This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1: Preparação de poli-D-lisina Hydrobromide <ol><li> Prepare 1 mg / ml de bromidrato de poli-D-lisina em tampão borato 0,1 M (pH 8,5). </li><li> Alíquotas e armazenar a -20 ° C. </li></ol> Revestimento 2 Poli-lisina de Lamelas Nota: Executar todas as etapas de limpeza e revestimento em uma câmara de fluxo laminar. <ol><li> Coloque lamelas em uma placa de Petri contendo 1 N de ácido clorídrico (HCl) durante 2 horas. </li><li> Aspirar todo o HCl e enxágüe com 70% de etanol (EtOH) 2-3x. </li><li> Deixar em EtOH a 70% durante 1 hora. </li><li> Aspirar todo o etanol 70% e enxágüe com 100% EtOH 2-3x. </li><li> Deixar em EtOH a 100% durante 2 horas. Aspirar todo o EtOH. </li><li> Secar com papel de filtro e secar ao ar durante alguns segundos. </li><li> Colocar N em 1 mg de solução de poli-lisina / / ml de S. </li><li> Lavar lamelas dia seguinte com Millipore 4-5x água. </li><li> Ar seco poli-lisina sobre lamelas de vidro revestidas em rolos de uma caixa de Petri limpa. </li><li> Para immunohistochemistry, utilizar 35 × 10 mm tampas prato Petri. Prepare Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) alinhado pratos vertendo PDMS (elastómero e agente de cura de 10: 1, em peso) para o prato com uma espessura de 0,3 cm, e deixar solidificar a 30 ° CO / N. Uma vez que este se pôs, cortar dois centímetros por 1 centímetro talhado no PDMS. Limpar e revestir a inserção com poli-lisina, seguindo os mesmos passos como mencionado acima para lamelas. </li><li> Armazenar poli-lisina lamelas revestidas e pratos cobertos para dentro da câmara de fluxo laminar, até à sua utilização (cerca de 2 semanas, mas obter melhores resultados através da preparação de adesivos, periodicamente a cada 3-4 dias). </li><li> Prepare um bloco de PDMS, para fixar a medula espinhal no fatiador de tecido vibrando. Elastómero Mistura A e B de elastómero 1: 1 em peso. Verte-se uma placa de Petri de 100 x 15 mm e permite fixar O / N a 30 ° C. Corte um pedaço retangular do PMDS e cola-lo para a placa de base de corte com cola epóxi. Permitir que a cola para definir que fixa os PDMS no lugar e cortar várias seções finas na superfície para obter um apartamentosuperfície para fixar o tecido no. </li></ol> 3. aguda dissociação da Lampreia Medular para produzir isolados reticulospinais Axons <ol><li> Anestesiar um ammoecoete ou adulto lampreia (Petromyzon marinus) com metanos tricaina (MS-222; 100 mg / L). Adicionar anestésico dentro da água, em um copo de plástico coberto por uma tampa, contendo a lampreia para ser sacrificado. </li><li> Decapitar lampreia em frio (4 ° C) solução de Ringer com a seguinte composição (em mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 de CaCl2, 1,8 de MgCl2, 4 de HEPES, 4 dextrose (pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) e remover o corpo músculos da parede para expor a superfície dorsal da espinal-medula. </li><li> Remover meninge Primitiva a partir da superfície dorsal da medula espinal utilizando fórceps finos. Não retire ventral Primitiva meninx nesta fase. </li><li> Corte medula espinhal em um centímetro peças longas. </li><li> Fixar um pedaço da medula espinhal usando finas pinos de insetos, lado dorsal voltada para cima, em um PDMS forrado cortar pla base dete (ver 2.12) numa câmara de tecido de vibração fatiador contendo a solução de Ringer com gelo. </li><li> Retirar uma secção central da coluna dorsal da espinal medula por corte ao longo do eixo rostro-caudal com a lâmina, deixando para trás secções da coluna dorsal intactas no rostral e caudal termina para servir como lida durante o processo de dissociação Figura 2a e a Figura 2b. Use configuração de velocidade mais lenta que permite cortar e uma configuração de profundidade que remove apenas a coluna dorsal deixando a coluna subjacente axônio reticuloespinhal Figura 2b sem danos. </li><li> Incubar cortados pedaços da medula espinal, à TA, durante 45 minutos, em uma mistura de 1 mg / protease ml (Tipo XIV a partir do Streptomyces griseus) e 1 mg / ml de colagenase preparado (Tipo IA a partir de Clostridium histolyticum) em solução de Ringer (adaptado a partir de El Manira &amp; Bussières , 1997 17). </li><li> Pedaços da medula espinhal Pin tratado com enzimas que utilizam pinos finos em um PDMS forrado Petri Conta pratoining solução de Ringer frio (4 ° C). </li><li> Remover ventral Primitiva meninx com uma pinça fina. </li><li> Cortar extensões laterais da medula espinal, com uma lâmina de bisturi, no ponto médio da secção dorsal cortado deixando a coluna central do axónios reticulospinais intactas na medula espinhal A Figura 2d. </li><li> Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lente. </li><li> Coloque