私たちは、原稿上でのアドバイス、有用な議論やコメントのために我々の研究室のメンバー全員に感謝したい。我々はまた、特に我々が改造実験で培養するための脳を解剖する前に、APF 1.5時間まで待つという優れた提案のためにマルタコッホとBassemハッサンに感謝します。我々はまた、共焦点顕微鏡を使用するためのNHGRIのイメージング機能を感謝します。この作品は、NINDS学内研究プログラムは、NIH（Z01 NS003106）の基本的な神経科学プログラムによってサポートされていました。

メディアのA.の準備<ol><li>フィルター滅菌シュナイダーのショウジョウバエのメディアは、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補ったことで、完全なメディアを準備します。 </li><li>メディアは毎回新鮮な準備する必要があります。また、事前に凍結メディアの新鮮なアリコートを各使用前に解凍することができます。 </li><li>培養に先立って、メディアに10μg/ mlのインスリンおよび2μg/ mlのエクジソンを追加します。薬が濃縮された株式のように調製し、小アリコートで凍結した。融解したアリコートを再凍結はありませんでした。 </li><li>すべての作業のソリューションは、25℃で維持されるべきである</li></ol>幼虫の脳の培養 1。幼虫の脳の選択と解剖<ol><li> 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。 </li><li>解剖の時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。 </li><li> U、小さなへらを歌う放浪3齢幼虫をピックアップし、時計皿に置きます。 （我々は、ex vivoでの培養方法は、第一または第二齢幼虫にも同様に適用されるだろうが、我々はこれをテストしていないことを想定しています。） </li><li>鉗子のペアと幼虫の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで前端を開きます。 </li><li>すぐに腹神経索を保持したまま、脳を解剖する。 </li></ol>ディテールに秘められた幼虫の脳の2 のEx vivoでの培養<ol><li>プリウェットピペットチップを使用して、メディアが事前に満たされ、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。 </li><li> 25℃インキュベーターへのメディアの転送の脳は、°希望の時間点までのCに達しています。このメソッドは、文化の中で最大48時間のために効率的に動作します。 </li><li> 8時間でメディアを交換してください。その向こうには、メディア毎に5-6時間の半分を交換してください。 </li></ol> 3。の薬理学的操作幼虫ブレインズ ex vivoでの培養は、このメソッドは、薬理学的に以前に私たちの研究室1に示す遺伝子の相互作用を裏付けるために使用できます。 <ol><li>準備されたメディアに、100μMのロスコビチンと100μMのオロモウシンを追加します。 </li><li>このメディアに解剖し、脳を転送します。 </li><li> 25文化の脳℃で24時間。 </li><li> 8時間でメディアを交換してください。それを超えて、メディアの半分（薬物を含む）ごとに5-6時間を交換してください。 </li></ol>蛹の脳の培養 1。解離に対する蛹の選択<ol><li>ボトル/バイアル白い蛹をマークします。 </li><li>唯一の完全に白です蛹を選択します。発色の任意の並べ替えと蛹が含まれるべきではありません。 </li><li>この段階では、0時間蛹殻の形成（APF）の後です。 </li><li>これらの蛹は、1.5時間マーキングした後に解剖の準備ができます。このステップでは、その発達のプルーニングがエクスビボで発生したことを確認することが重要です</eM&gt;文化。 </li></ol> 2。蛹の解剖<ol><li> 12ミリメートルMillicellセルカルチャーインサートにメディアの500μlを添加します。 （解剖脳は簡単に免疫染色を容易にするために、これらのインサートに配置されます。） </li><li>希望の時間ポイントに達した後、解剖時計ガラスに準備されたメディアの少量を追加します。 </li><li>小さい、ぬれたへらを使用して、以前に解剖用にマークされた蛹をピックアップし、時計皿に置きます。 </li><li>鉗子のペアと蛹の後端持って慎重＃5鉗子の第二のペアで蛹ケースの前端を開きます。 </li><li>すぐに腹神経索がそのまま接続されたまま、脳を解剖する。 </li></ol>ディテールに秘められた蛹の脳の3 のEx vivoでの培養<ol><li>メディアが事前に満たされた、細胞培養インサートに慎重に脳を転送します。 </li><li>希望の時間-Pまで25℃インキュベーター℃〜メディアの転送の脳、ointに達しています。我々は示した実験のために文化の中で10時間にこのメソッドを使用しますが、必要に応じてそれは、観察と治療の長い期間に延長することができます。 </li><li> 8時間のAPFよりも時間ポイントより長い場合は、メディア毎に5-6時間を交換してください。 </li></ol>このステップから、プロトコルは、幼虫と蛹の両方で変わりません。 ディテールに秘められた脳を修復するB. <ol><li>希望の時間ポイントに達すると、メディアを取り出し、30分間0.5％1X PBS中4％ホルムアルデヒドトリトンX-100（PBST）500μLを加え、15分後に新鮮なホルムアルデヒドと置き換えます。 </li><li>固定でメディアを交換しながら、脳を乾燥させないようにしてください。 </li><li> 0.5パーセントトリトンX-100（PBST）での1X PBSを4つの10分間の洗浄でホルムアルデヒドを洗い流してください。 </li></ol> C.固定ブレインズの染色<ol><li>ホルムアルデヒドは、通常1％の1X PBSをブロッキング溶液で1時間の頭脳をブロックし、洗い流された後ヤギ血清および1％ウシ血清アルブミン。 </li><li>ブロッキング溶液で構成される一次抗体を追加します。 </li><li> 4℃一晩インキュベートし、脳℃、 </li><li>翌朝、PBSTの4つの10分間の洗浄を一次抗体を洗い流してください。 </li><li>ブロッキング溶液で構成される二次抗体を追加します。 </li><li>室温で4時間のままにします。 </li><li> PBSTの4つの10分間の洗浄を二次抗体を洗い流してください。 </li></ol> D.は、顕微鏡用固定および染色した頭脳をマウントする<ol><li> 1時間Vectashieldマウンティングメディアの頭脳を平衡化します。 </li><li> Vectashieldマウンティングメディアを使用してスライドガラス上に頭脳をマウントします。 </li><li>カバースリップをマウントする前に脳の両側にガラスチップを置きます。共焦点顕微鏡ですべてのフォーカルプレーンをスキャンするのに十分な試料が薄い維持しながら、これは、押しつぶされたことから脳を防ぐことができます。脳は、興味のある機能を表示して容易にするために、取り付け時におおよそ配向されていた。必要な場合には、脳画像は、ドキュメント、および測定のための最適なビューを提供するためにImarisソフトウェアを回転させた。 </li><li>透明なマニキュアでスリップをカバーシール。 </li><li>ストアでは、光から離れてスライドします。 </li></ol> E.代表的な結果 図1（A）野生型のハエの3齢幼虫の脳のパネルを示し、（B）Cdk5のドミナントネガティブ誘導体（Cdk5DN）（コネル·クロウリーら 、2000）を発現するハエ。 MBのγニューロンの両方急行アクチン-GFP（緑）。前述のように（Trunova ら 、2011）、したがって、 &quot;クリアゾーン&quot;（A、ブラケット）として示すと、アクチン-GFPを蓄積して失敗した野生型γニューロンの近位軸索内の領域があるfasciclin 2蛋白質（赤）までしか、このゾーンの腹側の境界線（白い水平線）への軸索に蓄積されます。 図1（A）の3番目のパネルの点線は、行為を強調し、MBの位置を示す&quot;クリアゾーン&quot;とその腹側の境界インチCdk5DNを発現しているハエでは、アクチンクリアゾーンは存在しません（B）とFasciclin 2（FasII）免疫反応性は、その領域を介して背広が​​っています。 （MB間の水平FasII陽性軸索プロジェクトの変数番号があることに注意してください。これらは表現型には関係ありません）。スケールバーは20μmを表す。 ex vivoでの培養の手法を用いて、我々は、ロスコビチンとオロモウシン、Cdk5を活動の薬理学的阻害剤の組み合わせで、野生型のハエを処理した。 図2は、制御の3齢幼虫の脳（A）のパネルと、（B薬剤処理を示しています。 ）は、野生型のハエ。ドミナントネガティブCdk5を構造、24時間Cdk5を阻害剤で処理し、脳を発現しているハエと同様に、アクチンクリアゾーンとFasII境界（角括弧）内のシフトの特性の損失を示しています。白い線は、野生型FasII境界の位置を示します。スケールバーは20μmを表す。 ふぃぎゅ再3 mCD8-GFP（緑）、膜標的で標識された0から10時間以内APFからショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。ブラケットは、萼、つまりMBの樹状突起を示す。変態前に、一つは太いバンドルと同様に、緻密な樹アーバー（ブラケット）に起因する蛍光シグナルの &quot;かすみ&quot;で背腹走ることMBの軸索を見ることができます。時解剖パネル示す脳が示された。地域における樹状突起のプルーニングが（軸索の信号が影響を受けないですが）6-8時間でAPF、樹状信号のヘイズが消えたように、括弧で示された注意してください。パネルBの脳は、内部エクジソンスパイク（トルーマンとRiddiford、2002）、示されているように培養されたex vivoでの前に、0時間APFで解剖した。これらは、樹状突起のない発達プルーニングを示していないのではなく樹状信号は10時間APFで保持されます。これを回避するためには、蛹には0時間APFでマークされたが、APFと培養1.5時間後に解剖されています。ペインL Cは0から10時間、APFからこれらのショウジョウバエのキノコ体の代表的なシリーズを示しています。非培養サンプルのように、樹状信号は、8時間APFによって検出不可能である。スケールバーは20μmを表す。

