This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1. Herstellung von Poly-D-Lysin-Hydrobromid <ol><li> Vorbereitung 1 mg / ml Poly-D-Lysin-Hydrobromid in 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5). </li><li> Aliquoten und bei -20 ° C. </li></ol> 2. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser Hinweis: Führen Sie alle Reinigungs und Beschichtungsschritte in einer laminaren Strömungskammer. <ol><li> Deck Ort in eine Petrischale mit 1 N Salzsäure (HCl) für 2 Stunden. </li><li> Saugen Sie alle HCl und spülen mit 70% Ethanol (EtOH) 2-3 x. </li><li> Lassen Sie in 70% EtOH für 1 Stunde. </li><li> Saugen Sie alle 70% EtOH und spülen Sie mit 100% EtOH 2-3x. </li><li> Lassen Sie in 100% EtOH für 2 Stunden. Saugen Sie alle EtOH. </li><li> Trocken tupfen und mit Filterpapier an der Luft trocknen für ein paar Sekunden. </li><li> Ort O / N auf 1 mg / ml Poly-Lysin-Lösung. </li><li> Spülen Deckgläser nächsten Tag mit Millipore-Wasser 4-5x. </li><li> Luft trocknen Poly-Lysin beschichtete Deckgläser auf Glasrollen in einer sauberen Petrischale. </li><li> Für immunohistochemistry, verwenden 35 x 10 mm Petrischale Deckel. Bereiten Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) ausgekleidet Gerichte durch Gießen PDMS (Elastomer und Härter 10: 1 nach Gewicht) in die Schüssel zu einer Dicke von 0,3 cm und lassen bei 30 ° CO / N eingestellt. Sobald dies eingestellt, schneiden Sie ein 2 cm x 1 cm in die PDMS eingelassen. Sauber und Beschichtung der Einsatz mit Poly-Lysin folgenden wie oben erwähnt für Deck die gleichen Schritte. </li><li> Shop poly-Lysin beschichtete Deckgläser und Geschirr in der Laminar-Flow-Kammer bedeckt bis zur Verwendung (bis zu 2 Wochen, aber erzielen beste Ergebnisse Klebstoff durch die Vorbereitung regelmäßig alle 3-4 Tage). </li><li> Bereiten Sie eine PDMS-Block, der in der vibrierenden Gewebe Slicer Pin das Rückenmark. Mischung Elastomer A und Elastomer B 1: 1 beträgt. Gießen Sie in einer 100 x 15 mm Petrischale und lassen Sie O / N bei 30 ° C eingestellt. Schneiden Sie ein rechteckiges Stück der PMDS und kleben Sie es auf die Schneidegrundplatte mit Epoxy-Kleber. Lassen Sie den Kleber zur Festsetzung der PDMS in Kraft gesetzt und in Scheiben schneiden mehrere dünne Schnitte von der Oberfläche eine Wohnung zu erhaltenOberfläche, um das Gewebe zu fixieren. </li></ol> 3. Akute Dissoziation von Neunauge Rückenmark zu Isolierte retikulospinale Axone Ausbeute <ol><li> Betäuben eine ammoecoete oder Erwachsener Neunauge (Petromyzon marinus) mit Tricaine Methansulfonats (MS-222; 100 mg / L). Narkose hinzufügen in das Wasser, in einen Plastikbecher mit einem Deckel abgedeckt, die das Neunauge geopfert werden. </li><li> Enthaupten Neunauge in kaltem (4 ° C) Ringer-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mm): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 Dextrose (pH-Wert 7,6, die Osmolarität 270 mOsm) und nehmen Körper Wandmuskulatur Rückenfläche des Rückenmarks aus. </li><li> Hirnhaut entfernen Primitiva von der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Sie ventralen Hirnhaut Primitiva in diesem Stadium nicht entfernen. </li><li> Geschnitten Rückenmark in 1 cm lange Stücke schneiden. </li><li> PIN eines Rückenmarkstück mit feinen Insektenstifte, dorsale Seite nach oben, auf ein PDMS ausgekleidet Schneiden BODENPLAte (siehe 2.12) in einer vibrierenden Gewebe Schneidemaschine Kammer mit eiskalter Ringer-Lösung. </li><li> Entfernen eines zentralen Abschnitts der dorsalen Säule des