This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1 Preparazione di Poly-D-lisina Hydrobromide <ol><li> Preparare 1 mg / ml di poli-D-lisina bromidrato in 0,1 M tampone borato (pH 8,5). </li><li> Aliquota e conservare a -20 ° C. </li></ol> Rivestimento 2 Poly-lisina di vetrini Nota: Eseguire tutte le operazioni di pulizia e di rivestimento in una camera di flusso laminare. <ol><li> Luogo coprioggetto in una capsula di Petri contenente 1 N acido cloridrico (HCl) per 2 ore. </li><li> Aspirare tutto HCl e risciacquare con il 70% di etanolo (EtOH) 2-3x. </li><li> Lasciare in 70% EtOH per 1 ora. </li><li> Aspirare tutto il 70% EtOH e risciacquare con il 100% EtOH 2-3x. </li><li> Lasciare in 100% EtOH per 2 ore. Aspirare tutto EtOH. </li><li> Asciugare con carta da filtro e asciugare all&#39;aria per pochi secondi. </li><li> Luogo O / N in 1 mg / soluzione poli-lisina ml. </li><li> Sciacquare coprioggetto giorno dopo con acqua Millipore 4-5x. </li><li> Aria secca poli-lisina rivestite coprioggetto su rulli di vetro in un piatto pulito Petri. </li><li> Per immunohistochemistry, utilizzare 35 x 10 mm Petri coperchi piatto. Preparare sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) fiancheggiata piatti versando PDMS (elastomero e induritore 10: 1 in peso) nella capsula ad uno spessore di 0,3 cm, permettono di fissare a 30 ° CO / N. Una volta che questo è impostato, tagliare 2 cm di 1 cm incastonate nelle PDMS. Pulire e ricoprire il riquadro con poli-lisina seguendo la stessa procedura di cui sopra per coprioggetto. </li><li> Conservare coprioggetti e piatti rivestiti di poli-lisina coperti all&#39;interno della camera a flusso laminare fino al momento dell&#39;uso (fino a 2 settimane, ma ottenere i migliori risultati adesive preparando periodicamente ogni 3-4 giorni). </li><li> Preparare un blocco PDMS, al pin del midollo spinale nel affettatrice tessuto vibrante. Mix Elastomero Elastomero A e B 1: 1 in peso. Versare in una piastra di Petri di 100 x 15 mm e permettono di impostare O / N a 30 ° C. Tagliare un pezzo rettangolare di PMDS e la colla alla piastra di base per affettare con colla epossidica. Lasciare che la colla per impostare fissa i PDMS in atto e affettare più sezioni sottili sulla superficie per ottenere un appartamentosuperficie al pin del tessuto su. </li></ol> 3. acuta dissociazione della Lampreda Spinal Cord cedere isolati reticulospinal assoni <ol><li> Anestetizzare un ammoecoete o adulto lampreda (Petromyzon marinus) con tricaine metansulfonato (MS-222, 100 mg / L). Aggiungere anestetico in acqua, in una tazza di plastica coperto da un coperchio, contenente la lampreda di essere sacrificato. </li><li> Decapitare lampreda a freddo (4 ° C), soluzione di Ringer avente la seguente composizione (in mM): 130 NaCl, 2.1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 destrosio (pH 7.6, osmolarità 270 mOsm) e rimuovere il corpo muscoli della parete per esporre la superficie dorsale del midollo spinale. </li><li> Rimuovere meninge primitiva dalla superficie dorsale del midollo spinale con una pinza sottile. Non rimuovere ventrale meninge primitiva in questa fase. </li><li> Tagliare midollo spinale in 1 cm di lunghezza pezzi. </li><li> Pin un pezzo del midollo spinale utilizzando sottili perni di insetti, lato dorsale rivolta verso l&#39;alto, su un PDMS affettare pla di base foderatote (vedi 2.12) in un tessuto vibrante camera di affettatrice contenente soluzione ghiacciata di Ringer. </li><li> Rimuovere una sezione centrale della colonna dorsale del midollo spinale mediante tranciatura lungo l&#39;asse rostro-caudale con la lama, lasciando intatte le sezioni di colonna dorsale sul rostrale e caudale finisce per servire come maniglie durante il processo di dissociazione Figura 2a e la Figura 2b. Utilizzare l&#39;impostazione più lenta della velocità che permette affettare e un ambiente profondità che rimuove solo la colonna dorsale lasciando sottostante colonna assone reticulospinal Figura 2b non danneggiato. </li><li> Incubare pezzi del midollo spinale a fette a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di 1 mg / proteasi ml (tipo XIV da Streptomyces griseus) e 1 mg / collagenasi ml di preparato (tipo IA da Clostridium histolyticum) in soluzione di Ringer (adattato da El Manira &amp; Bussières 1997 17). </li><li> Pezzi del midollo spinale Pin enzimi trattati con perni sottili in un PDMS allineati Petri dish Contavorazio freddo (4 ° C), soluzione di Ringer. </li><li> Rimuovere ventrale meninge primitiva con una pinza sottile. </li><li> Tagliare tratti laterali del midollo spinale con una lama di bisturi a metà della sezione dorsale fette lasciando la colonna centrale di assoni reticulospinal intatti nel midollo spinale Figura 2d. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente. </li><li> Posizionare il coprioggetto poli-lisina rivestito (figura 3a, pezzo superiore, rettangolo rosso) nella fessura della figura camera di registrazione 3 e applicare grasso per vuoto a tutti i bordi (spazio tra rettangoli rossi e blu in figura 3a, per facilitare un sigillo. Vite la parte superiore in posizione. Inserite la camera nel riquadro sulla piattaforma di registrazione. </li><li> Aggiungere la soluzione di Ringer nella camera di registrazione con una pipetta Pasteur. </li><li> Collegare il tubo di efflusso della bombola a pressione contenente soluzione antigelo per il tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Collegare il output tubo del dispositivo di raffreddamento termoelettrico al fine di ingresso della camicia di raffreddamento esterno e l&#39;estremità di uscita al serbatoio Figura 3b. </li><li> Mettete un pezzo di midollo spinale in un momento in camera di registrazione e separare delicatamente il midollo spinale mantenendo lungo il vetrino in ogni momento utilizzando pinze rivestite in teflon fino assoni sono isolati Figura 2e e 2f Figura. </li><li> Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 ° C facendo passare l&#39;(azoto gassoso viene spinto nella bottiglia) pressurizzato soluzione antigelo (per spostamento), tramite il dispositivo di raffreddamento termoelettrico, attraverso la camicia di raffreddamento esterno della camera di Figura 3b registrazione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 1 ora posto dissociazione a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2 Descrizione schematica del protocollo di dissociazione per l&#39;isolamento degli assoni reticulospinal. (A) la rimozione della colonna dorsale. La freccia indica la direzione di taglio del tessuto. Le corna dorsali sono contrassegnati da l&#39;alfabeto D (font color rosso), mentre le corna ventrali per l&#39;alfabeto V (font color rosso). (B) colonna Dorsale rimosso nella porzione centrale del midollo spinale esponendo gli assoni reticulospinal (linee verdi ). Le corna ventrali, che rimangono intatti dopo il processo di taglio, sono contrassegnati da l&#39;alfabeto V (font color rosso). (C) 45 min trattamento con proteasi e collagenasi enzimi cocktail (1 mg / ml). (D) Taglio delle vie laterali del midollo spinale; che indica la posizione, la direzione e la portata del taglio laterale. (e) dissociazione meccanica del midollo spinale. Le frecce indicano la posizione delle pinze e la direzione della forza di separazione durante la dissociazione. (F) representative esempio di dissociato preparazione assone reticulospinal. Le frecce verdi indicano le regioni di assoni reticulospinal acutamente dissociate, senza alcun processo post-sinaptici. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Schema di registrazione da camera per esperimenti di elettrofisiologia. Dimensioni previste sono in pollici. Rettangolo rosso mostrato nel diagramma basepiece (a) indica il posizionamento del coprioggetto nella scanalatura coprioggetto in basepiece. La regione tra il rettangolo rosso e blu, illustrato nel diagramma basepiece (a) è dove viene applicato il grasso alto vuoto. (B) mostra la camera di registrazione assemblato. 4. etichettatura e identificazione di terminali presinaptici con FM 1-43 <ol><li> Etichetta terminali presinaptici, incorporando FM 1-43 in vesicles durante synaptic eso-endocitosi durante l&#39;alta K + depolarizzazione. Profumato preparato con 5 mM FM 1-43 (in soluzione 5 ml di Ringer contenente KCl 30 mM). </li><li> Profumato preparato con 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml di soluzione di Ringer) per rimuovere l&#39;eccesso di colorante FM) 18. </li><li> Profumato preparazione con la soluzione di Ringer per 15 min a dilavamenti qualsiasi colorante Remant e la Advasep. </li><li> Immagine con 100 X obiettivo a immersione in olio (NA 1,25) su un microscopio a fluorescenza invertito, in combinazione con una fotocamera digitale CCD e acquisizione delle immagini software micromanager, utilizzando protocolli di imaging di fluorescenza standard. </li><li> Identificare i terminali presinaptici fluorescente a bersaglio per la registrazione Figura 4c e 4d Figura. </li></ol> 5. immunoistochimica di isolati reticulospinal assoni <ol><li> Riempire piatto inserto (sezione Protocol 2.10.) Con bivalente-ione (Ca 2 + e Mg 2 +) gratisSoluzione di Ringer. </li><li> Realizzare pipette di patch in una micropipetta estrattore P-87. Mettere