<ol>
	<li>Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdk5+regulates+the+size+of+an+axon+initial+segment-like+compartment+in+mushroom+body+neurons+of+the+Drosophila+central+brain.">Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain.</a> J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).</li><li>Nakada, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+anchored+proteins+forms+membrane+diffusion+barriers+during+neuronal+polarization.">Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization.</a> Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).</li><li>Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+the+p53+tumor+suppressor+protein+family+and+Cdk5:+novel+therapeutic+approaches+for+the+treatment+of+neurodegenerative+disease+using+selective+Cdk+inhibitors.">Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors.</a> Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).</li><li>Kahsai, L., Zars, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+and+memory+in+Drosophila:+behavior,+genetics,+and+neural+system.">Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system.</a> Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).</li><li>Lee, T., Lee, A., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+mushroom+bodies:+sequential+generation+of+three+distinct+types+of+neurons+from+a+neuroblast.">Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast.</a> Development. 126, 4065-4076 (1999).</li><li>Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+pruning+during+Drosophila+metamorphosis:+evidence+for+local+degeneration+and+requirement+of+the+ubiquitin-proteasome+system.">Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system.</a> Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).</li><li>Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+requirement+of+the+USP/EcR-B+ecdysone+receptor+for+mushroom+body+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila.</a> Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).</li><li>Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cyclin-dependent+kinase+Cdk5+controls+multiple+aspects+of+axon+patterning+in+vivo.">The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo.</a> Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).</li><li>Truman, J. W., Riddiford, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+insights+into+the+evolution+of+metamorphosis+in+insects.">Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects.</a> Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).</li><li>Noguchi, T., Miller, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+dynamics+in+individualization+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster.">A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Development. 130, 1805-1816 (2003).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+time-lapse+imaging+and+dominant+negative+receptors+to+dissect+the+steroid+receptor+control+of+neuronal+remodeling+in+Drosophila.">Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila.</a> Development. 133, 275-288 (2006).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li></ol>

利害の衝突が宣言されません。

<html>突然変異と導入遺伝子の発現を含む組織の構造と機能の慢性的な遺伝子操作は、通常、分離するのは非常に困難である即効性と後期間接的な結果の組み合わせを生成します。薬理学と遺伝学的手法を補完する表現型の背後にある時間経過の取り調べを容易にすることができます。たとえば、これはショウジョウバエの 10の精子形成時に異なる細胞骨格成分の寄与を解剖す?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td>シュナイダーのショウジョウバエメディア</td><td>インビトロジェン</td><td> 21720-024 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（熱不活化） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10082-1​​47 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140-122 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>インビトロジェン</td><td> 12585-014 </td><td> 10μg/mlの</td></tr><tr><td>エクジソン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H5142 </td><td> 2μg/ml </td></tr><tr><td>ロスコビチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R7772 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td>オロモウシン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> O0886 </td><td> 100μM </td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 50062Z </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> M9501 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D4551 </td><td> 4パーセント</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP151 </td><td> 0.5パーセント</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>インビトロジェン</td><td> 70011-044 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H1000 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td> Millicellセルカルチャーインサート</td><td>ミリポア</td><td> PI8P01250 </td><td></td></tr><tr><td> Multidish、ウェル4 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11251から20 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-544-7 </td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12から548-5M </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo culturing of whole, developing drosophila brains

