This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1. Preparación de poli-D-lisina bromhidrato <ol><li> Preparar bromhidrato de poli-D-lisina 1 mg / ml en tampón borato 0,1 M (pH 8,5). </li><li> Alícuota y almacenar a -20 ° C. </li></ol> Recubrimiento 2. poli-lisina de Cubreobjetos Nota: Llevar a cabo todos los pasos de limpieza y revestimiento en una cámara de flujo laminar. <ol><li> Coloque los portaobjetos en una placa de Petri que contiene 1 N de ácido clorhídrico (HCl) durante 2 horas. </li><li> Aspire todo el HCl y enjuague con un 70% de etanol (EtOH) 2-3 veces. </li><li> Deja en EtOH al 70% durante 1 hora. </li><li> Aspire todo el EtOH al 70% y enjuague con EtOH al 100% 2-3x. </li><li> Deja en EtOH al 100% durante 2 horas. Aspirar todo EtOH. </li><li> Secar con papel de filtro y secar al aire durante unos pocos segundos. </li><li> Lugar O N en 1 mg solución poli-lisina / / ml. </li><li> Enjuague cubreobjetos día siguiente con 4-5x agua Millipore. </li><li> Aire seco poli-lisina recubierto cubreobjetos sobre rodillos de cristal en una placa de Petri limpia. </li><li> Para immunohistochemistry, utilizar 35 x 10 mm de Petri tapas de los recipientes. Preparar Sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) forrado platos vertiendo PDMS (elastómero y agente de curado de 10: 1 en peso) en el plato con un grosor de 0,3 cm y permita que se asiente en el 30 ° CO / N. Una vez que esto se ha puesto, cortar unos 2 cm por 1 cm emplazada en el PDMS. Limpiar y recubrir la inserción con poli-lisina siguiendo los mismos pasos como se mencionó anteriormente para cubreobjetos. </li><li> Tienda cubreobjetos y platos recubiertos de poli-lisina cubiertos dentro de la cámara de flujo laminar hasta su uso (hasta 2 semanas, pero lograr mejores resultados mediante la preparación de adhesivos periódicamente cada 3-4 días). </li><li> Preparar un bloque PDMS, al pin de la médula espinal en la máquina de cortar el tejido que vibra. Mix Elastómero A y B Elastómero 1: 1 en peso. Vierta la mezcla en un plato 100 x 15 mm de Petri y permita que se asiente O / N a 30 ° C. Corte un pedazo rectangular de los PMDS y péguelo en la placa base de corte utilizando pegamento epóxico. Deje que el pegamento se seque la fijación de los PDMS en lugar y cortar varias secciones delgadas de la superficie para obtener un pisosuperficie a la clavija del tejido en. </li></ol> 3. aguda disociación de la lamprea de la médula espinal al rendimiento aislado axones reticuloespinal <ol><li> Anestesiar a un ammoecoete o adulto lamprea (Petromyzon marinus) con metanosulfonato tricaína (MS-222, 100 mg / L). Añadir anestésico en el agua, en un vaso de plástico cubierto por una tapa, que contiene la lamprea para ser sacrificado. </li><li> Decapitar lamprea en frío (4 ° C) solución de Ringer de la siguiente composición (en mM): 130 NaCl, 2,1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1,8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 de dextrosa (pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) y retirar el cuerpo músculos de la pared para exponer la superficie dorsal de la médula espinal. </li><li> Eliminar meninge primitiva de la superficie dorsal de la médula espinal utilizando unas pinzas finas. No retire primitiva meninge ventral en esta etapa. </li><li> Cortar la médula espinal en trozos de 1 cm de largo. </li><li> Pin un pedazo de la médula espinal con alfileres de insectos finas, frente a lado dorsal hacia arriba, sobre un PDMS forrado rebanar pla de baseTE (véase 2.12) en una cámara de la máquina de cortar tejido vibrante que contiene la solución de Ringer enfriada con hielo. </li><li> Eliminar una sección central de la columna dorsal de la médula espinal por corte a lo largo del