avec l&#39;échelle visible pour moniveillance le volume de solution distribuée. </li><li> Assurez-vous que le pouce puisse atteindre le haut du piston. Ensuite, retirer le pouce du piston tout en positionnant l&#39;aiguille pour éviter accidentellement distribution virus. </li><li> Trouver une position confortable pour caler le bras pour injection en plaçant le coude sur le banc et se penchant sur le bras le seau à glace. </li><li> Placez le chiot sur le côté avec la tête directement sous la seringue. Tournez la tête du chiot afin que le site d&#39;injection marquée vers le haut, et doucement mais fermement tenir cette position avec une main ouverte. </li><li> En tenant la seringue perpendiculaire à la surface du crâne et introduire l&#39;aiguille au niveau du site d&#39;injection marqué jusqu&#39;à une profondeur d&#39;environ 3 mm. Injecter l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que la résistance diminue légèrement, ce qui indique que l&#39;aiguille a pénétré dans le ventricule latéral. Si l&#39;on avait besoin d&#39;une référence, marquer 3 mm de la pointe de l&#39;aiguille avec machine non-toxique. Régler la profondeur d&#39;injection pour la taille de chiot et de la souche sur la base de colorant targeting des ventricules. </li><li> En tenant la seringue de façon rigide de sorte que le plongeur peut être enfoncé sans déplacer l&#39;aiguille plus loin dans le cerveau. Si l&#39;injection est déplacé dans le thalamus, la propagation virale sera sévèrement limitée. </li><li> Commencer l&#39;injection de virus lentement tout en surveillant le volume distribué à partir de la seringue. L&#39;administration d&#39;un volume maximal de 2 ul dans chaque ventricule. Si l&#39;aiguille est dans la position correcte, le colorant se propage à remplir le ventricule. </li><li> Retirer lentement l&#39;aiguille. </li><li> Laisser le premier site d&#39;injection avant l&#39;injection pour fermer l&#39;autre hémisphère. NOTE: Ne pas injecter le même site plus d&#39;une fois. Réinsérer le virus des forces de l&#39;aiguille qui a déjà été injecté à s&#39;échapper et cause un préjudice ou la mort du chiot. </li><li> Injecter le ventricule controlatéral en utilisant la même procédure. </li></ol></li><li> Injection stéréotaxique de l&#39;AAV à des souris nouveau-né: <ol><li> Charge 5 pi d&#39;AAV dilué avec 0,05% trypan int bleuo la seringue d&#39;injection a eu lieu par le manipulateur stéréotaxique. </li><li> Placez délicatement la tête du chiot entre les barres d&#39;oreilles de la trame du nouveau-né. Assurez-vous que la tête est au niveau de l&#39;axe Y (avant vers l&#39;arrière) en vérifiant que la ligne entre lambda et bregma est parallèle à la scène. Assurez-vous que la tête est au niveau de l&#39;axe des X (côté à l&#39;autre) en vérifiant que une ligne imaginaire entre les oreilles, ou une ligne entre les deux yeux, est parallèle à la scène. </li><li> Essuyez doucement la tête du chiot anesthésié avec un coton-tige imbibé d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la seringue au-dessus de lambda, puis zéro les coordonnées X et Y. Déplacez les bras stéréotaxiques à (X, Y) = (0,8, 1,5) mm pour bébés P0 standard. NOTE: taille de chiot et coordonnées stéréotaxiques peuvent varier selon la souche et l&#39;âge. Réglez coordonnées basé sur des injections de colorants nécessaires pour cibler les ventricules latéraux. </li><li> Abaissez lentement l&#39;aiguille dans le site d&#39;injection. La surface du crâne sera indent puis relâchez une fois l&#39;aiguille a pénétré dans la peau. Rétracter l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que le crâne retrouve sa forme concave normale, mais garder le biseau de l&#39;aiguille sous la peau. Zéro la coordonnée Z à ce point. </li><li> Insérer l&#39;aiguille jusqu&#39;à Z = -1,7 mm et puis se rétractent à -1,5 mm. </li><li> Lentement injecter le virus. Chaque hémisphère peut accepter jusqu&#39;à 2 pi de solution. </li><li> Conserver la seringue en place pendant 30-60 secondes après la fin de l&#39;injection, puis retirer lentement l&#39;aiguille sur 1-2 min. </li><li> Répétez l&#39;opération pour l&#39;hémisphère controlatéral, à l&#39;aide des coordonnées négatives sur l&#39;axe X pour le site d&#39;injection. REMARQUE: coordonnées alternatifs pour l&#39;injection sont (X, Y, Z) = (0,8, 2,0, -1,5) mm et (1.2, 1.0, -1.5) mm. Effectuer la première injection à (0,8, 2,0), puis passer à (0,8, -2,0), (1.2, 1.0) et enfin (1.2, -1.0). Injecter 1 pl de solution sur chaque site, pour un total de 2 pi par hémisphère. Déplacez-vous rapidement entre les injections pour terminer la procédure dans less à 10 min. </li></ol></li></ol> 6. post-injection de soins <ol><li> Après avoir terminé les injections dans les deux hémisphères, placez le chiot de retour sur le coussin chauffant jusqu&#39;à son retour de la couleur de la température du corps et de la peau à la normale et