una piccola quantità di colla sutura ad una estremità del kit di poli-lisina utilizzando una pipetta di patch (1,5 millimetri di vetro di diametro esterno) e di aspirazione (utilizzando un tubo in silicone 0,89 millimetri di diametro interno con una punta micropipetta fissato all&#39;estremità di aspirazione). </li><li> Effettuare dissociazioni utilizzando la stessa procedura di cui alla sezione Protocollo 3 Figura 2. Posizionare un&#39;estremità del midollo spinale sulla colla sutura e premere delicatamente con una pinza ad aderire con forza alla superficie. Mettere una goccia di colla sutura all&#39;altra estremità del riquadro e allungare delicatamente il midollo spinale fino assoni sono dissociate e aderire l&#39;estremità del midollo spinale libero trascinandola delicatamente sopra la colla sutura. Fissare in posizione da pressatura soffice verso il basso con le pinze. </li><li> Bivalente Libero scambio soluzione di Ringer con la soluzione regolare di Ringer da perfusione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 20 min dopo dissociation a 10 ° C. </li><li> Fissare assoni dissociate in 4% paraformaldeide (PFA) {preparato in tampone fosfato salino (PBS, (mm) 137 NaCl, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7,4)} per 20 min. Filtrare la soluzione PFA prima dell&#39;uso passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. </li><li> Lavare il PFA mediante perfusione 0,1 M glicina (in PBS) per 10 min. </li><li> Incubare in 0,1% Triton-X (in PBS) per 10 min. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 6 ore a 4 ° C. </li><li> Aggiungi in anticorpo primario per VGCC di interesse (1: 200 diluizione in PBS) e incubare per 20 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungi a anticorpo secondario (1: 400 diluizione in PBS) e incubare al buio per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Blocco con 1% di siero bovino Albumin (in PBS) per 20 min. </li><li> Aggiungi a Alexa Fluor 488 falloidina (5 unità / ml concentrazione di lavoro; magazzino preparato in metanolo 200 Unità / ml). </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Immagine con obiettivo a immersione 100X acqua sul microscopio confocale. </li></ol> 6. elettrofisiologiche di registrazione <ol><li> Realizzare pipette di patch di vetro alluminosilicato (resistenza pipetta 2-5 MW) in una micropipetta estrattore P-87. Progettazione di patch pipetta in modo che la punta della pipetta abbraccia tutto il diametro del terminale presinaptico. </li><li> PDMS pipette di patch cappotto immergendo la pipetta di patch sotto pressione 50-60 psi in PDMS 23 (allegare un tubo di silicone, 0,89 millimetri di diametro interno, collegato ad una bombola di gas di azoto, al back-end della pipetta di patch) e asciugare con un calore pistola. In alternativa, cappotto manualmente la pipetta con PDMS, applicando il rivestimento più vicino alla punta più possibile, sotto un microscopio composto. </li><li> Fuoco pipette di patch smalto utilizzando un microforge (un filamento di platino su misura montata sul palco di un microscopio composto). </li><li> Identificare assoni isolate dimostrano terminali presinaptici etichettati da microscopia a fluorescenza. </li><li> Riempire soluzione di registrazione (progettata per isolare Ca 2 + correnti; 10 mM CaCl 2 o 90 mm ​​BaCl 2 come portatori di carica, tamponata con HEPES pH 7,6, osmolarità 270 mOsm) nella pipetta di patch con una siringa. </li><li> Inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta e la posizione sopra il bagno utilizzando un manipolatore MP225 motorizzato. Abbassare delicatamente la pipetta di patch nel bagno e la posizione contro la faccia di un terminale presinaptico fluorescente identificato. </li><li> Anticipo la pipetta di patch lentamente fino di contatto con la membrana. A questo punto, ottenere una tenuta gigaohm da aspirazione delicata bocca attraverso un tubo collegato al titolare pipetta. </li><li> Per ottenere i bassissimi livelli di rumore di fondo necessarie per la registrazione di singolo canale Ca 2 + correnti, utilizzare un Axopatch 200B con un headstage raffreddata per le registrazioni. Dati campione a 20-50 kHz e filtro con un filtro di Bessel 5 kHz. Eseguire l&#39;acquisizione di dati tramite un Axograph X. </li><li> Utilizzare un protocollo standard di passo, in incrementi di 10 mV come stimolo. Incorporare un pre-impulso nel protocollo, che precede il protocollo passo, al fine di garantire l&#39;attivazione massima di canali del Ca 2 +. Incorporare un 10 mV perdita passo verso il protocollo step per la post-analisi sottrazione delle correnti di fuga. </li></ol>