eje rostro-caudal con la hoja, dejando tras de secciones de columna dorsal intactos en el rostral y caudal termina para servir como asas durante el proceso de disociación Figura 2a y la Figura 2b. Use ajuste de velocidad más lenta que permite cortar y un ajuste de la profundidad que elimina sólo la columna de la dorsal dejando la columna subyacente axón reticulospinal Figura 2b sin daños. </li><li> Incubar en rodajas piezas de la médula espinal a ta durante 45 min en un cóctel de 1 mg / ml de proteasa (Tipo XIV de Streptomyces griseus) y 1 mg / ml de colagenasa preparado (Tipo IA de Clostridium histolyticum) en solución de Ringer (adaptado de El Manira y Bussières , 1997 17). </li><li> Piezas de la médula espinal tratados con enzimas Pin utilizando pasadores finos en una placa de Petri de PDMS se alinearon contanando frío (4 ° C) solución de Ringer. </li><li> Retire primitiva meninge ventral con unas pinzas finas. </li><li> Cortar secciones laterales de la médula espinal con una hoja de bisturí en el punto medio de la sección dorsal rodajas de salir de la columna central de los axones intactos reticulospinales en la médula espinal Figura 2d. </li><li> Ponga una gota de aceite de inmersión en el objetivo. </li><li> Coloque el cubreobjetos poli-lisina recubierto (Figura 3a, la pieza superior, un rectángulo rojo) en la ranura de la cámara de grabación de la figura 3 y aplicar grasa de vacío para todos los bordes (espacio entre los rectángulos rojos y azules en la Figura 3a, para facilitar un sello. Tornillo la parte superior en su lugar. Coloque la cámara en la inserción en el equipo de grabación. </li><li> Añadir la solución de Ringer en la cámara de grabación usando una pipeta Pasteur. </li><li> Conectar la tubería de salida de la botella de presión que contiene solución anticongelante a la tubería de entrada del dispositivo de refrigeración termoeléctrica. Conecte el caliut tubo del dispositivo de refrigeración termoeléctrica al extremo de entrada de la camisa de refrigeración exterior y el extremo de salida al depósito de la Figura 3b. </li><li> Colocar una pieza de la médula espinal a la vez en la cámara de grabación y separar suavemente la médula espinal mantener a lo largo del cubreobjetos en todo momento utilizando fórceps recubiertos de teflón hasta que los axones están aislados Figura 2e y la figura 2f. </li><li> Llevar la temperatura de la solución de grabación a 10 ° C haciendo pasar la (gas nitrógeno es empujado dentro de la botella) presurizado solución anticongelante (por el desplazamiento), a través del dispositivo de refrigeración termoeléctrica, a través de la camisa de refrigeración externa de la cámara de grabación de la figura 3b. </li><li> Permitir que los axones se recuperen para el post disociación de 1 hora a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2. descripción esquemática de disociación de protocolo para el aislamiento de los axones reticulospinal. (A) La eliminación de la columna dorsal. La flecha indica la dirección de corte del tejido. Los cuernos dorsales están marcados por el alfabeto D (color fuente roja), mientras que los cuernos ventrales por el alfabeto V (color de fuente rojo). (B) de la columna dorsal retira en la porción central de la médula espinal exponer los axones reticulospinales (líneas verdes ). Los cuernos ventrales, que permanecen intactos después del proceso de corte, están marcados por el alfabeto V (color de fuente rojo). (C) tratamiento de 45 minutos con la proteasa y enzimas colagenasa cocktail (1 mg / ml). (D) El corte de vías laterales de la médula espinal; que indica la posición, dirección y extensión de corte lateral. (e) disociación mecánica de la médula espinal. Las flechas indican la posición de