le chiot commence à se déplacer. </li><li> Si vous utilisez la mère biologique pour soigner les nouveau-nés injectés, retourner les chiots injecté à la mère biologique après qu&#39;ils récupèrent le mouvement normal. Placez les petits non-injecté restant sur le coussin chauffant. Répétez la procédure jusqu&#39;à ce que toutes les souris ont été injectées. </li><li> Si vous utilisez une mère d&#39;accueil pour soigner les nouveau-nés injectés, transférer tous les petits injecté à la mère d&#39;accueil pour les soins après qu&#39;ils récupèrent le mouvement normal. <ol><li> Enlever la plupart ou la totalité des chiots appartenant à la mère nourricière de la cage pour assurer le succès des animaux injectés. </li><li> Si les chiots de la mère adoptive et chiots injectés ont la même couleur de peau et des yeux, marquer chiots de la mère d&#39;accueil avec un stylo de laboratoire afin qu&#39;ils puissent êtredistinguer par la suite. </li><li> Placez les chiots de la mère nourricière et une partie de leur literie avec les chiots injectés. Veiller à ce que les chiots injectés acquérir l&#39;odeur de sa progéniture biologique afin d&#39;améliorer l&#39;acceptation des nouveaux chiots. </li><li> Placez seulement les chiots réinjecté dans la cage de la mère nourricière. Abattre des petits restants de la mère nourricière. </li></ol></li><li> Assurez-vous que la mère assiste à nourrir leurs petits et injectés dans les 10 min de les placer dans la cage. Si la mère ne recueille pas les chiots dans ce délai, le transfert à un autre chiots mère adoptive. </li><li> Étiqueter la cage avec une carte de risque biologique pour montrer qu&#39;il contient des animaux d&#39;origine virale injectés. Maison de la cage dans un endroit approuvé pour 72 heures. </li><li> Après la période de quarantaine de 72 heures, transférer la mère et les petits (mais pas de literie ou d&#39;autres articles de la cage) à une cage propre. Effectuez ce transfert dans une enceinte de sécurité biologique de niveau 2 pour éviter l&#39;exposition à toute la literie contaminés par un virus. ReTurn la cage propre avec les animaux injectés à l&#39;établissement régulier de la souris. </li><li> Placez la cage sale dans un sac de risque biologique, stériliser à l&#39;autoclave, puis retourner la cage pour le vivarium. </li></ol> 7 Nettoyage <ol><li> Placer la solution de virus restant à 4 ° C pour une utilisation ultérieure. Le virus conserve l&#39;efficacité de transduction pendant au moins 2 mois lorsqu&#39;elle est stockée à 4 ° C 8. </li><li> Désinfecter l&#39;aiguille d&#39;injection et une seringue avec 2% d&#39;agents blanchissants, suivi par des rinçages répétés dans de l&#39;eau désionisée. </li><li> Nettoyer la zone de travail avec 2% de l&#39;eau de Javel suivie par 70% d&#39;éthanol. </li><li> Collecter tous les objets jetables, y compris les embouts de pipette, tubes, masque et des gants dans un sac en plastique risque biologique. Éliminer les déchets conformément à la loi locale et les politiques institutionnelles (c.-à-autoclave ou incinérer). </li></ol> 8 Préparer cerveaux de souris pour l&#39;imagerie <ol><li> Passer une souris injectée dans une chambre de l&#39;euthanasie de dioxyde de carbone à 34 semaines après l&#39;injection. Suivez les directives institutionnelles pour les procédures d&#39;euthanasie appropriées. Ne pas perfuser les animaux avec du paraformaldéhyde comme cela éteindre l&#39;étiquette de fluorescence. </li><li> Retirer l&#39;ensemble des cerveaux de crâne et de fixer pour 3-12 heures dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS à 4 ° C. </li><li> Transférer le cerveau fixe à 30% de saccharose pour la cryoconservation. Incuber à 4 ° C jusqu&#39;à ce que le cerveau coule au fond. </li><li> Recueillir un seau de glace sèche finement broyée. Couper le cerveau en deux en bas de la ligne médiane. Enterrez les moitiés du cerveau dans la glace sèche à geler. </li><li> Refroidir le stade de microtome en ajoutant de la neige carbonique et de l&#39;éthanol à 100%. </li><li> Fixez le cerveau de la scène avec la ligne médiane vers le bas à l&#39;aide de PBS, et le gel. </li><li> Section à travers le cerveau à 30-45 um d&#39;épaisseur à l&#39;aide d&#39;un microtome de congélation coulissant. </li><li> Placer les articles dans des plaques à 24 puits contenant une solution d&#39;antigel (250 ml de glycerol, 300 ml d&#39;éthylène glycol, 500 ml de 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4). plaques de couverture wie papier d&#39;aluminium et conserver à -20 ° C pour une utilisation future. </li><li> Recueillir sections de 1-4 puits et laver 3x PBS. </li><li> Sections de montage sur des lames de microscope et lamelle. Laisser les lames sécher dans un endroit sombre. </li><li> Les diapositives d&#39;images à l&#39;aide de filtres appropriés pour YFP natif ou tdTomato pour vérifier le motif de transduction du virus. </li></ol>