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	<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+calcium+action+during+neuromuscular+transmission.">The timing of calcium action during neuromuscular transmission.</a> Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).</li><li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neurotransmission+at+fast+synapses+in+the+mammalian+brain.">Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain.</a> Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).</li><li>Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium+signal+for+transmitter+secretion+from+presynaptic+nerve+terminals.">The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).</li><li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+transmitter+release.">Calcium and transmitter release.</a> Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).</li><li>Delaney, K. R., Shahrezaei, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncaging+Calcium+in+Neurons.">Uncaging Calcium in Neurons.</a> Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).</li><li>Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+patch+clamp+capacitance+recordings+from+the+calyx.">Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calyx-type+synapse+of+the+chick+ciliary+ganglion+as+a+model+of+fast+cholinergic+transmission.">The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L+type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+calcium+channels+and+acetylcholine+release+at+a+presynaptic+nerve+terminal.">Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal.</a> Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).</li><li>Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-type+Ca(2+)+channels+carry+the+largest+current+implications+for+nanodomains+and+transmitter+release.">N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell+attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Sheng, J., He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+number+critically+influences+synaptic+strength+and+plasticity+at+the+active+zone.">Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone.</a> Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).</li><li>Photowala, H., Freed, R., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+function+of+vesicle+clusters,+active+zones+and+Ca2++channels+in+the+lamprey+presynaptic+terminal.">Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal.</a> The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).</li><li>Rovainen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+interactions+of+reticulospinal+neurons+and+nerve+cells+in+the+spinal+cord+of+the+sea+lamprey.">Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey.</a> Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).</li><li>Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+independent+depression+of+transmitter+release+by+5+HT+at+lamprey+spinal+cord+synapses.">Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses.</a> The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).</li><li>Stanley, E. F., Goping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+current+in+a+vertebrate+cholinergic+presynaptic+nerve+terminal.">Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal.</a> The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).</li><li>El Manira, A., Bussi&#232;res, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+in+lamprey+sensory+and+motor+neurons.">Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).</li><li>Kay, A. R., Alfonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1+43+in+C+elegans+lamprey+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat.</a> 24 (4), 809-817 (1999).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pools+of+actin+at+presynaptic+terminals.">Dual pools of actin at presynaptic terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).</li><li>Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+lamprey+reticulospinal+synapses+in+three+dimensions.">Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions.</a> The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).</li><li>Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recording+in+the+Drosophila+Embryo.">Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+exceptionally+low+noise+single+channel+recordings.">A method for exceptionally low noise single channel recordings.</a> Pfl&#252;gers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Il nostro protocollo dissociazione è significativa cedendo isolati assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia mantengono funzionale presinaptica terminali Figura 4c e 4d Figura. L&#39;assenza di processi di post-sinaptici che si oppongono al terminale presinaptico registrazione consente l&#39;accesso diretto alla membrana di rilascio presinaptico faccia a terminali presinaptici singoli, in precedenza non possibile in sinapsi cent...

