This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

Poli-D-lisin hidrobromit hazırlanması 1. <ol><li> 0.1 M borat tamponda (pH 8.5) içerisinde 1 mg / mL poli-D-lisin hidrobromit hazırlayın. </li><li> -20 ° C&#39;de kısım ve mağaza. </li></ol> Lameller 2. Poli-lizin Kaplama Not: Bir laminer akış odasında tüm temizlik ve kaplama işlemleri yapınız. <ol><li> 2 saat süre ile, 1 N hidroklorik asit (HCl) içeren bir Petri tabağına yerleştirin lamelleri. </li><li> Aspire tüm HCI ve% 70 Etanol (EtOH) 2-3x ile durulayın. </li><li> 1 saat süre ile% 70 EtOH içinde bırakın. </li><li> Aspire 70% EtOH ve% 100 EtOH 2-3x ile durulayın. </li><li> 2 saat boyunca% 100 EtOH içinde bırakın. Tüm EtOH aspire. </li><li> Bir kaç saniye için filtre kağıdı ve kuru hava ile kurutun. </li><li> Yer göre O / N 1 mg / ml poli-lizin çözeltisi. </li><li> Durulayın Millipore su 4-5x ile ertesi gün lamelleri. </li><li> Hava kuru poli-lisin temiz bir Petri kabı cam silindirler üzerinde lamelleri kaplı. </li><li> Immunohistochemistr içiny, 35 x 10 mm Petri kabı, kapaklar kullanılması. 0.3 cm&#39;lik bir kalınlığa kabına ve 30 ° CO / G ayarlamak için olanak sağlar: Sylgard hazırlanması (polydimethylsilioxane PDMS) PDMS (1 ağırlık elastomer ve sertleştirme maddesi 10) dökülerek yemekler dizildi. Bu kurduğunda, PDMS içine doğru daralmış 1 cm 2 cm kesti. Lamelleri için yukarıda belirtildiği gibi aynı adımları takip poli-lisin ile temiz ve ceket daraltma. </li><li> Mağaza poli-lizin kaplı lamelleri ve yemekleri kullanıma kadar (2 haftaya kadar, ama her 3-4 gün periyodik olarak hazırlayarak iyi yapıştırıcı sonuçları elde) laminer akış odasının içine kapalı. </li><li> Titreşimli doku dilimleme makinesi omuriliği pin, bir PDMS blok hazırlayın. Elastomer A, karıştırın ve Elastomer B, 1: 1 kadardır. 100 x 15 mm Petri kabı içine dökün ve 30 ° C sıcaklıkta O / N ayarlama imkanı verir. Pmds dikdörtgen bir parça kesin ve epoksi yapıştırıcı kullanarak dilimleme taban plakasına tutkal. Tutkal yerde PDMS sabitleme ayarlamak için izin ve düz elde etmek için yüzeyden birden çok ince kesitler dilimYüzey üzerinde doku yıkmaya. </li></ol> Lamprey Omurilik 3. Akut Ayrılma İzole Reticulospinal Aksonlar Verim için <ol><li> (100 mg / L, MS-222) tricaine metansülfonat ile ammoecoete veya yetişkin lamprey (Petromyzon mannus) anestezisi. Lamprey ihtiva eden, bir kapakla kapatılmış bir plastik kap içerisine suya ekleyin anestetik kurban edilmesi. </li><li> 130 NaCl, CaCI2, 1.8 MgCl2, 4 HEPES, 4 dekstroz (pH 7.6, osmolarite 270 mOsm) 2.1 KCI, 2.6 ve kaldırma gövde: soğuk (4 ° C) (mM cinsinden) aşağıdaki bileşime sahip bir Ringer çözeltisi içinde lamprey başını kesmek duvar kasları omurilik dorsal yüzeyini ortaya çıkarmak. </li><li> Ince pensler kullanılarak bir omurilik dorsal yüzeyinden meninksler Primitiva çıkarın. Bu aşamada, ventral meninksler Primitiva çıkarmayın. </li><li> 1 cm uzunluğunda parçalar halinde omurilik kesti. </li><li> PDMS taban pla dilimleme kaplı üzerine, dorsal yüzü yukarı bakacak, ince böcek pimleri kullanarak bir omurilik parça Pinbuz soğukluğunda Ringer çözeltisi ihtiva eden titreşimli bir doku bölmesi dilimleyici te (2,12 bakınız). </li><li> Rostral ve kuyruğu ile, bozulmamış arka sütun parçasının arkasındaki ayrılma süreci Şekil 2a ve Şekil 2b sırasında kolları olarak hizmet etmek üzere sona bırakarak bıçak rostro-kaudal ekseni boyunca kesit alınarak omurilik dorsal kolonun bir merkezi bölümü çıkarın. Dilimleme ve altta yatan reticulospinal akson kolon hasarsız Şekil 2b bırakarak sadece dorsal sütun kaldıran bir