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Auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Nous avons décrit un procédé polyvalent pour la manipulation de l&#39;expression génique en utilisant des neurones AAV comme vecteur de livraison répandu dans le cerveau de souris nouveau-nés. Comparé à d&#39;autres méthodes de transgénèse neuronale tels que électroporation in utero ou une injection intracrânienne stéréotaxique 2,3, injection virale néonatale est relativement facile et simple. La procédure de base peut être réalisé en quelques minutes seulement avec un seau à g...

Les méthodes traditionnelles pour modifier l&#39;expression des gènes de neurones ont besoin de temps et les manipulations de la lignée germinale coûteux. Alternative de novo approches comme dans l&#39;électroporation in utero ou injection stéréotaxique lentiviral donner des résultats plus rapides et moins coûteuses mais présentent l&#39;inconvénient de nécessiter une intervention chirurgicale complexe 1-3. En outre, l&#39;expression du transgène a une portée spatiale limitée avec ces méthodes. Ici, nous décrivons une méthode rapide, simple et économique pour la manipulation neuronale généralisée par injection intraventriculaire de virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau de souris nouveau-nés. La méthode a été décrite par John Wolfe et Marco Passini en 2001, où ils ont suggéré petite taille de particule d&#39;AAV a permis de se diffuser dans le liquide céphalo-rachidien qui passe à partir des ventricules latéraux à travers la barrière épendymaire immatures et dans le parenchyme cérébral 4, 5. L&#39;injection intraventriculaire de l&#39;AAV à l&#39;intérieur de la fIRST 24 h après la naissance des rendements de transduction virale généralisée des sous-ensembles de neurones couvrant toutes les régions du cerveau, des bulbes olfactifs de tronc cérébral 6,7. Transgènes d&#39;origine virale livrés sont exprimés et active dans les jours suivant l&#39;injection et persistent jusqu&#39;à un an après la transduction. Ainsi, cette manipulation polyvalent permet des études allant du développement du cerveau postnatal précoce de vieillissement et la dégénérescence chez l&#39;adulte. En adaptant la technique à nos besoins expérimentaux spécifiques, nous avons mis l&#39;accent principalement sur ​​AAV8 sérotype car elle est la plus efficace pour transduire des neurones 6. Nous montrons que le titre viral peut être dilué pour contrôler la densité de neurones transduites pour essai de conséquences expériences cellulaires intrinsèques de manipulation génétique. De plus, nous démontrons que les deux virus peuvent être co-injectés pour produire des profils d&#39;expression qui sont sollicités vers des ensembles distincts de neurones ou qui se chevauchent, en fonction des sérotypes choisis pourencapsidation virale. Notre travail se développe la polyvalence de cette technique pour une utilisation dans un large éventail de paramètres de neurosciences expérimentales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="564">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:89px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">ICR outbred mice</td>
			<td style="width:89px;">Harlan</td>
			<td style="width:119px;">Hsd:ICR (CD-1)</td>
			<td style="width:167px;">This strain is also known as CD-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">FVB inbred mice</td>
			<td style="width:89px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">1800</td>
			<td style="width:167px;">5-6 weeks of age</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Nestlets</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">NESTLETS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Shepherd shacks</td>
			<td style="width:89px;">Lab Supply</td>
			<td style="width:119px;">SS-mouse</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">High fat rodent chow</td>
			<td style="width:89px;">Purina Mills</td>
			<td style="width:119px;">PicoLab Mouse diet 20, #5058</td>
			<td style="width:167px;">This is our standard breeder chow</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:189px;">High fat rodent chow (alternative)</td>
			<td style="width:89px;">Harlan Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S</td>
			<td style="width:167px;">If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:189px;">Injection syringe</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7653-01</td>
			<td style="width:167px;">10 ml syringe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Injection needles</td>
			<td style="width:89px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7803-04, RN 6PK PT4</td>
			<td style="width:167px;">32 gauge, for standard P0 injections</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Metal plate for cryoanesthesia</td>
			<td style="width:89px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">8975K439</td>
			<td style="width:167px;">Raw aluminum plate, 6&#8221; x 12&#8221;, 0.25&#8221; thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Small animal stereotaxic device with digital readout</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 940</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Universal syringe holder with needle support foot</td>
			<td style="width:89px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:119px;">Model 1772-F1</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:189px;">Neonatal frame</td>
			<td style="width:89px;">Stoelting</td>
			<td style="width:119px;">51625</td>
			<td style="width:167px;">Officially called a mouse and neonatal rat adaptor</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:189px;">Biohazard disposal bags with sterile indicator</td>
			<td style="width:89px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14220-030</td>
			<td style="width:167px;">Important! &#8211; Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute&#8217;s protocol for biohazard waste disposal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction

Avec le rythme des progrès scientifiques accélérer rapidement, de nouvelles méthodes sont nécessaires pour neurosciences expérimentales de manipuler rapidement et facilement l&#39;expression des gènes dans le cerveau de la souris. Nous décrivons ici une technique introduite par Passini et Wolfe pour la livraison intracrânienne directe des transgènes d&#39;origine virale codée dans le cerveau de souris nouveau-né. Dans sa forme la plus simple, la procédure exige seulement un seau à glace et une seringue microlitre. Toutefois, le protocole peut également être adapté pour une utilisation avec des cadres stéréotaxiques d&#39;améliorer la cohérence de nouveaux chercheurs de la technique. Le procédé repose sur la capacité des virus adéno-associé (AAV) de se déplacer librement dans les ventricules cérébraux dans le parenchyme du cerveau tandis que le revêtement épendymaire est encore immature au cours de la première de 12 à 24 heures après la naissance. Injection intraventriculaire de l&#39;AAV à cet âge, les résultats dans la transduction généralisée des neurones dans le cerveau. Expression commence dans les jours suivant l&#39;injection et persiste pendant la lifetime de l&#39;animal. Titre viral peut être réglé pour contrôler la densité de neurones transduites, tandis que la co-expression d&#39;une protéine fluorescente fournit une étiquette vital de cellules transduites. Avec la disponibilité croissante des installations de base virales pour fournir des réactifs à la fois hors-the-shelf, pré-emballés et préparation virale coutume, cette approche offre une méthode opportune pour la manipulation de l&#39;expression des gènes dans le cerveau de la souris qui est rapide, facile et beaucoup moins coûteux d&#39;ingénierie traditionnel de la lignée germinale.

Le succès d&#39;injection intraventriculaire rendement viral d&#39;expression généralisée et robuste neuronale. Ici, nous avons évalué la transduction virale utilisant YFP ou tdTomato gènes fluorescents sous le contrôle du promoteur de la bêta de poulet de l&#39;actine (promoteur de l&#39;ABC). Ces constructions ont été emballés dans AAV8 et injecté dans les ventricules latéraux de souris (P0) ICR néonatales. Titres viraux élevés (10 à 10 particules par hémisphère) ont donné lieu à l&#39...

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Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Injection virale intracérébro du cerveau de souris nouveau-né pour la transduction neuronale persistante et généralisée

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

58.2K vues.  Baylor College of Medicine. Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

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Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Sélective transduction virale des adultes-né pour les neurones olfactifs chronique In vivo Stimulation optogénétique