Rückenmarks durch Schneiden entlang der rostro-kaudalen Achse mit der Klinge, hinter intakte Rückenstützenabschnitte am rostralen und kaudalen Enden dienen als während der Dissoziation 2a und 2b behandelt. Verwenden langsamste Geschwindigkeit Einstellung, die das Schneiden und eine Tiefeneinstellung, die nur die dorsalen Säule Verlassen des zugrunde liegenden retikulospinale Axon Spalte unbeschädigt entfernt 2b ermöglicht. </li><li> Inkubieren Scheiben geschnitten Rückenmark Stücke bei RT für 45 min in einem Cocktail von 1 mg / ml Protease (Typ XIV aus Streptomyces griseus) und 1 mg / ml Kollagenase in Ringer-Lösung (Typ IA aus Clostridium histolyticum) (aus El Manira &amp; Bussières angepasst 1997 17). </li><li> Pin Enzym-behandelten Rückenmark Stücke mit feinen Nadeln in einem PDMS ausgekleidet Petrischale Containing Kälte (4 ° C) Ringer-Lösung. </li><li> Ventralen Hirnhaut entfernen Primitiva mit feinen Pinzette. </li><li> Geschnitten seitlichen Flächen des Rückenmarks mit einem Skalpell in der Mitte des geschnittenen Rückenabschnitt Verlassen der Mittelsäule retikulospinale Axone intakt in das Rückenmark 2d. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf dem Objektiv. </li><li> Legen Sie die Poly-Lysin beschichtete Deckglas (3a, Oberteil, rotes Rechteck) in den Schlitz der Aufnahmekammer 3 und Vakuum Fett auf alle Kanten (Raum zwischen roten und blauen Rechtecke in 3a, um eine Dichtung zu erleichtern. Schraube die oben einrasten. Setzen Sie die Kammer in dem Einsatz auf der Aufzeichnungs rig. </li><li> Hinzufügen Ringer-Lösung in die Aufzeichnungskammer unter Verwendung einer Pasteurpipette. </li><li> Schließen Sie den Abfluss Schlauch der Druckflasche mit Frostschutzmittel in die thermoelektrische Kühlvorrichtung Eingangsschlauch. Schließen Sie den Ausgut Schlauch der thermoelektrischen Kühlvorrichtung mit dem Eingangsende des Außenkühlmantel und dem Ausgangsende zu dem Reservoir 3b. </li><li> Legen Sie ein Stück des Rückenmarks zu einer Zeit, in der Aufnahme Kammer und sanft trennen das Rückenmark Aufrechterhaltung es entlang der Deckglas zu allen Zeiten mit Teflon beschichtet Pinzette bis Axone isoliert 2e und 2f. </li><li> Bringen des Aufzeichnungslösungstemperatur auf 10 ° C durch Leiten des unter Druck (Stickstoffgas in die Flasche geschoben) Frostschutzmittellösung (durch Verschiebung), über die thermoelektrische Kühlvorrichtung, durch die äußere Kühlmantel der Aufnahmekammer 3b. </li><li> Ermöglichen Axone für 1 h nach der Dissoziation bei 10 ° C erholen. </li></ol><img alt="Figur 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Abbildung 2. Schematische Darstellung der Dissoziation Protokoll für die Isolierung der Axone retikulospinale. (A) Entfernung von dorsalen Säule. Der Pfeil zeigt die Richtung des Schneidens des Gewebes. Die Rückenwirbel werden durch das Alphabet D (red Schriftfarbe) gekennzeichnet, während die ventralen Hörnern des Alphabets V (roter Schrift Farbe). (B) dorsalen Säule in dem zentralen Abschnitt des Rückenmarks Aussetzen der retikulospinale Axone entfernt (grüne Linien ). Die ventralen Hörner, die nach dem Schneiden Prozess intakt bleiben, werden durch das Alphabet V (rot Schriftfarbe) gekennzeichnet. (C) 45 min Behandlung mit Protease und Kollagenase Enzymen Cocktail (1 mg / ml). (D) Schneiden von Seitenbahnen des Rückenmarks; die die Position, Richtung und Ausmaß der seitlichen Schnitt. (e) mechanische Dissoziation des Rückenmarks. Pfeile zeigen Position der Zange und die Richtung der Trennkraft während Dissoziation. (F) Vertreve Beispiel dissoziiert retikulospinale Axon Vorbereitung. Grüne Pfeile markieren Bereiche mit akut dissoziiert retikulospinale Axone ohne postsynaptischen Prozesse. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Aufnahme Kammer für die Elektrophysiologie Experimente. Maße vorgesehenen Zoll. In basepiece Diagramm (a) gezeigt rote Rechteck zeigt Positionierung des Deckglases in dem Deckglas Nut in der basepiece. Der Bereich zwischen der roten und blauen Rechteck, in dem basepiece Diagramm (a) gezeigt ist, wo die Hochvakuumfett angewendet wird. (B) zeigt die Aufnahme Kammer montiert. 4. Kennzeichnung und Identifizierung von präsynaptischen Enden mit FM 1-43 <ol><li> Beschriften Sie präsynaptischen Terminals, durch den Einbau von FM 1-43 in vesicles während der synaptischen exo-Endozytose in der Hoch K + Depolarisation. Perfundieren Vorbereitung mit 5 uM FM 1-43 (in 5 ml Ringer-Lösung, die 30 mM KCl). </li><li> Perfusion Präparat mit 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml Ringer-Lösung), um überschüssigen Farbstoff FM) 18 zu entfernen. </li><li> Perfusion Zubereitung mit Ringerlösung für 15 Minuten, um jede Remant Farbstoff und dem Advasep auszuwaschen. </li><li> Bild mit 100 × Ölimmersionsobjektiv (NA 1,25) an einem invertierten Fluoreszenzmikroskop, in Verbindung mit einer digitalen CCD-Kamera und Bildaufnahme-Software Mikromanager unter Verwendung von Standardfluoreszenzbildgebungsprotokolle. </li><li> Identifizieren fluoreszenzmarkierten präsynaptischen Enden für die Aufnahme 4c und 4d Ziel. </li></ol> 5. Immunhistochemie von isolierten retikulospinale Axone <ol><li> Füllen Gericht Einsatz (Protokoll Abschnitt 2.10.) Mit zweiwertigen Ionen (Ca 2 + und Mg 2 +) kostenlosRinger-Lösung. </li><li> Fertigen Patch-Pipetten in einem P-87-Mikropipette Puller. Legen Sie eine kleine Menge von Nahtkleber an einem Ende des Poly-Lysin-Einschub mit einer Patch-Pipette (1,5 mm Durchmesser Glasaußen) und Absaugung (mit einem Silikonschlauch 0,89 mm Innendurchmesser mit einer Mikropipette Spitze an der Ansaugseite beigefügt). </li><li> Führen Sie Dissoziationen mit dem gleichen Verfahren wie in Abschnitt 3 Protokoll 2 erwähnt. Platzieren Sie ein Ende des Rückenmarks auf der Naht Kleber und drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette, um sie stark an der Oberfläche haftet. Legen Sie einen Tropfen Leim Naht am anderen Ende des Einsatzes und sanft dehnen das Rückenmark bis Axone dissoziiert sind und sich die freie Ende des Rückenmarks, indem Sie sie vorsichtig über die Nahtkleber. Fixieren durch sanftes Herunterdrücken mit der Zange. </li><li> Austausch zweiwertigen Ringerlösung mit regelmäßigen Ringer-Lösung durch Perfusion. </li><li> Axone erlauben, für 20 min nach dissoc erholeniation bei 10 ° C aufweist. </li><li> Fix dissoziiert Axone in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min {in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10 KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4) hergestellt}. Filtern PFA Lösung vor, indem sie durch einen 0,2 um-Spritzenfilter verwenden. </li><li> Auswaschen der PFA durch Perfusion 0,1 M Glycin (in PBS) für 10 min. </li><li> Inkubieren in 0,1% Triton-X (in PBS) für 10 min. </li><li> Durch Perfusion PBS für 20 min waschen. </li><li> Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 6 Stunden bei 4 ° C ist. </li><li> Fügen Sie in primären Antikörpers an VGCC von Interesse (1: 200-Verdünnung in PBS) und Inkubation für 20 h bei 4 ° C. </li><li> Durch Perfusion PBS für 20 min waschen. </li><li> Blockieren mit 5% fettfreier Milch (in PBS) für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Fügen in sekundären Antikörper (1: 400-Verdünnung in PBS) und Inkubation in Dunkelheit für 2 h bei 4 ° C ist. </li><li> Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen. </li><li> Block mit 1% Rinderserum Albumin (in PBS) für 20 min. </li><li> Fügen Sie in Alexa Fluor 488 Phalloidin (5 Einheiten / ul Arbeitskonzentration; Lager in Methanol 200 Einheiten / ml) hergestellt. </li><li> Durch Perfusion mit PBS für 20 min waschen. </li><li> Bild mit 100X Wasserimmersionslinse auf konfokalen Mikroskop. </li></ol> 6. Elektrophysiologische Aufnahme <ol><li> Herzustellen Aluminosilicatglas Patch-Pipetten (2-5 Pipettenwiderstand MQ) in einem P-87-Mikropipette Puller. Design Patch-Pipette, so dass Pipettenspitze umfasst ganze präsynaptischen Terminal Durchmesser. </li><li> PDMS Mantel Patchpipetten durch Eintauchen der Patch-Pipette unter 50-60 psi Druck in PDMS 23 (Anschluss Silikonschlauch, 0,89 mm Innendurchmesser, mit einem Stickstoffgaszylinder verbunden ist, um das hintere Ende der Patch-Pipette) und Trocknen unter Verwendung einer Heiß Pistole. Alternativ manuell Beschichtung der Pipette mit PDMS, eine Beschichtung, so nahe an der Spitze, wie möglich, unter einer zusammengesetzten Mikroskop. </li><li> Feuerpolitur Patch-Pipetten mit einem MICRoforge (a custom built Platin Filament auf die Bühne einer Verbindung Mikroskop montiert). </li><li> Identifizieren isoliert Axone zeigen beschriftet präsynaptischen Enden durch Fluoreszenzmikroskopie. </li><li> Füllen Aufzeichnungslösung (Ca 2 + entwickelt, um Ströme zu isolieren; 10 mM CaCl 2 oder 90 mM BaCl 2 als Ladungsträger, gepufferte HEPES pH 7,6, Osmolarität 270 mOsm) in der Patch-Pipette mit einer Spritze. </li><li> Legen Patch-Pipette in die Pipettenhalter und Position über Bad mit einem motorisierten Manipulator MP225. Senken Sie die Patch-Pipette in das Bad und die Position gegen das Gesicht eines fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminal. </li><li> Schieben Sie den Patch-Pipette langsam, bis ein Kontakt mit der Membran gemacht. Zu diesem Zeitpunkt erreicht eine Gigaohm Dichtung durch sanftes Saugen Mund durch einen Schlauch der Pipettenhalter befestigt. </li><li> Um die für die Aufnahme einzelner Kanal Ca2 + Ströme benötigt extrem niedrigen Hintergrundgeräuschpegel zu erreichen, benötigen Sie ein Axopatch 200B mit einer gekühlten heads für die Aufnahmen. Beispieldaten bei 20-50 kHz und Filter mit einem 5 kHz Bessel-Filter. Führen Sie die Datenerfassung mit Hilfe eines Axograph X. </li><li> Verwenden Sie ein Standard-Schritt-Protokoll, in Schritten von 10 mV als Stimulus. Enthalten einen Vorimpuls in dem Protokoll, vor der Schritt-Protokoll, um eine maximale Aktivierung von Ca 2 +-Kanäle zu gewährleisten. Integrieren Sie eine 10 mV Leck Schritt in die Schritt-Protokoll für die post-Analyse Subtraktion der Leckströme. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Unsere Dissoziation Protokoll ist durch Abgabe isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f signifikant, aber dennoch funktionellen präsynaptischen 4c und 4d zu behalten. Das Fehlen von postsynaptischen Prozesse gegen die präsynaptischen Terminal ermöglicht den direkten Zugriff auf die Aufnahme der präsynaptischen Membran Trennfläche bei Einzel präsynaptischen Terminals, die zuvor in zentralen Synapsen nicht möglich ist und in nur zwe...