fórceps y dirección de la fuerza de separación durante la disociación. (F) Representatihe ejemplo de preparación axón reticuloespinal disociado. Las flechas verdes marcan las regiones de axones reticulospinal agudamente disociado sin ningún proceso de post-sinápticas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. esquemática de cámara para experimentos de electrofisiología grabación. Dimensiones proporcionadas están en pulgadas. Rectángulo rojo muestra en el diagrama basepiece (a) indica el posicionamiento de cubreobjetos en la ranura cubreobjetos en el basepiece. La región entre el rectángulo rojo y azul, que se muestra en el diagrama basepiece (a) es donde se aplica la grasa de alto vacío. (B) muestra la cámara de grabación montado. 4. etiquetado y la identificación de los terminales presinápticos con FM 1-43 <ol><li> Etiquetar las terminales presinápticas, mediante la incorporación de FM 1-43 en vesicles durante sináptica exo-endocitosis durante la escuela K + despolarización. Perfundir preparación con 5 M FM 1-43 (en solución 5 ml de Ringer que contiene 30 mM KCl). </li><li> Perfundir preparación con 1 mg / ml ADVASEP-7 (en solución de Ringer 5 ml) para eliminar el exceso de colorante FM) 18. </li><li> Perfundir preparación con solución de Ringer durante 15 min al lavado por cualquier colorante Remant y la ADVASEP. </li><li> Imagen con 100 X lente de inmersión en aceite (NA 1,25) en un microscopio de fluorescencia invertido, en conjunción con una cámara CCD digital y la adquisición de imágenes micromanager software, utilizando protocolos de formación de imágenes de fluorescencia estándar. </li><li> Identificar los terminales presinápticos marcados con fluorescencia para apuntar para la grabación de la figura 4c y 4d Figura. </li></ol> 5. inmunohistoquímica de aislados axones reticuloespinal <ol><li> Rellene inserción plato (sección Protocolo 2.10.) Con divalente-ion (Ca 2 + y Mg 2 +) libreSolución de Ringer. </li><li> Fabrique pipetas de parche en un extractor micropipeta P-87. Colocar una pequeña cantidad de pegamento de sutura en un extremo de la inserción de poli-lisina utilizando una pipeta de parche (1,5 mm de vidrio de diámetro exterior) y de aspiración (usando un tubo de silicona 0,89 mm de diámetro interior con una punta de micropipeta unido al extremo de succión). </li><li> Realizar disociaciones utilizando el mismo procedimiento que se menciona en la sección de protocolo 3 Figura 2. Coloque un extremo de la médula espinal en la cola de sutura y presione suavemente con unas pinzas para adherirse fuertemente a la superficie. Coloque otra gota de pegamento de sutura en el otro extremo de la inserción y estirar suavemente la médula espinal hasta que se disocian los axones y adherir el extremo libre de la médula espinal arrastrándolo suavemente sobre el pegamento de sutura. Fijar en su lugar por prensado suave hacia abajo con las pinzas. </li><li> Divalente libre intercambio solución de Ringer con solución de Ringer normal por perfusión. </li><li> Permitir que los axones se recuperen para el post dissoc 20 miniation a 10 ° C. </li><li> Fijar los axones disociadas en 4% de paraformaldehído (PFA) {preparado en tampón fosfato salino (PBS, (mM) NaCl 137, KCl 2,7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1,8, pH 7,4)} durante 20 min. Filtra solución de PFA antes de su uso mediante el paso a través de un filtro de jeringa de 0,2 mM. </li><li> Lave la PFA perfundiendo glicina 0,1 M (en PBS) durante 10 min. </li><li> Incubar en 0,1% de Triton-X (en PBS) durante 10 min. </li><li> Lavar por perfusión PBS durante 20 min. </li><li> Se bloquea con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 6 horas a 4 ° C. </li><li> Añadir en el anticuerpo primario