derinlik ayarını izin düşük hız ayarını kullanın. </li><li> 1 mg / mL proteaz (Sterptomyces griseus dan Tip XIV) ve Ringer çözeltisi içinde (Clostridium histolyticum&#39;dan Tip IA) hazırlanan bir 1 mg / ml kollajenaz bir karışım içinde 45 dakika boyunca oda sıcaklığında dilimlenmiş omurilik parçaları inkübe (EI Manira ve Bussieres&#39;e uyarlanmıştır , 1997 17). </li><li> Bir PDMS ince iğneler kullanılarak Pin enzim-tedavi omurilik adet Petri conta kaplıadencilik soğuk (4 ° C) Ringer çözeltisi. </li><li> Ince forseps ile ventral meninksler Primitiva çıkarın. </li><li> Omurilik Şekil 2d&#39;de olduğu gibi reticulospinal akson merkez sütunu terk eden dilimlenmiş sırt bölümünün orta noktasında bir neşter ile omurilik yan yolları kesin. </li><li> Lens üzerinde daldırma bir damla yağ koyun. </li><li> Kayıt odasının Şekil 3 yuvasına poli-lizin kaplı lamel (Şekil 3a, üst parça, kırmızı dikdörtgen) yerleştirin ve bir mühür kolaylaştırmak için, Şekil 3a kırmızı ve mavi dikdörtgen arasındaki (tüm kenarlara boşluk vakum gres sürün. Vida yerine üst. kayıt teçhizat içerlek odasına yerleştirin. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak kayıt odasına Ringer çözeltisi ekleyin. </li><li> Termoelektrik soğutma cihaz giriş hortumuna antifriz solüsyonu içeren basınç şişenin çıkış hortumunu bağlayın. OUTP bağlayınDış soğutma gömleği giriş ucuna ve hazne Şekil 3b&#39;ye çıkış ucunda etmek üzere, termoelektrik bir soğutma cihazının ut boru. </li><li> Kayıt bölümü içinde bir seferde omuriliğin bir parça yerleştirilir ve hafifçe aksonlar izole Şekil 2e ve 2f Şekil kadar Teflon kaplı forseps kullanılarak her zaman lamel boyunca onu korumak omurilik ayırın. </li><li> Kayıt bölmesi Şekil 3b&#39;de dış soğutma gömleği sayesinde, termoelektrik soğutma cihazı vasıtasıyla, (yer değiştirme ile) antifriz solüsyonu basınçlı (şişe içine itilir azot gazı) geçirilerek 10 ° C&#39;ye kadar kayıt Çözelti oda sıcaklığına getirin. </li><li> Aksonlar, 10 ° C&#39;de 1 saat sonrası ayrılma kurtarmak için izin verin. </li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Reticulospinal akson izolasyonu için ayrışma protokol Şekil 2. şematik açıklaması. (A) dorsal kolon çıkarılması. Ok, doku dilimleme yönünü gösterir. Alfabe V (kırmızı yazı tipi renk) ventral boynuzu., (B), sırt kolon reticulospinal aksonlar maruz omurilik merkezi kısmı uzaklaştırılmıştır Dorsal boynuz (alfabe D (yazı tipi kırmızı renk) yeşil çizgileri işaretlenir ). Dilimleme işleminden sonra bozulmadan kalır ventral boynuz, alfabe V (kırmızı font color) ile işaretlenmiştir. (C) proteaz ve kollajenaz ile 45 dakikalık tedavi kokteyl (1 mg / ml) enzimleri. Yanal yolları (d) Kesme omurilik; konumunu, yönünü ve lateral kesim kapsamını gösteren. (e) spinal kord mekanik ayrışma. Oklar forseps ve ayrışma sırasında ayırma kuvvetinin yönü pozisyonunu göstermektedir. (F) representatiayrışmış reticulospinal akson hazırlama örneği ettik. Yeşil oklar hiçbir süreçler postsinaptik olmadan akut ayrışmış reticulospinal akson bölgelerini işaretlemek. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Sağlanan elektrofizyoloji deneyler için odasını kayıt Şekil 3. şematik. Boyutları inç vardır. Basepiece Şeması (A) &#39;da gösterilen kırmızı dikdörtgen basepiece içindeki lamel oluğa lamel konumlandırılmasını gösterir. Yüksek vakum yağ uygulanır, burada (a) basepiece şemada gösterilen kırmızı ve mavi dikdörtgen arasındaki bölgesidir. (B) toplanmış kayıt odasını göstermektedir. FM 1-43 4. Etiketleme ve Presinaptik Terminalleri tanımlanması <ol><li> V içine FM 1-43 dahil ederek, presinaptik terminalleri Etiketyüksek K +, depolarizasyon sırasında sinaptik ekso-endositoz sırasında esicles. (30 mM KCI içeren 5 ml Ringer çözeltisi içinde) 5 uM FM 1-43 ile hazırlanmasını serpmek. </li><li> 1 mg hazırlanmasını serpmek / ml Advasep-7 (5 mi Ringer çözeltisi içinde), fazla FM boya) 18 kaldırın. </li><li> 15 dakika bir REMANT boya ve Advasep boşaltılmasında için Ringer solüsyonu ile hazırlanmasını serpmek. </li><li> Standart protokoller kullanılarak fluoresans görüntüsü dijital CCD kamera ve görüntü toplama yazılımı micro-yapı ile birlikte bir ters flüoresan mikroskop 100 x yağ batırma objektifi (NA 1.25), Image. </li><li> Şekil 4c ve Şekil 4d kayıt için hedef floresan etiketli presinaptik terminalleri tanımlayın. </li></ol> İzole Reticulospinal Aksonlar 5. İmmünhistokimya <ol><li> Iki değerlikli iyon (Ca 2 + ve Mg 2 +), ücretsiz çanak iç satırının (Protokol bölüm 2.10.) DoldurunRinger çözeltisi. </li><li> P-87 mikropipet çektirmenin yama pipetler Üretiyor. (Bir silikon boruya 0.89 mm emme ucuna bağlanmış bir mikro pipet ile iç çap kullanarak) bir yama pipet (1.5 mm dış çaplı cam) ve vakum kullanılarak poli-lisin içerlek bir ucunda dikiş yapıştırıcı küçük bir miktar. </li><li> Protokol Bölüm 3, Şekil 2&#39;de belirtildiği gibi. Aynı prosedür kullanılarak dağılımlarını yürütmek yüzeyine güçlü bir şekilde yapışması forseps ile yavaşça dikiş yapışkan ve basın omuriliğin bir ucunu. Içerlek diğer ucundaki dikiş tutkal bir damla koyun ve yavaşça aksonlar ayrışmış kadar omurilik germek ve dikiş tutkal üzerinde hafifçe sürükleyerek serbest omurilik ucunu yapışır. Nazik forseps ile bastırarak yerine sabitleyin. </li><li> Değişim iki değerlikli perfüzyon düzenli Ringer solüsyonu ile Ringer solüsyonu boşaltın. </li><li> Aksonlar 20 dakika sonrası dissoc kurtarmak için izin verin10 ° C&#39;de iation. </li><li> 20 dakika boyunca {fosfat tamponlu salin (PBS, (mM olarak) NaCl 137, KCl 2.7 Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7.4) içinde hazırlanan}% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde çözülmüş aksonlar düzeltildi. 0.2 uM bir şırınga filtreden geçirilerek kullanımdan önce PFA çözüm filtre. </li><li> 10 dakika boyunca (PBS içinde), 0.1 M glisin perfüze PFA yıkayın. </li><li> 10 dakika boyunca% 0.1 (PBS) Triton X inkübe edin. </li><li> 20 dakika boyunca PBS ile perfüze edilmesi aşamalarını kapsamaktadır yıkayın. </li><li> 4 ° C &#39;de 6 saat boyunca (PBS içinde),% 5 yağsız süt ile bloke edin. </li><li> Ilgi VGCC primer antikor ekleyin (PBS içerisinde 1: 200 seyreltme) ve 4 ° C&#39;de 20 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> 20 dakika boyunca PBS ile perfüze edilmesi aşamalarını kapsamaktadır yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca (PBS içinde),% 5 yağsız süt ile bloke edin. </li><li> Sekonder antikor ekleyin (PBS içerisinde 1: 400 seyreltme) ile, 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir. </li><li> 20 dakika boyunca PBS ile perfüze ile yıkayın. </li><li> % 1 sığır serum ile bloke Albu&#39;ya20 dakika boyunca (PBS içinde) Min. </li><li> Alexa Fluor 488 falloidinle ekleyin (bir çalışma yoğunluğuna ul / 5 adet, metanol 200 birim / ml elde stoku). </li><li> 20 dakika boyunca PBS ile perfüze ile yıkayın. </li><li> Konfokal mikroskop 100X su daldırma lens kullanarak görüntü. </li></ol> 6. Elektrofizyolojik Kayıt <ol><li> P-87 mikropipet çektirmenin alüminosilikatlı cam yama pipetler (pipet direnci 2-5 M?) Üretiyor. Pipet tüm presinaptik terminali çapını kapsar şekilde tasarım yama pipet. </li><li> PDMS 