This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

ポリ-D-リジン臭化水素酸塩の調製<ol><li> 0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）で1 mg / mlのポリ-D-リジン臭化水素酸塩を準備します。 </li><li> -20℃で分注し店。 </li></ol>カバーガラスの2。ポリリシンコーティング注：層流チャンバー内のすべてのクリーニングおよびコーティングステップを実施する。 <ol><li> 2時間、1N塩酸（HCl）を含むペトリ皿にカバースリップを置きます。 </li><li>吸引し、すべてのHClおよび70％エタノール（エタノール）2〜3倍で洗い流して。 </li><li> 1時間70％エタノールにしておきます。 </li><li>吸引するすべての70％エタノール、100％エタノール2〜3倍でリンスすること。 </li><li> 2時間の100％EtOH中のままにしておきます。すべてのエタノールを吸引。 </li><li>数秒間濾紙空気乾燥で乾燥したブロット。 </li><li> 1 mg / mlのポリ - リジン溶液中の場所O / N。 </li><li>ミリポア水4-5x翌日カバーグラスをすすぐ。 </li><li>エアドライポリリジンは、クリーンシャーレにガラスローラーのカバースリップをコーティングした。 </li><li> immunohistochemistr用yは、35×10ミリメートルペトリ皿の蓋を使用します。 0.3センチメートルの厚さに皿に30°CO / Nに設定することができます：SYLGARDを準備（polydimethylsilioxane、PDMS）は、PDMS（1重量エラストマーを、エージェント10を硬化させること）に注ぐことによって料理を並んでいた。これが設定された後、PDMSにはめ込み1センチメートルによって2cmにカット。カバースリップのために上記と同様の手順に従ってポリリジンで清掃やコートのインセット。 </li><li>使用するまで層流室内に覆われた店舗ポリリジンコーティングしたカバーガラスや食器（2週間までが、3〜4日ごとに定期的に調製することにより、最良の接着剤の結果を得る）。 </li><li>振動組織スライサーで脊髄ピンに、PDMSブロックを準備します。 1重量：エラストマーAとエラストマーB 1を混ぜる。 100×15mmのペトリ皿に注ぎ、30℃でO / Nを設定することを可能にする。 PMDSの長方形の部分をカットし、エポキシ接着剤を使用して、スライスベース板に接着する。接着剤が所定の位置に、PDMSを固定設定することができ、フラットを取得するために表面から複数の薄い部分をスライス上の組織をピンするために表面。 </li></ol>ヤツメウナギ脊髄の3。急性解離は孤立網様体軸索を得た<ol><li>トリカインメタンスルホネート（; 100 mg / LのMS-222）とammoecoeteまたは成体ヤツメウナギ（Petromyzonマリナス ） を麻酔。犠牲にするヤツメウナギを含む、蓋で覆われたプラスチック製のカップに、水の中に麻酔薬を追加します。 </li><li>のCaCl 2、1.8 130のNaCl、2.1のKCl、2.6のMgCl 2、4、HEPES、4ブドウ糖液（pH7.6、浸透圧270 mOsmで）と本体を削除します（単位：mm）以下の組成の低温（4℃）リンゲル液でヤツメウナギを斬首壁の筋肉は、脊髄の背側表面を露出させる。 </li><li>細かい鉗子を用いて脊髄の後面から髄膜のプリミティバを削除します。この段階では腹側髄膜のプリミティバを削除しないでください。 </li><li> 1cmの長さの断片に脊髄を切断します。 </li><li> PDMSはベースナンプラーをスライス並んで、背側を上に向け、細かい虫ピンを使用して、脊髄片をピン氷のように冷たいリンゲル溶液を含む振動組織スライサー室のTE（2.12を参照）。 </li><li>解離プロセス図2aと図2b中にハンドルとして機能するように終わり頭側と尾側に無傷の背柱部を残して、ブレードで吻側-尾側軸に沿ってスライスして、脊髄の後柱の中央部分を削除します。スライスとその下の網様体、軸索損傷のない列図2bを残すのみ脊柱を除去し、深さの設定を可能にする最も遅い速度設定を使用してください。 </li><li>エルManira＆Bussièresから適応（リンゲル液に1 mg / mlのプロテ​​アーゼ（ストレプトマイセス·グリセウスからタイプXIV）および（クロストリジウムヒストリからタイプI-A）調製した1 mg / mlのコラゲナーゼのカクテルで45分間RTでスライスし、脊髄片をインキュベート、1997 17）。 </li><li> PDMS微細ピンを使用してピン酵素処理脊髄片をシャーレコンタライニングining冷（4℃）リンゲル液。 </li><li>細かい鉗子で腹髄膜のプリミティバを削除します。 </li><li>脊髄図2dに無傷の網様体の軸索の中央列を残してスライスした背側部分の中間に外科用メスの刃で脊髄の横管をカット。 </li><li>レンズにイマージョンオイルの滴を置きます。 </li><li>記録チャンバー図3のスロットにポリリジンコーティングしたカバーガラス（ 図3a、トップピース、赤い四角形）を配置し、シールを容易にするために、すべてのエッジ（ 図3aの赤と青の矩形間の空間に真空グリースを適用します。ネジ所定の位置にトップは、記録リグ上の挿入図にチャンバーを配置します。 </li><li>パスツールピペットを用いて記録チャンバにリンゲル液を加える。 </li><li>熱電冷却デバイスの入力チューブに不凍液を含む耐圧ビンの流出チューブを接続します。 OUTPを接続します外側冷却ジャケットの入力端とリザーバ図3bの出力端に熱電冷却素子のut個のチュービング。 </li><li>記録チャンバーで一度に脊髄の一枚を置き、静かに軸索が分離されるまで、 図2eおよび図2fはテフロンコーティングされた鉗子を用いてすべての回でカバーガラスに沿って、それを維持し、脊髄を分離する。 </li><li>記録チャンバー図3bの外側の冷却ジャケットを介して、熱電冷却装置を介して、（置換により）不凍液加圧（ボトル内に押し込まれる窒素ガス）を通過させることにより10°Cまで記録液温度をもたらす。 </li><li>軸索は10℃で1時間後に解離回復できるようにします。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt;図2網様体の軸索の分離のための解離プロトコルの概略説明。脊柱の（a）の除去。矢印は、組織のスライスの方向を示している。アルファベットのV（赤フォント色）による腹側角ながら背側ホーンは、アルファベットのD（赤フォントの色）でマークされています。（b）の後柱は網様体軸索（緑の線が露出脊髄の中央部分では削除）。スライス工程後に無傷のまま腹側角は、アルファベットV（赤のフォント色）によってマークされている。（c）のプロテアーゼおよびコラゲナーゼで45分間処理はカクテル（1mg / ml）を酵素。横管（d）の切断脊髄;位置、方向、横方向の切り込みの程度を示す。（e）の脊髄の機械的解離。矢印は、鉗子および解離時の剥離力の方向の位置を示す。（f）に Representati解離した網様体軸索準備の例をVEの。緑の矢印は、任意のシナプス後のプロセスなしに急性解離し網様体の軸索の領域をマークします。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> 電気生理学実験用のチャンバーを記録する図3の回路図。提供さ寸法はインチです。 （a）は basepiece図に示されている赤い長方形がbasepieceにおけるカバースリップの溝にカバースリップの位置を示している。高真空グリースを適用した場合の（a）basepiece図に示す赤と青の長方形の間の領域であり、（b）は、組み立てられた記録チャンバーを示している。 FM 1-43と4。標識およびシナプス前終末の同定<ol><li> VへのFM 1-43を組み込むことによって、シナプス前終末にラベルを付ける高K +脱分極時にシナプスエキソサイトーシスの間にesicles。 （30 mMのKClを含む5ミリリットルリンゲル溶液中）、5μMのFM 1-43と準備を灌流。 </li><li> 1 mg / mlのAdvasep-7（5ミリリットルリンゲル溶液中で）過剰FM色素を除去する）18を有する調製物を灌流。 </li><li>どんなremant染料とAdvasepをウォッシュアウトするための15分間のリンゲル液で準備を灌流。 </li><li>デジタルCCDカメラおよび画像取得ソフトウェア细と組み合わせて倒立蛍光顕微鏡上で100×の油浸レンズ（NA 1.25）を有する画像、標準的な蛍光イメージングプロトコルを使用して。 </li><li> 図4c及び図4dを記録するために標的とするように、蛍光標識されたシナプス前終末を特定します。 </li></ol>孤立網様体軸索の5。免疫組織化学<ol><li>二価イオン（カルシウム2 +およびMg 2 +）を無料でディッシュインセット（プロトコルセクション2.10。）フィルリンゲル液。 </li><li> P-87マイクロピペットプラーでパッチピペットを作製。 （シリコーンチューブを0.89ミリメートル吸引端に取り付けられたマイクロピペットチップと内径を用いて）パッチピペット（外径1.5mmのガラス）と吸引を使用して、ポリリジンインセットの一方の端部に縫合糸少量の接着剤を配置する。 </li><li>プロトコルセクションで3 図2のように同じ手順を使用して解離を行ってください。