a VGCC de interés (dilución 1: 200 en PBS) y se incuba durante 20 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar por perfusión PBS durante 20 min. </li><li> Bloquear con leche desnatada al 5% (en PBS) durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Añadir en anticuerpo secundario (dilución 1: 400 en PBS) y se incuba en la oscuridad durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Lavar por perfusión con PBS durante 20 min. </li><li> Bloque con 1% de suero bovino Albumin (en PBS) durante 20 min. </li><li> Añadir en Alexa Fluor 488 faloidina (5 unidades / l concentración de trabajo; de stock preparada en metanol 200 Unidades / ml). </li><li> Lavar por perfusión con PBS durante 20 min. </li><li> Image usando lente de inmersión 100X agua en el microscopio confocal. </li></ol> 6. electrofisiológico de grabación <ol><li> Fabrique pipetas de parche de vidrio de aluminosilicato (resistencia pipeta 2-5 mW) en un extractor de micropipeta P-87. Diseño parche pipeta de tal manera que la punta de pipeta abarca toda diámetro terminal presináptica. </li><li> PDMS pipetas de parche capa por inmersión de la pipeta de parche bajo presión de 50-60 psi en PDMS 23 (adjuntar un tubo de silicona, 0,89 mm de diámetro interior, conectado a un cilindro de gas nitrógeno, a la parte de atrás de la pipeta de parche) y secar usando un calor arma. Alternativamente, la capa manualmente la pipeta con PDMS, la aplicación de recubrimiento tan cerca de la punta como sea posible, bajo un microscopio compuesto. </li><li> Fuego pipetas parche pulido utilizando un microforge (un filamento de platino a la medida montado sobre la platina de un microscopio compuesto). </li><li> Identificar los axones aislados que demuestran terminales presinápticos marcados por microscopía de fluorescencia. </li><li> Llenar solución de grabación (diseñado para aislar Ca 2 + corrientes; 10 mM CaCl 2 o 90 mM BaCl 2 como portador de carga, tamponada de HEPES pH 7,6, osmolaridad 270 mOsm) en el parche pipeta usando una jeringa. </li><li> Inserte parche pipeta en el soporte de la pipeta y posición por encima del baño usando un manipulador motorizado MP225. Baje suavemente la pipeta parche en el baño y la posición contra la cara de un terminal presináptica fluorescente identificado. </li><li> Avance el parche pipeta lentamente hasta que se haga contacto con la membrana. En este punto, lograr un sellado gigaohmio por succión la boca suave a través de un tubo conectado a la titular de la pipeta. </li><li> Para alcanzar el fondo extremadamente bajos niveles de ruido requeridos para el registro de un solo canal de Ca 2 + corrientes, utilice una Axopatch 200B con un cabezal de la platina se enfrió durante las grabaciones. Datos de la muestra de 20 a 50 kHz y el filtro utilizando un filtro de Bessel 5 kHz. Llevar a cabo la adquisición de datos utilizando un AxoGraph X. </li><li> Utilice un protocolo estándar para escaleras, en incrementos de 10 mV como estímulo. Incorporar un pre-pulso en el protocolo, el protocolo anterior etapa, para asegurar la activación máxima de los canales de Ca 2 +. Incorporar una mV paso 10 fugas en el protocolo de paso para un análisis posterior sustracción de corrientes de fuga. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Nuestro protocolo de disociación es significativa al ceder axones reticulospinal aislados y fuera de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo conservan funcional presináptica terminales Figura 4c y 4d Figura. La ausencia de procesos de post-sinápticas se oponen a la terminal presináptica permite el acceso directo a la grabación de la membrana cara liberación presináptica en las terminales presinápticas individuales, antes no era posible en las...