23 içine 50-60 psi basınç altına yama pipet batırarak kaplama PDMS yama pipetler (yama pipet arka ucuna bir azot gazı silindirine bağlanmış bulunan bir silikon boru, 0.89 mm iç çap, ekleyiniz) ve bir ısı ile kurutun silah. Alternatif olarak, bir bileşik mikroskop altında mümkün ucu kadar yakın kaplama uygulanarak PDMS ile elle ceket pipet. </li><li> Bir MICR kullanarak yangın lehçe yama pipetleroforge (bileşik mikroskop sahneye takılan özel bir inşa platin filaman). </li><li> Floresan mikroskobu ile etiketlenmiş presinaptik terminalleri gösteren izole aksonlar tanımlayın. </li><li> Dolgu kayıt çözümü, bir şırınga kullanılarak Patch-pipetinin içine (Ca 2 + akımları izole etmek için tasarlandı yük taşıyıcı madde olarak, 10 mM CaCl2, 90 mM ya da BaCl 2, HEPES pH 7.6, 270 mOsm ozmolarite tamponlu). </li><li> Motorlu bir manipülatör MP225 kullanarak yukarıda banyo pipet tutucu yerleştirin ve yama pipet takın. Yavaşça bir flüoresan tespit presinaptik yüzüne karşı banyosuna yerleştirin ve yama pipet indirin. </li><li> Iletişim membran ile yapılır kadar yavaşça yama pipet Advance. Bu noktada, pipet tutucuya tutturulmuş bir boru yoluyla yumuşak ağız emme ile gigaohm sızdırmazlık sağlarlar. </li><li> Bir A kullanmak, tek kanallı Ca 2 + akımları kayıt için gerekli son derece düşük arka plan gürültü düzeyleri elde etmek içinkayıtlar için bir soğutulmuş headstage ile xopatch 200B. 5 kHz Bessel filtresi kullanılarak 20-50 kHz ve filtresinde örnek verileri. Bir Axograph X kullanarak veri toplama yürütmek </li><li> Uyarıcı olarak 10 mV artışlarla standart bir aşamalı bir protokol kullanın. Ca 2 + kanallarının maksimal aktivasyonunu sağlamak için, önceki aşamalı bir protokol, protokol ön darbe birleştirir. Kaçak akımlar sonrası analizi çıkarma için adım protokolü içine 10 mV sızıntı adımı birleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+timing+of+calcium+action+during+neuromuscular+transmission.">The timing of calcium action during neuromuscular transmission.</a> Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).</li><li>Sabatini, B. L., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+of+neurotransmission+at+fast+synapses+in+the+mammalian+brain.">Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain.</a> Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).</li><li>Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calcium+signal+for+transmitter+secretion+from+presynaptic+nerve+terminals.">The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).</li><li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+transmitter+release.">Calcium and transmitter release.</a> Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).</li><li>Delaney, K. R., Shahrezaei, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncaging+Calcium+in+Neurons.">Uncaging Calcium in Neurons.</a> Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).</li><li>Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+patch+clamp+capacitance+recordings+from+the+calyx.">Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+calyx-type+synapse+of+the+chick+ciliary+ganglion+as+a+model+of+fast+cholinergic+transmission.">The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).</li><li>Church, P. J., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+L+type+calcium+channel+conductance+with+physiological+levels+of+calcium+in+chick+ciliary+ganglion+neurons.">Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons.</a> The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).