a lamela poli-lisina revestido (Figura 3a, parte superior, retângulo vermelho) na ranhura da câmara de gravação Figura 3 e aplique graxa de vácuo para todas as bordas (espaço entre os retângulos vermelhos e azuis na Figura 3a, a fim de facilitar um selo. Parafuso o top no lugar. Coloque a câmara na inserção no equipamento de gravação. </li><li> Adicionar a solução de Ringer na câmara de gravação, utilizando uma pipeta Pasteur. </li><li> Conecte o tubo de saída do frasco contendo solução anticongelante pressão para o tubo de entrada de dispositivo de resfriamento termoelétrico. Conecte o output tubagem do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico para a extremidade de entrada da camisa de arrefecimento externo e a extremidade de saída do reservatório para a Figura 3b. </li><li> Coloque um pedaço de medula espinal de cada vez na câmara de gravação e separar cuidadosamente a medula espinhal mantê-la ao longo da lamela em todos os momentos, utilizando fórceps revestidos de Teflon, até axônios são isolados Figura 2e e na Figura 2f. </li><li> Traga a temperatura da solução de gravação e 10 ° C, passando o pressurizado (gás de azoto é empurrado para dentro do frasco) de solução de anticongelante (por deslocamento), por intermédio do dispositivo de arrefecimento termoeléctrico, através da camisa de arrefecimento exterior da câmara de gravação Figura 3b. </li><li> Permitir axónios para se recuperar por 1 h após a dissociação, a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2 Representação esquemática do protocolo de dissociação para o isolamento dos axônios reticulospinais. (A) A remoção da coluna dorsal. A seta indica a direcção de corte do tecido. Os cornos dorsais são marcados pelo alfabeto D (cor da fonte vermelho), enquanto os cornos ventrais de o alfabeto V (cor fonte vermelha) (b). Coluna dorsal removida na porção central da medula espinhal expondo os axónios reticulospinais (linhas verdes ). Os cornos ventrais, que permanecem intactos após o processo de corte, são marcadas pelo alfabeto V (cor de fonte vermelha). (C) o tratamento de 45 minutos com protease e colagenase enzimas cocktail (1 mg / ml). (D) Corte de extensões laterais da medula espinal; indicando a posição, a direcção e extensão do corte lateral. (e) dissociação mecânica da medula espinhal. As setas indicam a posição do fórceps e direção da força de separação durante a dissociação. (F) Representative exemplo de preparação dissociada axônio reticuloespinhal. Setas verdes marcar regiões de axônios reticulospinais agudamente dissociadas sem quaisquer processos pós-sinápticos. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Esquema de câmara para experimentos de eletrofisiologia gravação. Dimensões fornecidas são em polegadas. Retângulo vermelho mostrado no diagrama basepiece (a) indica o posicionamento da lamela no sulco lamela no basepiece. A região entre o rectângulo vermelho e azul, mostrado no diagrama basepiece (a) é o local onde está aplicado o lubrificante alto vácuo. (B) mostra a câmara de gravação montadas. 4. rotulagem e identificação dos terminais pré-sinápticos com FM 1-43 <ol><li> Rotular terminais pré-sinápticos, incorporando FM 1-43 em vesicles durante sináptica exo-endocitose durante a alta K + despolarização. Perfundir preparação com 5 uM de FM 1-43 (em 5 ml de solução de Ringer contendo KCl 30 mM). </li><li> Perfundir preparação com 1 mg / ml ADVASEP-7 (em 5 ml de solução de Ringer), para remover o excesso de corante FM) 18. </li><li> Perfundir preparação, com a solução de Ringer durante 15 min à lavagem e qualquer corante Remant o ADVASEP. </li><li> Imagem com 100 X lente de imersão em óleo (1,25 NA) num microscópio de fluorescência invertido, em conjunto com uma câmara CCD digital e software de aquisição de imagem micromanager, usando protocolos de imagem de fluorescência padrão. </li><li> Identifique os terminais pré-sinápticos marcados com fluorescência para direcionar para a gravação Figura 4c e 4d Figura. </li></ol> 5. Imunohistoquímica de isolados reticulospinais Axons <ol><li> Preencha prato inserção (seção Protocolo de 2.10.) Com bivalente-ion (Ca 2 + e Mg 2 +) livreSolução de Ringer. </li><li> Fabricar pipetas de patch em uma micropipeta extrator P-87. Colocar uma pequena quantidade de cola de sutura numa extremidade de inserção da poli-lisina usando uma pipeta de remendo de 1,5 mm (diâmetro exterior de vidro) e de sucção (tubagem de silicone com um diâmetro interno de 0,89 milímetros com uma ponta de micropipeta ligada à extremidade de aspiração). </li><li> Realizar dissociações utilizando o mesmo procedimento tal como mencionado na secção protocolo 3 Figura 2. Colocar uma extremidade da medula espinal em que a cola de