やさしく表面に強く接着させる鉗子で縫合糸糊とプレスで脊髄の一方の端を置きます。インセットのもう一方の端に縫合糸接着剤の別のドロップを置き、静かに軸索が解離されるまで、脊髄を伸ばし、縫合のりの上に静かにドラッグすることで自由な脊髄端を接着する。穏やかに鉗子で押し下げて所定の位置に固定してください。 </li><li>為替価は、灌流による定期的なリンゲル液でリンゲル液を解放する。 </li><li>軸索は20分後にdissoc回復することを許可する10℃でiation。 </li><li> 4％パラホルムアルデヒド（PFA）中で解離軸索を修正20分間{リン酸緩衝生理食塩水（PBS、（mM）の塩化ナトリウム137、塩化カリウム2.7のNa 2 HPO 4 10 KH 2 PO 4 1.8、pH7.4）中で調製した}。 0.2μMのシリンジフィルターを通過することによって使用前にPFA溶液を濾過する。 </li><li> 10分間（PBS中）0.1Mグリシンを灌流することにより、PFAを洗浄する。 </li><li> 10分間（PBS中）0.1％トリトン-Xでインキュベートする。 </li><li> 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。 </li><li> 4℃で6時間（PBS中）を5％無脂肪乳でブロックする。 </li><li>興味のあるVGCCに一次抗体で[追加（PBS中1：200希釈）と4℃で20時間インキュベートする。 </li><li> 20分間、PBSを灌流することによって洗浄する。 </li><li> 4℃で10分間（PBS中）の5％無脂肪乳でブロックする。 </li><li>二次抗体で[追加（PBS中1：400希釈）と4℃で2時間、暗所でインキュベートする。 </li><li> 20分間PBSで灌流により洗浄する。 </li><li> 1％ウシ血清Albuでブロック20分間分（PBS中）。 </li><li>アレクサフルオロ488ファロイジン（5単位/μlの作業濃度を、メタノール200単位/ mlの準備の株式）を追加します。 </li><li> 20分間PBSで灌流により洗浄する。 </li><li>共焦点顕微鏡で100倍の水浸レンズを用いた画像。 </li></ol> 6。電気生理学的記録<ol><li> P-87マイクロピペットプラーでアルミノシリケートガラスパッチピペット（ピペット抵抗2-5MΩ）を作製。ピペットチップ全体シナプス前終末径を包含するように、設計上のパッチピペット。 </li><li> PDMS 23に50〜60 psiの圧力下でパッチピペットを浸漬することによってPDMS被覆パッチピペット（パッチピペットのバックエンドへの窒素ガスシリンダに接続された内径を、シリコンチューブを取り付け0.89ミリメートル）および熱を使用して乾燥させる銃。代わりに、手動で複合顕微鏡の下で可能な限り先端に近いコーティングを適用したPDMSでコーティングピペット、。 </li><li> MICRを使って火ポリッシュパッチピペットoforge（複合顕微鏡のステージに取り付けた特注のプラチナフィラメント）。 </li><li>蛍光顕微鏡でラベルされたシナプス前終末を示す孤立軸索を識別します。 </li><li>記録液を充填します。注射器を使用したパッチピペットに（CA 2 +電流を分離するために設計された電荷キャリアとして10mMのCaCl 2または90 mMののBaCl 2を 、HEPESは、pH 7.6、浸透圧270 mOsmでバッファリング）。 </li><li>電動マニピュレータMP225を使用して、お風呂の上にピペットホルダーとの位置にパッチピペットを挿入します。静かに、蛍光識別されたシナプス前末端の顔に対してバス、所定の位置にパッチピペットを下げる。 </li><li>接触が膜で行われるまで、ゆっくりとパッチピペットを進める。この時点で、ピペットホルダに取り付けられたチューブを介して穏やか口吸引によりギガオームのシールを達成する。 </li><li> Aを使用する、単一チャンネルのCa 2 +電流を記録するのに必要な極めて低いバックグラウンドノイズレベルを達成するために録音のために冷却ヘッドステージとxopatch 200B。 5kHzのベッセルフィルタを用いて、20〜50 kHzとフィルタのサンプルデータ。 Axograph Xを使用してデータ収集を行う</li><li>刺激としては10mV刻みで、標準的な段階プロトコルを使用してください。のCa 2 +チャネルの最大活性化を確実にするために、段階プロトコルの前に、プロトコルにプレパルスを組み込む。リーク電流の分析後の減算ステッププロトコルに10 mVのリークステップを組み込む。 </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