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all&#39;apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca 2 + che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio 1. Tutti questi passaggi si verificano all&#39;interno di centinaia di microsecondi 2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole 3. Presinaptici Ca 2 + flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca 2 + coloranti sensibili 4. Integrare Ca 2 + buffer che modulano Ca 2 + nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione 3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca 2 + concentrazione da uncaging Ca 2 + 5 o registrazione macroscopic Ca 2 + correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità di 6 o postsinaptici 2 risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca 2 + correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca 2 + correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca 2 + requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l&#39;andamento temporale del potenziale d&#39;azione, presinaptico Ca 2 + corrente, fusione della vescicola e rilascio. L&#39;accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare 7-10 e ratto calici 11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale 13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l&#39;utilizzo di approcci indiretti come Ca 2 + di imaging per studiare presinaptici Ca 2 + flussi. <img alt="Figura 1" fO: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l&#39;orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall&#39;asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico 13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso). Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale 14 Figura 1b 13. Whole-cell macroscopica Ca 2 + correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto 13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca 2 + correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo 13 a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico 11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare 12 o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica 16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico 17 seguita da dissociazione meccanica. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca 2 + correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca 2 + correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell&#39;individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido. Potenziale d&#39;azione guidato afflusso di Ca 2 + nel terminale presinaptico, attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs) situati nella membrana faccia rilascio, è l&#39;innesco per fusione della vescicola e il rilascio dei neurotrasmettitori. Fondamentale per la rapidità di trasmissione sinaptica è la sincronia spaziale e temporale tra l&#39;arrivo del potenziale d&#39;azione, VGCCs e macchinari rilascio dei neurotrasmettitori. La possibilità di registrare direttamente Ca 2 + correnti dalla membrana di rilascio volto dei singoli terminali presinaptici è indispensabile per una precisa comprensione del rapporto tra presinaptica Ca 2 + e il rilascio dei neurotrasmettitori. L&#39;accesso alla membrana di rilascio presinaptico viso per la registrazione elettrofisiologica non è disponibile nella maggior parte dei preparati e Ca 2 + presinaptico voce è stata caratterizzata mediante tecniche di imaging e macroscopica MeasureMe attualenti - tecniche che non hanno risoluzione temporale sufficiente per visualizzare Ca 2 + voce. La caratterizzazione di VGCCs direttamente presso i terminali presinaptici singoli non è stato possibile in sinapsi centrali ed è stato finora realizzato con successo soltanto nel calice-tipo sinapsi del ganglio ciliare pulcino e in calici di ratto. Abbiamo affrontato con successo questo problema nella sinapsi reticulospinal gigante del lampreda midollo spinale attraverso lo sviluppo di una preparazione acutamente dissociata del midollo spinale che produce isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali prive di strutture di post-sinaptici. Possiamo fluorescente etichettare e identificare i singoli terminali presinaptici e loro destinazione per la registrazione. Utilizzando questa preparazione, abbiamo caratterizzato VGCCs direttamente in faccia rilascio dei singoli terminali presinaptici utilizzando approcci di immunoistochimica e di elettrofisiologia. Ca 2 + correnti sono stati registrati direttamente al rilascio viso membrana of singoli terminali presinaptici, il primo di tali registrazioni da effettuare a livello delle sinapsi centrali.