sutura e pressionar suavemente com uma pinça para aderir fortemente à superfície. Colocar uma gota de cola de sutura na outra extremidade da inserção e alongar suavemente a medula espinal até axônios são dissociados e prender a extremidade livre da medula espinal, arrastando-o suavemente sobre a cola de sutura. Fixe no lugar pressionando suave para baixo com a pinça. </li><li> Taxas bivalente libertar solução de Ringer com solução normal de Ringer por perfusão. </li><li> Permitir que os axônios se recuperar por 20 min pós dissociation a 10 ° C. </li><li> Fix axónios dissociados em 4% de paraformaldeído (PFA) {preparado de Tampão Fosfato Salino (PBS (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 a 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtre solução PFA antes da utilização através da passagem por um filtro de seringa de 0,2 uM. </li><li> Lavar a PFA irrigando glicina 0,1 M (em PBS) durante 10 min. </li><li> Incubar em 0,1% de Triton-X (em PBS) durante 10 min. </li><li> Lavar irrigando PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 6 horas a 4 ° C. </li><li> Adicionar em anticorpo primário para VGCC de interesse (diluição 1: 200 em PBS) e incuba-se durante 20 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar irrigando PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 5% de leite desnatado (em PBS) durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Adicionar em anticorpo secundário (1: 400 em PBS) e incuba-se escura durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar irrigando com PBS durante 20 min. </li><li> Bloco com 1% de soro bovino Albumin (em PBS) durante 20 min. </li><li> Adicionar em Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / ul concentração de trabalho; estoque preparadas em metanol a 200 Unidades / mL). </li><li> Lavar irrigando com PBS durante 20 min. </li><li> Imagem com lente de imersão em água 100X microscópio confocal. </li></ol> 6. eletrofisiológica Recording <ol><li> Fabricar pipetas de patch vidro alumino-silicato (resistência pipeta 2-5 mohms) em uma micropipeta extrator P-87. Projeto pipeta patch de tal forma que a ponta da pipeta engloba diâmetro inteiro terminal pré-sináptico. </li><li> PDMS remendo pipetas revestimento por imersão a pipeta de adesivo sob 50-60 psi de pressão em PDMS 23 (juntar um tubo de silicone, 0,89 mm de diâmetro interno, ligada a um cilindro de gás de azoto, para a extremidade traseira da pipeta patch) e secam-se utilizando um calor arma. Como alternativa, o revestimento manualmente pipeta com PDMS, aplicando o revestimento o mais próximo da ponta quanto possível, sob um microscópio composto. </li><li> Incêndio pipetas de patch polonês usando um microforge (um filamento de platina personalizado construído montada no palco de um microscópio composto). </li><li> Identificar axônios isolados demonstrando terminais pré-sinápticos marcados por microscopia de fluorescência. </li><li> Encha solução de gravação (concebido para isolar correntes de Ca 2 +, 10 mM de CaCl 2 ou 90 mM de BaCl2, como portador de carga, tamponada com HEPES, pH 7,6, osmolalidade 270 mOsm) para a pipeta de adesivo utilizando uma seringa. </li><li> Insira remendo pipeta no suporte da pipeta e posição acima do banho usando um MP225 motorizada manipulador. Abaixe cuidadosamente a pipeta de patch para o banho e posição contra o rosto de um terminal pré-sináptico fluorescently identificado. </li><li> Avança a pipeta remendo lentamente até que o contato é feito com a membrana. Neste ponto, conseguir uma vedação gigaohm por sucção boca suave através de um tubo colocado no suporte da pipeta. </li><li> Para atingir os níveis extremamente baixos de ruído de fundo necessários para a gravação de um único canal de Ca2 + correntes, use um Axopatch 200B com um andar de entrada arrefecida para as gravações. Os dados da amostra em 20-50 kHz e filtrar por 5 kHz filtro de Bessel. Realizar aquisição de dados utilizando um Axograph X. </li><li> Use um protocolo passo padrão, em incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar um pré-pulso no protocolo, o protocolo anterior passo, para assegurar activação máxima de canais de Ca 2 +. Incorporar uma mV etapa 10 vazamento no protocolo passo para pós-análise subtração das correntes de fuga. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Nosso protocolo de dissociação é significativo por ceder axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter funcional pré-sináptica terminais Figura 4c e 4d Figura. A ausência de processos pós-sinápticos que se opõem ao terminal pré-sináptico permite o acesso a gravação direta para a membrana rosto liberação pré-sináptica nos terminais pré-sinápticos individuais, que não eram possíveis...