当社の解離プロトコルは、シナプス後突起図2fの欠い孤立網様体の軸索を生じすることによって重要であるが、それでも機能的なシナプス前終末の図4c及び図4dに保持している。シナプス前終末に反対するシナプス後のプロセスが存在しないことは、以前に、中枢シナプスの可能性に成功のみ2腎杯型シナプス前終末に達していない単一のシ​​ナプス前終...

シナプス伝達は非常に迅速で正確なプロセスである。シナプス前終末の活動電位侵入は、シナプス前カルシウム結果として生じる増加、レリーズ顔膜に位置VGCCsの開口部につながる2 +小胞融合および神経伝達物質の放出1のトリガとして機能する。これらのステップのすべてがマイクロ秒2、数百内で発生するため、小胞融合機構3にVGCCsの緊密な空間結合を必要とします。シナプス前のCa 2 +フラックスは、主にカルシウム2 +感受性色素4を用いてアプローチ撮影により特徴付けられている。シナプス前ニューロン中のCa 2 +を調節組み込むのCa 2 +緩衝液は、間接的に、シナプス前カルシウムおよび神経伝達3との間の関係を特徴付けるために使用されている。また、カルシウム2 + 5アンケージングまたはmacroscopiを記録することにより、シナプス前遊離Ca 2 +濃度を調節することのCa 2 + cの電流は小胞融合および/ ​​または放出の尺度と組み合わせて使用されている;そのような静電容量測定6または後シナプス応答と同じ問題に対処するために2。しかし、カルシウムを直接解放面で2 +電流、膜の脱分極は、シナプス小胞融合及び神経伝達物質の放出をトリガするのCa 2 +電流に変換されるシナプス前膜の特殊なセクションを特徴付ける、カルシウムの正確な測定値を得るために不可欠な2+シナプス小胞の融合のための要件。また、直接小胞融合および放出の正確な同時測定と相まって個体シナプス前終末でのCa 2 +電流を特徴付ける能力は、活動電位、シナプス前のCa 2 +電流の時間的経過の間のタイミング関係の正確な解明を可能にし、小胞融合および放出。リリース面膜へのアクセスシナプス後樹状突起により並置を閉じるによるシナプス前末端の大部分では使用できません。それは個人のシナプス前終末での電流を直接測定を防ぐため、このアクセ​​ス不能にVGCCsの特性評価における主要な障害となっている。個別のシナプス前終末におけるシナプス前のCa 2 +電流の直接の特徴付けは、これまで中枢シナプスでは不可能であった2つだけ腎杯型シナプス前終末に達成された。ニワトリ毛様体神経節7-10およびラット腎杯11,12の萼型シナプス。ヤツメウナギの脊髄13内の巨大な網様体シナプスを含む他のすべてのシナプス前終末では、シナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如は、シナプス前のCa 2 +フラックスを研究するために、例えばCa 2 +イメージングなどの間接的なアプローチの使用を必要としている。 <img alt="図1" f○：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot;幅= &quot;500&quot; /&gt; 図1：ヤツメウナギ巨人網様体シナプス。（a）はヤツメウナギの脊髄の断面は背腹方向を示す。網様体軸索は緑のアスタリスクでマークされます。シナプス後ニューロン13の上に（緑色の矢印で示される）シナプス前網様体軸索パッサン接点EN数多くのことを示すヤツメウナギの脊髄における網様体シナプスの（b）の 3次元復元。シナプス後ニューロンがアレクサフルオロ568ヒドラジド（赤）で満たされているが、シナプス前終末には、アレクサフルオロ488ヒドラジド結合ファロイジン（緑色）で標識されている。 吻側-尾側軸を図1aに脊髄並列の腹側領域に位置ヤツメウナギ巨大な網様体軸索、ニューロン上にパッサンシナプスの連絡先専用のフォームに複数の脊髄前角14 図1bは 13。巨視的全細胞のCa 2 +電流は、無傷の脊髄13,15に網様体軸索から記録されています。しかし、Caを直接測定で前回のブラインドの試みは、細胞結合型パッチクランプ法を用いて、無傷のヤツメウナギの脊髄における網様体軸索内2 +電流が原因の対向シナプス後のプロセスによるシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスの欠如に13失敗したことが証明されている図1b。レリーズ顔膜は以前に、シナプスの機械的摂動前に12を記録するか、機械的解離16と連結酵素処理にシナプス後ニューロン11を除去することによってアクセス可能とされています。脊髄の複雑な組織を考慮すると、シナプス後ニューロンを識別し、機械的にそれを撤回または番目を撹乱することは極めて困難で証明する電子シナプス。したがって、私たちは機械的解離に続いて酵素処理17を使用することにしました。 このアプローチを使用して、私たちはそれによって個人のシナプス前終末への無制限のアクセスを提供し、あらゆるシナプス後のプロセスを欠いた機能的なシナプス前終末で実行可能な孤立網様体の軸索が得ヤツメウナギの脊髄の急性解離準備を開発しました。標準の倒立顕微鏡と蛍光画像と一緒に、それが細胞-を使用して記録するためのCa 2 +電流は図4c及び図4dに分離する記録液を含んだパッチピペットを用いて、同定および個別の蛍光同定シナプス前終末を標的にすることを可能添付の電圧クランプ法。のCa 2 +電流は、個別のシナプス前終末図4fのシナプス前のリリース面膜に直接記録されている。これはsignificaですそれは中枢シナプスで実施された最初のこのような記録であるので、シナプス伝達の分野では画期的なヌクレオチド。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