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido y preciso. Acción potencial invasión de la terminal presináptica conduce a la apertura de VGCCs situados en la membrana cara liberación, el aumento resultante en presináptica Ca 2 + que actúa como el disparador para la fusión de vesículas y liberación de neurotransmisores 1. Todos estos pasos se dan dentro de cientos de microsegundos 2, y por lo tanto requieren de acoplamiento espacial estricto de VGCCs a la maquinaria de la fusión de vesículas 3. Presináptica Ca 2 + flujos se han caracterizado principalmente por medio de imágenes enfoques usando colorantes sensibles al Ca 2 + 4. La incorporación de Ca 2 + tampones que modulan Ca2 + en las neuronas presinápticas se ha utilizado para caracterizar indirectamente la relación entre el calcio y la neurotransmisión presináptica 3. Además, la modulación de la presináptica libre de Ca 2 + de concentración por uncaging Ca 2 + 5 o grabar macroscopic Ca 2 + corrientes se han usado en conjunción con medidas de la fusión de vesículas y / o liberación; tales como medidas de capacitancia 6 o postsináptica respuestas 2 para abordar la misma cuestión. Sin embargo, la caracterización de Ca 2 + corrientes directamente en la cara de la liberación, la sección especializada de la membrana presináptica, donde despolarización de la membrana se traduce en Ca 2 + corrientes desencadenan la fusión de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores, es esencial para obtener una medida precisa de la Ca 2 + requisito para la fusión de la vesícula sináptica. Además, la capacidad para caracterizar directamente Ca 2 + corrientes en los terminales presinápticos individuales, junto con mediciones simultáneas precisas de la fusión de vesículas y liberación permite una elucidación precisa de la relación de temporización entre el transcurso de tiempo del potencial de acción, presináptica Ca 2 + actual, la fusión de vesículas y la liberación. El acceso a la membrana de liberación carano está disponible en la mayoría de los terminales presinápticos debido a la estrecha aposición por las dendritas postsinápticas. Esta inaccesibilidad ha sido un obstáculo importante en la caracterización de VGCCs ya que impide las mediciones directas de la corriente en las terminales presinápticas individuales. Caracterización directa de presináptica Ca 2 + corrientes en las terminales presinápticas individuales hasta el momento no ha sido posible en las sinapsis centrales y sólo se ha logrado en dos terminales presinápticas tipo cálices; tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo de 7-10 y de rata cálices 11,12. En todos los otros terminales presinápticas incluyendo la sinapsis reticulospinal gigante en la lamprea de la médula espinal 13, la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica ha hecho necesario el uso de enfoques indirectos tales como Ca 2 + de imágenes para estudiar presináptica Ca 2 + flujos. <img alt="Figura 1" fo: contenido-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura sinapsis reticulospinal gigante. (A) Sección 1.-Lamprea de lamprea médula espinal que indica la orientación dorso-ventral. Reticuloespinal axones están marcados con el asterisco verde. (B) la reconstrucción 3-D de la sinapsis reticuloespinal en la lamprea de la médula espinal que muestra presináptica del axón reticuloespinal hacer numerosos contactos en passant (marcado por flechas verdes) en la neurona postsináptica 13. Terminales presinápticas han sido etiquetados con Alexa Fluor 488 hidrazida conjugado faloidina (verde), mientras que la neurona postsináptica se ha llenado con Alexa Fluor 568 hidrazida (rojo). Axones gigantes reticulospinales lamprea, ubicadas en la región ventral de la médula espinal en paralelo a la rostral-caudal eje Figura 1a, la forma múltiple en passant contactos sinápticos en neuronas de laasta ventral de la médula 14 Figura 1b 13. De células enteras macroscópica Ca 2 + corrientes han sido registrados en los axones reticulospinales en la médula espinal intacta 13,15. Sin embargo, los intentos anteriores ciegos en la medición directa de Ca 2 + corrientes en los axones reticulospinales en la lamprea intacta la médula espinal usando técnica de patch clamp de células inscritos han tenido éxito 13 debido a la falta de acceso a la membrana cara liberación presináptica debido a los procesos postsinápticos opuestas la Figura 1b. La membrana cara liberación ha sido previamente hecho accesible por la eliminación de la neurona postsináptica 11, perturbación mecánica de la sinapsis antes de grabar 12 o el tratamiento enzimático junto con disociación mecánica 16. Dada la compleja organización de la médula espinal, que resultaría extremadamente difícil identificar la neurona postsináptica y retraer mecánicamente o perturbar ªe sinapsis. Por