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido e preciso. Ação potencial invasão do terminal pré-sináptico leva à abertura de VGCCs localizados na membrana rosto liberação, o aumento resultante na pré-sináptica de Ca2 + age como o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores 1. Todos estes passos ocorrem dentro de centenas de microsegundos 2, e, portanto, requerem acoplamento espacial de VGCCs apertado para a vesícula máquinas de fusão 3. Pré-sinápticos de Ca2 + fluxos têm sido caracterizadas principalmente por meio de imagens abordagens utilizando Ca2 + corantes sensíveis 4. Incorporando Ca2 tampões que modulam Ca2 + nos neurónios pré-sinápticos tem sido utilizado para caracterizar indirectamente a relação entre o cálcio pré-sináptico e a neurotransmissão 3. Além disso, a modulação da pré-sináptico livre concentração de Ca2 + por uncaging Ca2 + 5 ou gravação macroscopic correntes de Ca2 + têm sido utilizados em conjunção com medidas de fusão e / ou a libertação de vesículas; como medidas de capacitância 6 ou pós-sinápticos respostas 2 para abordar a mesma questão. No entanto, a caracterização de Ca2 + correntes directamente na face de libertação, a secção especializada da membrana pré-sináptica, onde a despolarização da membrana é convertida em Ca 2 + correntes provocando a fusão das vesículas sinápticas e a libertação de neurotransmissores, é essencial para se obter uma medida precisa do Ca2 requisito para a fusão das vesículas sinápticas. Além disso, a capacidade de caracterizar directamente as correntes de Ca2 + nos terminais pré-sinápticos individuais, acoplado com medições simultâneas precisos de fusão das vesículas e libertação permite uma elucidação preciso da relação de temporização entre o curso do tempo da acção potencial, pré-sináptico corrente 2 + Ca, fusão das vesículas e liberação. Acesso à membrana rosto liberaçãonão está disponível na maior parte dos terminais pré-sinápticos, devido a fechar por aposição dos dendritos pós-sinápticos. Esta inacessibilidade tem sido um grande obstáculo na caracterização de VGCCs uma vez que impede medidas diretas de corrente nos terminais pré-sinápticos individuais. Caracterização direta de pré-sinápticos Ca2 + correntes nos terminais pré-sinápticos individuais, até agora, não foi possível nas sinapses centrais e só foi alcançado em dois terminais pré-sinápticos do tipo coletor; cálice do tipo sinapse do pinto gânglio ciliar 7-10 e rato calyces 11,12. Em todos os outros terminais pré-sinápticos, incluindo a sinapse reticuloespinhal gigante na lampreia medula espinhal 13, a falta de acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica exigiu o uso de abordagens indiretas, tais como Ca2 + radiológico para o estudo pré-sinápticos de Ca2 + fluxos. <img alt="Figura 1" fo: content-width = src &quot;5 polegadas&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 lampreia sinapse reticuloespinhal gigante. (A) Secção transversal da lampreia medula espinhal indicando orientação dorso-ventral. Axônios reticulospinais são marcadas com asterisco verde. (B) reconstrução 3-D da sinapse reticuloespinhal na lampreia medula espinhal mostrando axônio pré-sináptico reticuloespinhal fazendo numerosos en passant contatos (marcado por setas verdes) sobre o neurônio pós-sináptico 13. Terminais pré-sinápticos têm sido marcados com Alexa Fluor 488 conjugado com hidrazida faloidina (verde), enquanto que o neurónio pós-sináptico foi preenchido com Alexa Fluor 568 hidrazida (vermelho). Lampreia gigantes axônios reticulospinais, localizado na região ventral da medula espinhal paralelo ao eixo Figura 1a rostral-caudal, forma múltipla en passant contatos sinápticos em neurônios doespinhal chifre ventral 14 Figura 1b 13. De célula inteira macroscópica Ca2 correntes foram registadas a partir de axônios reticulospinais na medula espinhal intacta 13,15. No entanto, tentativas anteriores para cegos medição directa de correntes de Ca 2 + em axónios reticulospinais na medula espinhal lampreia intacto usando ligado de células técnica de fixação de membranas 13, não têm tido sucesso, devido à falta de acesso à membrana cara de libertação pré-sináptica devido aos processos de pós-sinápticos opostas Figura 1b. A membrana de libertação cara tenha sido previamente tornado acessível pela remoção do neurónio pós-sináptico 11, perturbação mecânica da sinapse antes da gravação de 12 ou tratamento enzimático acoplado com dissociação mecânica 16. Dada a complexa organização da medula espinhal, que seria extremamente difícil identificar o neurônio pós-sináptico e recolhê-lo mecanicamente ou perturbar ªe sinapse. Por isso, decidimos usar o tratamento enzimático 17 seguido de dissociação mecânica. Usando essa abordagem, temos desenvolvido uma preparação profundamente dissociada da lampreia medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados viáveis ​​com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de quaisquer processos de pós-sinápticos, proporcionando assim o acesso irrestrito aos terminais pré-sinápticos individuais. Em conjunto com um microscópio invertido padrão e imagens de fluorescência, que nos permite identificar e alvejar terminais pré-sinápticos fluorescente identificados individualmente, com uma pipeta de patch que contém uma solução de gravação que isola as correntes de Ca2 + 4c figura e Figura 4d, para gravar utilizando célula- ligado técnica tensão-grampo. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana rosto liberação pré-sináptica de indivíduo terminais pré-sinápticos Figura 4f. Este é um significant avanço no campo da transmissão sináptica, uma vez que é o primeiro exemplo de gravação a ser realizada nas sinapses centrais.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

A transmissão sináptica é um processo extremamente rápido. O potencial de ação dirigido influxo de Ca2 + para o terminal pré-sináptico, através de canais de cálcio dependentes da voltagem (VGCCs) localizados na membrana rosto lançamento, é o gatilho para a fusão das vesículas e liberação de neurotransmissores. Crucial para a rapidez da transmissão sináptica é a sincronia espacial e temporal entre a chegada do potencial de acção, e a maquinaria VGCCs a libertação de neurotransmissores. A capacidade de gravar diretamente de Ca2 + correntes da membrana rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais é imprescindível para uma compreensão precisa da relação entre pré-sináptica de Ca2 + e liberação de neurotransmissores. Acesso à membrana rosto liberação pré-sináptica para a gravação eletrofisiológico ainda não está disponível na maioria das preparações e Ca 2 + entrada pré-sináptica tem sido caracterizada utilizando técnicas de imagem e MeasureMe atual macroscópicoNTS - técnicas que não têm resolução temporal suficiente para visualizar Ca2 + entrada. A caracterização de VGCCs diretamente nos terminais pré-sinápticos individuais não foi possível nas sinapses centrais e, até agora, foi alcançado com sucesso apenas no tipo cálice sinapse do gânglio ciliar e pinto em cálices de ratos. Temos abordado com sucesso este problema na sinapse reticuloespinhal gigante da lampreia medula espinhal através do desenvolvimento de uma preparação agudamente dissociada da medula espinhal que produz axônios reticulospinais isolados com terminais pré-sinápticos funcionais desprovidas de estruturas pós-sinápticos. Podemos fluorescently rotular e identificar terminais pré-sinápticos individuais e orientá-las para a gravação. Usando esta preparação, caracterizamos VGCCs diretamente para o rosto liberação de terminais pré-sinápticos individuais usando imunohistoquímica e eletrofisiologia abordagens. Ca2 + correntes foram registrados diretamente na membrana o rosto liberaçãoterminais pré-sinápticos individuais de f, o primeiro registo a ser realizada nas sinapses centrais.

<html> Isso gera protocolo dissociação saudáveis ​​e funcionais axônios reticulospinais isoladas desprovidas de pós-sináptico projeções Figura 2f, mas que, no entanto, manter os terminais pré-sinápticos funcionais capazes de evocado vesículas sinápticas exo-e endocitose Figura 4c e 4d Figura. Secções das regiões isoladas dos axônios reticulospinais podem ser claramente identificados em microscópio de luz para estar livre de quaisquer outros processos...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K visualizações.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

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Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Bioquímica

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Gravações fisiológicos de NMJs Output High and Low no músculo extensor Crayfish Leg

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Neurociência

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Biologia

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparações e protocolos para toda célula Patch Clamp gravação de neurônios Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Estimulação optogenética e registro eletrofisiológico de eventos sinápticos em fatias de cérebro de rato

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Resumo

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