シナプス伝達は非常に迅速なプロセスである。シナプス前末端へのCa 2 +の流入を駆動する活動電位は、リリースの顔膜に位置する電位依存性カルシウムチャネル（VGCCs）を介して、小胞融合及び神経伝達物質の放出のためのトリガーである。シナプス伝達の迅速性に不可欠な活動電位、VGCCsの到着と、神経伝達物質放出機構との間の空間的および時間的な同期性がある。直接個別のシナプス前終末の放出面膜からのCa 2 +電流を記録する機能は、シナプス前のCa 2 +および神経伝達物質放出の間の関係を正確に理解するために不可欠である。電気生理学的記録のためのシナプス前のリリースの顔膜へのアクセスは、ほとんどの準備とシナプス前カルシウムでは使用できません2+エントリはイメージング技術と巨視的現在measuremeを使用して特徴付けられているNTS - CA 2 +エントリーを視覚化するのに十分な時間分解能を持っていない技術。直接単シナプス前終末でのVGCCsの特徴付けは中枢シナプスでは不可能であったため、これまで成功した唯一のニワトリ毛様体神経節の萼型シナプスにおいて、ラットの腎杯に達成されている。私たちは、成功したシナプス後構造を欠いた機能的なシナプス前終末の孤立網様体軸索をもたらす脊髄の急性解離準備を開発することにより、ヤツメウナギの脊髄の巨大な網様体シナプスでこの問題に対処してきた。私たちは、蛍光標識し、個別のシナプス前終末を識別し、記録のためにそれらをターゲットにすることができます。この調製物を用いて、免疫組織化学および電気生理学的手法を用いて個別のシナプス前終末の放出面に直接VGCCsを特徴としている。のCa 2 +電流は、リリースの顔膜Oに直接記録されていますfは個別のシナプス前終末、中枢シナプスで実施された最初のこのような記録。