Synaptischen Übertragung ist eine extrem schnelle und präzise Prozess. Aktionspotential Invasion der präsynaptischen Terminal führt zum Öffnen VGCCs in der Trennfläche Membran, die daraus resultierende Erhöhung der präsynaptischen Ca2 + als Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern 1 wirkenden entfernt. Alle diese Schritte werden innerhalb von hundert Mikrosekunden 2, und erfordern daher enge räumliche Kopplung von VGCCs auf die Fusion von Vesikeln Maschinen 3. Präsynaptischen Ca2 + Flüsse wurden in erster Linie durch bildgebende Ansätze mit Ca2 +-sensitiven Farbstoffen 4 gekennzeichnet. Einbau Ca 2 +-Puffer, die Ca 2 + modulieren präsynaptischen Neuronen wurde verwendet, um indirekt zu charakterisieren, die die Beziehung zwischen präsynaptischen Calcium und Neurotransmission 3. Darüber hinaus Modulation der präsynaptischen Ca2 +-Konzentration frei von Uncaging Ca 2 + 5 oder Aufnahme macroscopic Ca 2 + Strömungen in Verbindung mit Maßnahmen der Fusion von Vesikeln und / oder Freisetzung verwendet; wie Kapazitätsmessungen 6 oder postsynaptischen Antworten 2, um die gleiche Frage anzugehen. Allerdings Charakterisierung Ca2 + Ströme direkt an der Trennfläche, die Fachgruppe der präsynaptischen Membran, wo Depolarisation der Membran ist in Ca 2 + übersetzt Ströme Auslösung synaptischen Vesikel Fusion und Freisetzung von Neurotransmittern, ist integraler Bestandteil erhalten eine genaue Messung der Ca 2 + Voraussetzung für die synaptischen Vesikel Fusion. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, direkt zu charakterisieren Ca2 + Ströme an einzelnen präsynaptischen Enden, verbunden mit genauen gleichzeitige Messungen Vesikelverschmelzung und Freisetzung ermöglicht eine genaue Erläuterung der zeitlichen Beziehung zwischen dem Zeitverlauf des Aktionspotentials, präsynaptischen Ca 2 + Strom, Fusion von Vesikeln und loslassen. Zugriff auf die Trennfläche Membranist nicht in der Mehrheit der präsynaptischen Enden durch Anlagerung von den postsynaptischen Dendriten zu schließen. Diese Unzugänglichkeit ist ein großes Hindernis bei der Charakterisierung von VGCCs, da es verhindert, dass direkte Messungen von Strom an einzelnen präsynaptischen Terminals. Direkte Charakterisierung der präsynaptischen Ca2 + Ströme bei einzelnen präsynaptischen bisher nicht im Zentrum von Synapsen möglich und wurde nur in zwei Kelchtyp präsynaptischen erreicht worden; Kelch-Typ-Synapse der Küken Ciliarganglion 7-10 und Ratten Kelche 11,12. In allen anderen präsynaptischen einschließlich der riesigen retikulospinale Synapse in der Neunauge Rückenmark 13, hat der Mangel an Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche die Verwendung der indirekten Ansätze notwendig, wie Ca 2 +-Bildgebung zu präsynaptischen Ca2 + Flüsse zu studieren. <img alt="Figur 1" fo: content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1. Neunauge Riesen retikulospinale Synapse. (A) Querschnitt von Neunauge Rückenmark zeigt dorso-ventralen Ausrichtung. Retikulospinale Axone sind mit grünen Stern markiert. (B) 3-D-Rekonstruktion des retikulospinale Synapse im Rückenmark, die Neunauge präsynaptischen Axon retikulospinale machen zahlreiche en passant Kontakte (durch grüne Pfeile markiert) auf der postsynaptischen Neuron 13. Präsynaptischen Terminals wurden mit Alexa Fluor 488 Hydrazid Phalloidin (grün) markiert worden, während der postsynaptischen Neuron mit Alexa Fluor 568 Hydrazid (rot) gefüllt wurde. Neunauge Riesen retikulospinale Axone, in der ventralen Region des Rückenmarks parallel zur rostral-kaudale Achse 1a, Form mehrerer en passant synaptische Kontakte liegt auf Neuronen desVorderhorn des Rücken 14 1b 13. Makroskopischen Ganzzell Ca2 + Ströme wurden von retikulospinale Axone im Rückenmark intakt 13,15 aufgezeichnet. Allerdings vorherigen Blindversuche direkte Messung von Ca2 + Ströme in retikulospinale Axone im Rückenmark intakt Neunauge mit Cell-Attached-Patch-Clamp-Technik erfolglos 13 aufgrund fehlender Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche durch den gegenüberliegenden postsynaptischen Prozesse bewährt Abbildung 1b. Die Trennfläche Membran zuvor zugänglich durch Entfernen der postsynaptischen Neuron 11, mechanische Störung des Synapse vor der Aufzeichnung 12 oder enzymatische Behandlung in Verbindung mit mechanischer Dissoziation 16 hergestellt. Angesichts der komplexen Organisation des Rückenmarks, kann es äußerst schwierig sein würde, die postsynaptischen Neuron identifizieren und zurückgezogen werden mechanisch oder stören the Synapse. Daher haben wir beschlossen, enzymatische Behandlung 17, gefolgt von mechanischen Dissoziation zu verwenden. Mit diesem Ansatz haben wir eine akut dissoziierten Vorbereitung der Neunauge Rückenmark, das lebensfähig isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen ohne jegliche postsynaptischen Prozesse ergibt entwickelt, wodurch eine uneingeschränkte Zugriff auf die einzelnen präsynaptischen Terminals. In Verbindung mit einem Standard-Umkehrmikroskop und Fluoreszenz-Bildgebung ermöglicht es uns zu erkennen und gezielt einzelne fluoreszenz identifiziert präsynaptischen Terminals, mit einer Patch-Pipette, die eine Aufzeichnungslösung, die Ca 2 + Ströme 4c und 4d-Isolate, für die Aufnahme mit zell angebracht Voltage-Clamp-Technik. Ca 2 + Ströme wurden direkt an der präsynaptischen Membran Trennfläche der einzelnen präsynaptischen 4f aufgezeichnet. Dies ist eine significaNT im Bereich der synaptischen Übertragung Durchbruch, da es die erste derartige Aufnahme bei zentralen Synapsen durchgeführt werden soll.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