我々は全体のショウジョウバエの脳のex vivoで培養する方法を説明します。これは急性の薬理学的介入と細胞プロセスのライブイメージングを可能にすることにより、細胞生物学と中央脳構造の開発を調査するための慢性的な遺伝子操作に対位法として使用することができます。技術の一例として、我々の研究室1から前の仕事は、以前に認識されていない細胞内コンパートメントは、 ショウジョウバエ中枢脳の軸索の軸索と細胞体のコンパートメントの間にあることが示されている。軸索起始部（AIS）2と呼ばれるこの区画の開発は、ニューロン特異的サイクリン依存性キナーゼ、Cdk5を依存するように遺伝的に示された。私たちは、Cdk5を特異的薬理学的阻害剤ロスコビチンとオロモウシン3野生型のショウジョウバエの幼虫の脳のex vivoでの治療はアクチン組織の急性変化を引き起こすこと、およびここに示す遺伝的にCdk5を活性を欠く変異体では見られた変化を模倣する細胞表面タンパク質Fasciclin 2の局在インチ ex vivoでの培養技術の第二の例は、幼生から成体への変態期胚のキノコ体（MB）γニューロンの接続の改造のために提供されています。キノコ体は嗅覚学習とフライ4のメモリの中心であり、これらのγニューロンは成体の神経支配パターン5を確立するために後でタイムポイントでの再拡張に分岐して蛹開発中に、その軸索と樹状突起の枝を剪定します。 MBのこれらのニューロンのプルーニングは、エクジソン受容体B1 7で演技、エクジソン、ステロイドホルモンによって引き起こされるメカニズムによって、神経突起の分岐6のローカル変性を介して起こることが示され、それがの活性に依存しているされていますユビキチン-プロテアソームシステム6。 ex vivoでの培養の我々の方法は、bができますeはさらに発達リモデリングのメカニズムを調べるために使用されます。我々は、ex vivoで培養設定では、MBのγニューロンは in vivoと同様の時間経過とともに発達剪定の過程をrecapitulatedことがわかった。それは変態と不可逆的にコミットするために細胞ために組織をexplanting前蛹殻形成後1.5時間まで待つことが、不可欠であった。pupariation開始時の動物の解剖は、培養中のほとんど、あるいはまったく変態につながった。したがって、適切な修正を加えて、ex vivoで培養アプローチは中心的な脳の生物学の定常状態の側面だけでなく、動的な学習に適用することができます。

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains at JoVE.com

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。<emin vivoでの&gt;</emの&gt;開発<em&gt;ショウジョウバエ</emで&gt;キノコ体<em&gt; ex vivoで</em&gt;培養系。

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

We describe a method for ex vivo culturing of whole Drosophila brains. This can be used as a counterpoint to chronic genetic manipulations for ...

ex-vivo-culturing-of-whole-developing-drosophila-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

13.0K ビュー.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke. この資料では、1つは、模倣することができるようにする方法について説明します。開発ショウジョウバエキノコ体 ex vivoで培養系。

ビデオ: Ex vivo Culturing of Whole, Developing Drosophila Brains

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

神経科学

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate tangentially from their place of origin in the ventral telencephalon (including from the medial and caudal ganglionic eminences (MGE, CGE)) to the dorsal cortical plate in response to a variety of intrinsic and extrinsic cues. Different methodologies have been developed over the years to genetically manipulate specific pathways and investigate how they regulate the dynamic cytoskeletal changes required for proper IN migration. In utero electroporation has been extensively used to study the effect of gene repression or overexpression in specific IN subtypes while assessing the impact on morphology and final position. However, while this approach is readily used to modify radially migrating pyramidal cells, it is more technically challenging when targeting INs. In utero electroporation generates a low yield given the decreased survival rates of pups when electroporation is conducted before e14.5, as is customary when studying MGE-derived INs. In an alternative approach, MGE explants provide easy access to the MGE and facilitate the imaging of genetically modified INs. However, in these explants, INs migrate into an artificial matrix, devoid of endogenous guidance cues and thalamic inputs. This prompted us to optimize a method where INs can migrate in a more naturalistic environment, while circumventing the technical challenges of in utero approaches. In this paper, we describe the combination of ex utero electroporation of embryonic mouse brains followed by organotypic slice cultures to readily track, image and reconstruct genetically modified INs migrating along their natural paths in response to endogenous cues. This approach allows for both the quantification of the dynamic aspects of IN migration with time-lapse confocal imaging, as well as the detailed analysis of various morphological parameters using neuronal reconstructions on fixed immunolabeled tissue.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Here, we provide a low-cost and reliable method to generate electroporated brain organotypic slice cultures from mouse embryos suitable for confocal microscopy and live-imaging techniques.

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivoショウジョウバエにおける内分泌シグナル伝達する脳の反応を可視化するためのカルシウム イメージング

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

マウス Retina OCT ファイバーグラムと共焦点画像によるアライメント

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

著者スポットライト:緑内障の診断と治療を改善するためのIn vivoおよびex vivo網膜イメージングの進歩 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

可視光光干渉断層撮影ファイバーグラムと同一マウス網膜の共焦点像のアライメント

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

全体の開発、 ショウジョウバエの脳のex vivoで培養

全体の開発、ショウジョウバエの脳のex vivoで培養