<html>この解離プロトコル利回り健康的で機能的な孤立網様体シナプス後突起図2fの欠いた軸索が、それにもかかわらず、誘発シナプス小胞のエキソサイトーシスおよび図4cと図4d可能な官能シナプス前終末を保持している。網様体軸索の隔離領域の切片は、明らかに網様体軸索膜図2fにへの無制限のアクセスを可能にする任意の他の神経のプロセスを明確?...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K ビュー.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

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Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

神経科学

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

生物学

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

バイオアッセイ誘導分別を使用して海ヤツメウナギ フェロモンの同定

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

生化学

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

その後のホールマウントのための完全な脊髄損傷や脳解剖プロトコル<em&gt;その場で</em&gt;幼虫海ヤツメウナギにおけるハイブリダイゼーション

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates reafferent cues that animals must disentangle from relevant sensory cues of the surrounding environment. For example, when a fish swims, flow generated from body undulations is detected by the mechanoreceptive neuromasts, comprising hair cells, that compose the lateral line system. The hair cells then transmit fluid motion information from the sensor to the brain via the sensory afferent neurons. Concurrently, corollary discharge of the motor command is relayed to hair cells to prevent sensory overload. Accounting for the inhibitory effect of predictive motor signals during locomotion is, therefore, critical when evaluating the sensitivity of the lateral line system. We have developed an in vivo electrophysiological approach to simultaneously monitor posterior lateral line afferent neuron and ventral motor root activity in zebrafish larvae (4-7 days post fertilization) that can last for several hours. Extracellular recordings of afferent neurons are achieved using the loose patch clamp technique, which can detect activity from single or multiple neurons. Ventral root recordings are performed through the skin with glass electrodes to detect motor neuron activity. Our experimental protocol provides the potential to monitor endogenous or evoked changes in sensory input across motor behaviors in an intact, behaving vertebrate.

We describe a protocol to monitor changes in the afferent neuron activity during motor commands in a model vertebrate hair cell system.

ゼブラフィッシュで泳ぐ後側面線の発泡性ニューロンの活動

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

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