</li><li>Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+calcium+channels+and+acetylcholine+release+at+a+presynaptic+nerve+terminal.">Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal.</a> Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).</li><li>Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-type+Ca(2+)+channels+carry+the+largest+current+implications+for+nanodomains+and+transmitter+release.">N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).</li><li>He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+fusion+pore+opening+revealed+by+cell+attached+recordings+at+a+synapse.">Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse.</a> Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).</li><li>Sheng, J., He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+number+critically+influences+synaptic+strength+and+plasticity+at+the+active+zone.">Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone.</a> Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).</li><li>Photowala, H., Freed, R., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+and+function+of+vesicle+clusters,+active+zones+and+Ca2++channels+in+the+lamprey+presynaptic+terminal.">Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal.</a> The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).</li><li>Rovainen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+interactions+of+reticulospinal+neurons+and+nerve+cells+in+the+spinal+cord+of+the+sea+lamprey.">Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey.</a> Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).</li><li>Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+influx+independent+depression+of+transmitter+release+by+5+HT+at+lamprey+spinal+cord+synapses.">Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses.</a> The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).</li><li>Stanley, E. F., Goping, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+calcium+current+in+a+vertebrate+cholinergic+presynaptic+nerve+terminal.">Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal.</a> The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).</li><li>El Manira, A., Bussi&#232;res, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+subtypes+in+lamprey+sensory+and+motor+neurons.">Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).</li><li>Kay, A. R., Alfonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+synaptic+activity+in+intact+brain+and+slices+with+FM1+43+in+C+elegans+lamprey+and+rat.">Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat.</a> 24 (4), 809-817 (1999).</li><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255 (5041), 200-203 (1992).</li><li>Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+pools+of+actin+at+presynaptic+terminals.">Dual pools of actin at presynaptic terminals.</a> Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).</li><li>Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+organization+of+lamprey+reticulospinal+synapses+in+three+dimensions.">Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions.</a> The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).</li><li>Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Recording+in+the+Drosophila+Embryo.">Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li><li>Rae, J. L., Levis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+exceptionally+low+noise+single+channel+recordings.">A method for exceptionally low noise single channel recordings.</a> Pfl&#252;gers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).</li></ol>