<html> Questo produce protocollo dissociazione sani e funzionali isolate assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia conservano terminali presinaptici funzionali capaci di vescicole sinaptiche evocate eso-ed endocitosi Figura 4c e 4d Figura. Sezioni delle regioni isolate degli assoni reticulospinal possano essere chiaramente identificati al microscopio ottico per essere chiari di altri processi neuronali che consentono l&#39;accesso...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Video: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Ricerca

Neuroscienze

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Biologia

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Biochimica

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Completa lesioni del midollo spinale e del cervello dissezione Protocollo per Wholemount successiva<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in larvale Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Preparazioni e protocolli per l'intera cella Patch Clamp registrazione dei neuroni Tectal Xenopus laevis

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Electrophysiological Investigations of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapse Function

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ganglion cells and project it to the visual cortex. In addition, relay neurons receive top-down excitation from the cortex. The two main excitatory inputs to the relay neurons differ in several aspects. Each relay neuron receives input from only a few retinogeniculate synapses, which are large terminals with many release sites. This is reflected by the comparably strong excitation, the relay neurons receive, from retinal ganglion cells. Corticogeniculate synapses, in contrast, are simpler with few release sites and weaker synaptic strength. The two synapses also differ in their synaptic short-term plasticity. Retinogeniculate synapses have a high release probability and consequently display a short-term depression. In contrast, corticogeniculate synapses have a low release probability. Corticogeniculate fibers traverse the reticular thalamic nuclei before entering the lateral geniculate nucleus. The different locations of the reticular thalamic nucleus (rostrally from the lateral geniculate nucleus) and optic tract (ventro-laterally from the lateral geniculate nucleus) allow stimulating corticogeniculate or retinogeniculate synapses separately with extracellular stimulation electrodes. This makes the lateral geniculate nucleus an ideal brain area where two excitatory synapses with very different properties impinging onto the same cell type, can be studied simultaneously. Here, we describe a method to investigate the recording from relay neurons and to perform detailed analysis of the retinogeniculate and corticogeniculate synapse function in acute brain slices. The article contains a step-by-step protocol for the generation of acute brain slices of the lateral geniculate nucleus and steps for recording activity from relay neurons by stimulating the optic tract and corticogeniculate fibers separately.

Here, we present protocols for the preparation of acute brain slices containing the lateral geniculate nucleus and the electrophysiological investigation of retinogeniculate and corticogeniculate synapses function. This protocol provides an efficient way to study synapses with the high-release and low-release probability in the same acute brain slices.

Indagini elettrofisiologiche sulla funzione di sinapla Retinogeniculate e Corticogeniculate

The lateral geniculate nucleus is the first relay station for the visual information. Relay neurons of this thalamic nucleus integrate input from retinal ...

Activity of Posterior Lateral Line Afferent Neurons during Swimming in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates reafferent cues that animals must disentangle from relevant sensory cues of the surrounding environment. For example, when a fish swims, flow generated from body undulations is detected by the mechanoreceptive neuromasts, comprising hair cells, that compose the lateral line system. The hair cells then transmit fluid motion information from the sensor to the brain via the sensory afferent neurons. Concurrently, corollary discharge of the motor command is relayed to hair cells to prevent sensory overload. Accounting for the inhibitory effect of predictive motor signals during locomotion is, therefore, critical when evaluating the sensitivity of the lateral line system. We have developed an in vivo electrophysiological approach to simultaneously monitor posterior lateral line afferent neuron and ventral motor root activity in zebrafish larvae (4-7 days post fertilization) that can last for several hours. Extracellular recordings of afferent neurons are achieved using the loose patch clamp technique, which can detect activity from single or multiple neurons. Ventral root recordings are performed through the skin with glass electrodes to detect motor neuron activity. Our experimental protocol provides the potential to monitor endogenous or evoked changes in sensory input across motor behaviors in an intact, behaving vertebrate.

We describe a protocol to monitor changes in the afferent neuron activity during motor commands in a model vertebrate hair cell system.

Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

Sensory systems gather cues essential for directing behavior, but animals must decipher what information is biologically relevant. Locomotion generates ...

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

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