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Recherche

Neurosciences

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Intracerebroventricular and Intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the hematogenous route, which involves infection of the endothelial cells and pericytes of the brain. The second is the intracerebroventricular (ICV) route. Once within the central nervous system (CNS), viruses may spread to the subarachnoid space, meninges, and choroid plexus via the cerebrospinal fluid. In experimental models, the earliest stages of CNS viral distribution are not well characterized, and it is unclear whether only certain cells are initially infected. Here, we have analyzed the distribution of cytomegalovirus (CMV) particles during the acute phase of infection, termed primary viremia, following ICV or intravascular (IV) injection into the neonatal mouse brain. In the ICV injection model, 5 &#181;l of murine CMV (MCMV) or fluorescent microbeads were injected into the lateral ventricle at the midpoint between the ear and eye using a 10-&#181;l syringe with a 27 G needle. In the IV injection model, a 1-ml syringe with a 35 G needle was used. A transilluminator was used to visualize the superficial temporal (facial) vein of the neonatal mouse. We infused 50 &#181;l of MCMV or fluorescent microbeads into the superficial temporal vein. Brains were harvested at different time points post-injection. MCMV genomes were detected using the in situ hybridization method. Fluorescent microbeads or green fluorescent protein expressing recombinant MCMV particles were observed by fluorescent microscopy. These techniques can be applied to many other pathogens to investigate the pathogenesis of encephalitis.

Here, we describe a simple method of intracerebroventricular and intravascular injection of viral particles or fluorescent microbeads into the neonatal mouse brain. The localization pattern of the virus and nanoparticles could be detected by microscopic evaluation or by in situ hybridization.

Intracérébroventriculaire et intravasculaire Injection de particules virales et fluorescentes microbilles dans le cerveau néonatal

In the study on the pathogenesis of viral encephalitis, the infection method is critical. The first of the two main infectious routes to the brain is the ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Évaluations neurocomportementales dans un modèle murin de lésion cérébrale hypoxique-ischémique néonatale

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgie stéréotaxique des manipulations génétiques dans des cellules de cerveaux de souris néonatales striataux

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

Targeting the Corticospinal Tract in Neonatal Rats with a Double-Viral Vector using Combined Brain and Spine Surgery

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric spinal cord injuries (SCIs) compared to adult SCIs. In addition, reliably introducing therapies into the target cells of the central nervous system (CNS) can be challenging, and inaccuracies can compromise the efficacy of the study or therapy. This protocol combines viral vector technology with a novel surgical technique&#160;to accurately introduce gene therapies into neonatal rats at postnatal day 5. Here, a virus engineered for retrograde transport (retroAAV2) of Cre is introduced at the axon terminals of corticospinal neurons in the spinal cord, where it is subsequently transported to the cell bodies. A double-floxed&#160;inverted orientation (DIO) designer receptor exclusively activated by designer drug(s) (DREADD) virus is then injected into the somatomotor cortex of the brain. This double-infection technique promotes the expression of the DREADDs only in the co-infected corticospinal tract (CST) neurons.&#160;Thus, the simultaneous co-injection of the somatomotor cortex and cervical CST terminals is a valid method for studying the chemogenetic modulation of recovery following cervical SCI models in neonatal rats.

This protocol demonstrates a novel method for applying gene therapies to subpopulations of cells in neonatal rats at postnatal ages 5-10 days by injecting an anterograde chemogenetic modifier into the somatomotor cortex and a retrogradely transportable Cre recombinase into the cervical spinal cord.

Cibler le tractus corticospinal chez les rats néonatals avec un vecteur double viral à l’aide d’une chirurgie combinée du cerveau et de la colonne vertébrale

Successfully tackling the obstacles that constrain research on neonatal rats is important for studying the differences in outcomes seen in pediatric ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

Injection virale stéréotaxique et implantation de lentilles à indice de gradient pour l’imagerie calcique in vivo du cerveau profond

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and large-scale genomic and drug screening. Due to the self-organizing nature of cells in brain organoids and the growing range of available protocols for their generation, issues with heterogeneity and variability between organoids have been identified. In this protocol paper, we describe a robust and replicable protocol that largely overcomes these issues and generates cortical organoids from neuroectodermal progenitors within 1 month, and that can be maintained for more than 1 year. This highly reproducible protocol can be easily carried out in a standard tissue culture room and results in organoids with a rich diversity of cell types typically found in the developing human cortex. Despite their early developmental make-up, neurons and other human brain cell types will start to exhibit the typical signs of senescence in neuronal cells after prolonged in vitro culture, making them a valuable and useful platform for studying aging-related neuronal processes. This protocol also outlines a method for detecting such senescent cells in cortical brain organoids using senescence-associated beta-galactosidase staining.

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

In this study, we provide a detailed technique for a simple yet robust cortical organoid culture system using standard feeder-free hPSC cultures. This is a rapid, efficient, and reproducible protocol for generating organoids that model aspects of brain senescence in vitro.

Génération robuste et hautement reproductible d’organoïdes cérébraux corticaux pour la modélisation de la sénescence neuronale cérébrale in vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imagerie unicellulaire du cerveau entier et analyse de cerveaux de souris néonatales intactes à l’aide de l’IRM, du nettoyage des tissus et de la microscopie à feuille de lumière

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...