The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Bizim ayrışma protokol postsinaptik projeksiyonlar Şekil2fde yoksun izole reticulospinal aksonlarını veren tarafından önemli, ama yine de fonksiyonel presinaptik terminalleri Şekil 4c ve Şekil 4d muhafaza edilmektedir. Presinaptik terminale karşı süreçler postsinaptik yokluğu daha önce, merkezi sinapsların mümkün ve başarılı bir şekilde sadece iki kalisyel-tipi presinaptik terminallerde elde değil tek presinaptik terminallerde presinaptik bırakma...

Sinaptik iletim son derece hızlı ve hassas bir işlemdir. Presinaptik terminalin etki potansiyeli istilası salma Yan membran, presinaptik Ca 2 + artışım vezikül füzyon ve nöro-ileticinin salıverilmesine 1 için tetikleyici olarak görev bulunan VGCCs açılmasına yol açar. Bu adımların hepsi mikrosaniye 2 yüzlerce içinde meydana gelmektedir ve dolayısıyla vesikül füzyon makine 3 VGCCs sıkı uzamsal bağlanmasını gerektirir. Presinaptik Ca 2 + akıları başlıca Ca 2 + duyarlı boyalar kullanarak 4 yaklaşımlar görüntüleme ile karakterize edilmiştir. Presinaptik nöronların Ca 2 + modüle eden bir araya getiren Ca +2 tamponları dolaylı olarak presinaptik sinir iletiminin kalsiyum ve 3 arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, Ca 2 + 5 uncaging veya macroscopi kaydederek presinaptik serbest Ca 2 + konsantrasyonunu modüleCa c 2 + akımları vezikül füzyon ve / veya salınımının önlemler ile birlikte kullanılmıştır; Bu kapasite ölçümleri gibi 6 veya postsinaptik tepkiler aynı soruyu ele 2. Sinaptik vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımını tetikleyerek 2+ akımlar Ancak, serbest yüzüne 2+ akımları doğrudan Ca karakterize, membran depolarizasyon Ca çevrilir presinaptik membranın özel bölümünde, Ca kesin bir ölçü elde ayrılmaz olduğunu 2+ sinaptik vezikül füzyon gereksinimi. Buna ek olarak, bununla doğrudan aksiyon potansiyelinin zamanla arasındaki zamanlama ilişkisinin tam aydınlatılması vezikül füzyon ve serbest doğru eş zamanlı ölçümleri ile karşılaştırın bağlanmış, tek tek presinaptik terminallerinde Ca 2 + akımları karakterize etmek için, presinaptik Ca2 + akımı, vezikül füzyon ve bırakın. Salma Yan membran erişimpostsinaptik dendritler tarafından appozisyon kapatmak nedeniyle presinaptik terminalleri çoğunda mevcut değildir. Bireysel presinaptik terminallerde akımının doğrudan ölçümler önlediğinden Bu erişilememesi VGCCs karakterizasyonu önemli bir engel olmuştur. Bireysel presinaptik terminallerde presinaptik Ca 2 + akımları doğrudan karakterizasyonu bugüne kadar merkezi sinapsların mümkün olmamıştır ve sadece iki kalisyel tipi presinaptik terminallerde elde edilmiştir; civciv siliyer ganglion 7-10 ve sıçan kalikslerin 11,12 çanak tipi sinaps. Taşemen omurilik 13 dev reticulospinal sinaps da dahil olmak üzere diğer tüm presinaptik terminallerde, presinaptik salınmasını yüz zara erişim eksikliği gibi Ca2 + akıları presinaptik incelemek için Ca 2 + görüntüleme gibi doğrudan olmayan yaklaşımlar kullanılmasını gerektirmiştir. <img alt="Şekil 1" fo: İçerik-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Dorsolomber ventral bir yönlenmesine işaret eder taşemen omurilik Şekil 1. taşemen dev reticulospinal sinaps.: (A) kesiti. Reticulospinal aksonlar yeşil Asteriks ile işaretlenir. Postsinaptik nöronun 13 üzerine (yeşil oklarla işaretli) presinaptik reticulospinal akson passant kişileri en çok yapmak gösteren taşemen omurilikte reticulospinal sinaps (b) 3-D rekonstrüksiyonu. Postsinaptik nöron Alexa Fluor 568 hidrazitle (kırmızı) ile dolu olan ise presinaptik terminalleri, Alexa Fluor 488 hydrazide birleşmiş falloidin (yeşil) ile işaretlenmiş edilmiştir. Nöron üzerine passant sinaptik bağlantıları tr omurilik Rostral-kaudal eksen Şekil 1a kordon paralel form birden ventral bölgesinde bulunan Lamprey dev reticulospinal akson,Spinal ventral boynuz 14 Şekil 1b 13. Makroskopik tam hücreli Ca 2 + akımları sağlıklı omurilik 13,15 olarak reticulospinal aksonlarından kaydedildi. Ancak, Ca doğrudan ölçümde önceki kör girişimleri hücre bağlı yama kelepçe tekniği kullanılarak sağlam taşemen omurilikte reticulospinal akson 2+ akımlar nedeniyle karşıt süreçler postsinaptik nedeniyle presinaptik bırakma yüz membran ulaşamama 13 başarısız kanıtlanmış Şekil 1b. Zar daha önce serbest yüz, sinaps mekanik pertürbasyon önceden 12 kayıt veya mekanik ayrılma 16, ikiye katlanmış bir enzim tedaviye sinaptik sonrası nöronu 11 çıkarılmasıyla ulaşılabilir hale getirilmiştir. Omurilik karmaşık organizasyonu göz önüne alındığında, postsinaptik nöron tespit ve mekanik bunu geri veya th perturb son derece zor olduğunu kanıtlayacake sinaps. Dolayısıyla, biz mekanik ayrılma ardından enzimatik tedavi 17 kullanmaya karar verdi. Bu yaklaşımı kullanarak, böylelikle bireysel presinaptik terminallere sınırsız erişim sağlayan, herhangi bir postsinaptik süreçlerin yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile canlı izole reticulospinal aksonlarını verir taşemen omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirdik. Standart bir ters mikroskop ve flüoresan görüntüleme ile bağlantılı olarak, hücre-ile bir kayıt için, Ca 2 + akımları Şekil 4C ve Şekil 4d izole bir kayıt çözeltisi içeren bir yama pipet ile tanımlama, ve bireysel floresan tanımlanan presinaptik terminalleri hedef sağlıyor ekli gerilim kelepçe tekniği. Ca 2 + akımları tek tek presinaptik terminalleri Şekil 4f presinaptik bırakma yüz membran doğrudan kaydedildi. Bu, bir significaBu merkezi sinapslara gerçekleştirilebilir ilk bu tür kayıt olduğu nt sinaptik iletim alanında atılım.