Synaptischen Übertragung ist ein extrem schnelles Verfahren. Aktionspotential angetrieben Einstrom von Ca 2 + in den präsynaptischen Terminal durch spannungsabhängige Kalziumkanäle (VGCCs) in der Trennfläche Membran befindet, ist der Auslöser für die Fusion von Vesikeln und die Freisetzung von Neurotransmittern. Entscheidend für die Schnelligkeit der synaptischen Übertragung ist die räumliche und zeitliche Synchronität zwischen der Ankunft des Aktionspotentials, VGCCs und der Neurotransmitter-Freisetzung Maschinen. Die Möglichkeit, direkt aufzeichnen Ca2 + Ströme von der Trennfläche Membran der einzelnen präsynaptischen ist zwingend notwendig für eine genaue Verständnis der Beziehung zwischen präsynaptischen Ca2 + und die Freisetzung von Neurotransmittern. Zugang zu der präsynaptischen Membran Trennfläche für elektrophysiologische Aufzeichnung ist nicht verfügbar in den meisten Präparaten und präsynaptischen Ca2 +-Eintrag wurde mit bildgebenden Techniken und makroskopischen Strom MeasureMe gekennzeichnetNTS - Techniken, die nicht über ausreichende zeitliche Auflösung zu Ca 2 +-Eintrag zu visualisieren. Die Charakterisierung der VGCCs direkt an einzelnen präsynaptischen war nicht in zentralen Synapsen möglich und wurde bisher erfolgreich nur in der Kelch-Typ-Synapse des Kükens Ciliarganglion und in Ratten Kelche erreicht. Wir haben erfolgreich in der Riesensynapse retikulospinale der Neunauge Rückenmark durch die Entwicklung einer akut dissoziierten Vorbereitung des Rückenmarks, die isoliert retikulospinale Axone mit funktionellen präsynaptischen frei von postsynaptischen Strukturen ergibt adressiert dieses Problem. Wir können fluoreszenzkennzeichnen und zu identifizieren einzelnen präsynaptischen und Ziel sie für die Aufnahme. Mit dieser Vorbereitung, wir haben VGCCs direkt an der Trennfläche der einzelnen präsynaptischen Enden mittels Immunhistochemie und Elektro Ansätze aus. Ca 2 + Ströme wurden direkt an der Trennfläche Membran o aufgezeichnetf einzelnen präsynaptischen Terminals, die erste derartige Aufnahme an zentralen Synapsen durchgeführt werden.

<html> Diese Dissoziation Protokoll Erträge gesunde und funktionelle isoliert retikulospinale Axonen frei von Projektionen postsynaptischen 2f, die aber dennoch behalten funktionellen präsynaptischen Enden der Lage, hervorgerufen synaptischen Vesikel Exo-und Endozytose 4c und 4d. Abschnitte der isolierten Regionen der retikulospinale Axone kann unter Lichtmikroskopie eindeutig identifiziert werden klar von anderen neuronalen Prozesse ermöglicht uneingeschränkten Zugr...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Aufrufe.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Serie: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Patch-Clamp-Aufnahmen auf Intact Dorsalwurzelganglien von erwachsenen Ratten

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Forschung

Biochemie

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Physiologische Aufnahmen von High-und Low Output NMJs auf der Crayfish Leg Streckmuskel

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Dissecting und Aufnahme von C. elegans neuromuskulären Synapse

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Biologie

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Fokale Macropatch Aufnahmen der synaptischen Ströme aus der Drosophila larvalen neuromuskulären Synapse

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Vorbereitungen und Protokolle für die ganze Zelle Patch Clamp Aufnahme von Xenopus Laevis Tectal Neuronen

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Live-Bildgebung des synaptischen Vesikelrecyclings in der neuromuskulären Verbindung von sezierten Zebrafischlarven

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetische Stimulation und elektrophysiologische Aufzeichnung synaptischer Ereignisse in Hirnschnitten von Ratten

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...

Akute Dissoziation von Neunauge retikulospinale Axone in den Aufnahme von der Trennfläche Membran einzelner Funktions präsynaptischen aktivieren

Zusammenfassung

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