lo tanto, hemos decidido utilizar el tratamiento enzimático 17 seguido por disociación mecánica. Con este enfoque, hemos desarrollado una preparación agudamente disociado de la lamprea de la médula espinal que produce viables axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de cualquier proceso de post-sinápticos, proporcionando así un acceso sin restricciones a las terminales presinápticas individuales. En conjunto con un microscopio invertido y estándar de imágenes de fluorescencia, que nos permite identificar y seleccionar los terminales presinápticos con fluorescencia identificado individuales, con una pipeta de parche que contiene una solución de grabación que aísla Ca 2 + corrientes 4c figura y la figura 4d, para la grabación con base celular técnica de fijación de voltaje adjunta. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la membrana cara liberación presináptica de los terminales presinápticos individuo Figura 4f. Esta es una SIGNIFICAnt avance en el campo de la transmisión sináptica, ya que es la primera grabación que se llevó a cabo en las sinapsis centrales.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

La transmisión sináptica es un proceso extremadamente rápido. Potencial de acción impulsado afluencia de Ca 2 + en la terminal presináptica, a través de los canales de calcio dependientes de voltaje (VGCCs) localizados en la membrana cara liberación, es el detonante de la fusión de vesículas y la liberación de neurotransmisores. Crucial para la rapidez de la transmisión sináptica es la sincronía espacial y temporal entre la llegada del potencial de acción, VGCCs y la maquinaria liberación de neurotransmisores. La capacidad de grabar directamente Ca 2 + corrientes de la membrana cara liberación de terminales presinápticas individuales es imperativo para una comprensión precisa de la relación entre presináptica Ca 2 + y la liberación de neurotransmisores. El acceso a la membrana cara liberación presináptica de registro electrofisiológico no está disponible en la mayoría de las preparaciones y Ca 2 + entrada presináptica se ha caracterizado mediante técnicas de imagen y MeasureMe corriente macroscópicaNTS - técnicas que no tienen suficiente resolución temporal para visualizar la entrada de Ca 2 +. La caracterización de VGCCs directamente en las terminales presinápticas individuales no ha sido posible en las sinapsis centrales y hasta el momento se ha logrado con éxito sólo en el tipo cáliz sinapsis del ganglio ciliar de pollo y en los cálices de rata. Hemos abordado con éxito este problema en la sinapsis reticulospinal gigante de la lamprea de la médula espinal mediante el desarrollo de una preparación agudamente disociado de la médula espinal que produce axones reticulospinal aislados con terminales presinápticas funcionales carentes de estructuras postsinápticas. Fluorescencia Podemos etiquetar e identificar las terminales presinápticas individuales y dirigirlos para la grabación. El uso de esta preparación, hemos caracterizado VGCCs directamente en la cara liberación de terminales presinápticas individuales utilizando enfoques de inmunohistoquímica y de electrofisiología. Ca 2 + corrientes se han registrado directamente en la cara de la membrana de liberación of terminales presinápticas individuales, la primera de grabación a ser llevadas a cabo en las sinapsis centrales.

<html> Esto produce la disociación de protocolo axones sanos y funcionales aisladas reticulospinal carentes de postsináptica proyecciones Figura 2f, pero que sin embargo retener presináptica terminales funcionales capaces de vesícula sináptica evocada exo-y endocitosis Figura 4c y 4d Figura. Secciones de las regiones aisladas de los axones reticulospinal pueden ser claramente identificados con microscopía de luz para estar libre de cualquier otros procesos neuronal...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals at JoVE.c

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K vistas.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Video: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Patch Clamp grabaciones en Intacto dorsal ganglios de la raíz de ratas adultas

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Investigación

Bioquímica

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Neurociencias

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Biología

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Grabación combinado de salida Mecánicamente estimulada aferente y nervio terminal Etiquetado en ratón del pelo del folículo lanceoladas Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Grabaciones de Macropatch focal de corrientes sinápticas de la Unión Neuromuscular larvaria de Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

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