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m Syringe filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Coverslips</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antifreeze</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bright field light source</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Dissection fine forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors ultra fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>High vacuum grease</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Industrial grade nitrogen gas tank</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Insect pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Liquid suture glue</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Non-fat dry milk</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Micropipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion pump</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW &gt; 300,000</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies R-type calcium channel</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Protease Type XIV from Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Schot Duran Pressure Bottle</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing for glue application</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Slicing base plate</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Slicing chamber</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td></td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 160</td><td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184&amp;nbsp;</td><td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td></tr><tr><td>Teflon coated forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulphonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome blades</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>BLADES</td><td></td></tr><tr><td>Xenon lamp</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

Sinaptik iletim son derece hızlı bir süreçtir. Aksiyon potansiyeli bırakma yüz zarında bulunan voltaj-kapılı kalsiyum kanalları (VGCCs) aracılığıyla, presinaptik terminale Ca 2 akını tahrik, vezikül füzyon ve nörotransmitter salınımı için tetikleyici olduğunu. Sinaptik iletim süratine önemli aksiyon potansiyeli, VGCCs gelişi ve nörotransmitter bırakma makineler arasındaki mekansal ve zamansal senkron olduğunu. Doğrudan ca bireysel presinaptik terminallerin serbest yüz zardan 2+ akımları kaydetmek için yeteneği presinaptik Ca 2 + ve nörotransmitter salınımı arasındaki ilişkinin kesin bir anlayış için şarttır. Elektrofizyolojik kayıt için presinaptik bırakma yüz zarına erişim çoğu hazırlıkları ve presinaptik Ca mevcut değildir 2+ giriş görüntüleme teknikleri ve makroskopik akım MeasureMe kullanılarak karakterize edilmiştirNTS - Ca 2 + girişi görselleştirmek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip değilsiniz teknikleri. Doğrudan tek presinaptik terminallerinde VGCCs vasıflandırılması merkezi sinapslara mümkün olmamıştır ve bu güne kadar başarılı bir şekilde sadece civciv kılcal gangliyon çanak tipi sinaps ve sıçan kaliksler elde edilmiştir. Biz başarıyla postsinaptik yapıların yoksun fonksiyonel presinaptik terminalleri ile izole reticulospinal aksonlarını verir omuriliğin bir akut ayrışmış hazırlık geliştirerek taşemen omurilik dev reticulospinal sinaps bu sorunu ele alınmıştır. Biz floresan etiket ve bireysel presinaptik terminalleri belirlemek ve kayıt için onları hedef olabilir. Bu hazırlık kullanarak, immünohistokimya ve elektrofizyoloji yaklaşımlar kullanılarak tek tek presinaptik terminallerin serbest yüzünde doğrudan VGCCs tanımlanmıştır. Ca 2 + akımları bırakma yüz zar o doğrudan kaydedilmiştirm bağımsız presinaptik terminalleri, birinci tür kayıt merkezi sinapslarda gerçekleştirilecektir.

<html> Bu ayrılma protokol verim sağlıklı ve fonksiyonel izole reticulospinal postsinaptik çıkıntılar Şekil2fde yoksun aksonları, ama yine de uyarılmış sinaptik vezikül ekzo-ve endositoz Şekil 4c ve 4d Şekil girebilen işlevsel presinaptik terminalleri muhafaza eder. Reticulospinal akson izole edilmiş bölgeleri bölümleri açık reticulospinal akson membran Şekil2fde serbest erişim sağlayan diğer herhangi bir nöronal işlemin aç?...

Watch this Scientific Journal Video about Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals at JoVE.c

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Görüntüleme.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Video: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Biyokimya

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Kerevit Bacak ekstansör kas Yüksek ve Düşük Çıkış NMJs Fizyolojik Kayıtlar

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Nörobilim

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Motor-nöron Paired Patch Kelepçe Kayıtlar ve Zebra balığı Hedef İskelet Kası

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Biyoloji

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The technique is very cost-effective and easily undertaken with materials commonly found in most electrophysiology laboratories, or easily purchased. The dissection is simple and fast, with the mechanical displacement provided by a generic electroceramic wafer controlled by proprietary software. The same software also records and analyses the electroneurogram output. The recording of the evoked nerve activity is through a commercial differential amplifier connected to fire-polished standard glass microelectrodes. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the stimulation and the recording conditions to optimize recording quality. The system is suitable for assaying the electrophysiological and optical properties of lanceolate terminals of palisade endings of hair follicles, as well as the outcomes from their pharmacological and/or genetic manipulation. An example of combining electrical recording with mechanical stimulation and labeling with a styryl pyridinium vital dye is given.

A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) in response to an action potential (AP). Since SVs are recycled locally at the presynaptic terminal, coordination of SV exocytosis and endocytosis is important for sustained synaptic transmission. A pH-sensitive green fluorescent protein, called pHluorin, provides a powerful tool to monitor SV exo/endocytosis by targeting it to the SV lumen. However, tracking AP-driven SV recycling with the pHluorin-based probes is still largely limited to in vitro culture preparations because the introduction of genetically encoded probes and subsequent optical imaging is technically challenging in general for in vivo animal models or tissue preparations. Zebrafish is a model system offering valuable features, including ease of genetic manipulation, optical clarity, and rapid external development. We recently generated a transgenic zebrafish that highly expresses a pHluorin-labeled probe at motor neuron terminals and developed a protocol to monitor AP-driven SV exo/endocytosis at the neuromuscular junction (NMJ), a well-established synapse model that forms in vivo. In this article, we show how to prepare larval zebrafish NMJ preparation suitable for pHluorin imaging. We also show that the preparation allows time-lapse imaging under conventional upright epifluorescence microscope, providing a cost-effective platform for analyzing NMJ function.

The zebrafish larval neuromuscular junction is an attractive model for studying synaptic physiology. It is amenable to many experimental techniques, including electrophysiology and optical imaging. Here, we describe a protocol for imaging synaptic transmission using a pHluorin-based probe under an upright epifluorescence microscope.

Diseke Larva Zebra Balığının Nöromüsküler Kavşağında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümünün Canlı Görüntülenmesi

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

Source: Kinnavane, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63077">Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Electrophysiology and ...

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST