このプロトコルは、簡単な手順で電子顕微鏡に近い分解能で神経筋接合部の3D構造を定量的に分析するのに役立ちます。このプロトコルの主な利点は、筋肉サンプルが同様に処理され、共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡用に免疫標識されるため、動物モデルでの正確な神経筋接合部構造評価の時間が短縮されることです。私たちが開発した形態定量は、他の細胞内構造の解析に容易に適応させることができます。
私のチームの科学者であるマルティナ・マリネッロ博士を紹介し、筋肉のからかいと免疫染色がどのように行われるかを示し、このプロトコルの適用を成功させるための推奨事項をいくつか紹介できることを嬉しく思います。Genethonのイメージングプラットフォームからジェレミー・コゼット博士を紹介し、共焦点顕微鏡とSTED顕微鏡を使用した画像の取得と分析を展示します。安楽死後、2つの細かい鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1ミリメートルの小さな繊維束で前脛骨筋をからかい始めます。
次に、これらの筋肉束をPBSで調製した1%Triton X-100を含む24ウェルプレートに移し、室温で1時間、または摂氏4度で5時間穏やかに攪拌します。室温でPBSでサンプルを3回5分間洗浄した後、穏やかな攪拌下で摂氏4度で4時間、1%Triton X-100を含むPBSで調製した4%BSAからなるブロッキング溶液でサンプルをインキュベートします。次に、ニューロフィラメントMまたはシナプス小胞糖タンパク質2のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含む同じブロッキング溶液でサンプルを一晩インキュベートし、シナプス前軸索末端または活性ゾーンをそれぞれ標識します。
翌日、ラベルを付けた筋肉束を穏やかな攪拌下でPBSで5分間3回洗浄します。次に、それらを適切な二次抗体とともに、室温で2時間シェーカーに置いてインキュベートします。筋肉の束をもう一度洗った後、封入剤を入れたスライドの上に置きます。
次に、上部に1.5グレードのガラスカバースリップを置き、続いてスライドの両側に円筒形の磁石を置いて圧力をかけ、筋肉を平らにします。共焦点顕微鏡を使用して画像を取得するには、顕微鏡ソフトウェアを起動し、構成モードとしてマシンを選択し、テキスト原稿に記載されている設定に従って、各実験グループの神経筋接合部の画像スタックを収集します。セッションの最後に、[3Dビューアで開く]をクリックし、実験グループを代表する神経筋接合部を選択して、3Dラベリングを視覚化します。
シナプス後神経筋接合部とプレートの体積、最大強度投影面積、および相対的な曲がり角を計算するには、神経筋接合部の体積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、マクロが2番目のウィンドウで開いたら、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。分析するジャンクション サブフォルダーを含むネイティブ フォルダーを選択し、[選択] をクリックします。次に、保存フォルダのポップアップメニューで、ストレージフォルダを選択し、[選択]をクリックします。
「画像タイプ」という新しいポップアップメニューで、Z スタック取得のフォーマットを選択します。目的の染色に対応するRGBチャンネルを選択し、X、Yピクセルサイズ、Zステップを示します。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。
シナプス前神経フィラメントの蓄積を定量化するには、神経筋接合部の蓄積を定量化するためのマクロを画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップし、[マクロ]と[マクロの実行]をクリックします。ジャンクション サブフォルダー、ストレージ フォルダー、および前述のように Z スタック取得の形式を選択します。次に、染色情報ポップアップで、シナプス前およびシナプス後のラベルと色を指定し、[ピクセルサイズ]ポップアップ OK.In をクリックして、X、Yピクセルサイズを0.072マイクロメートル、Zステップを0.5マイクロメートルとして示し、[OK]をクリックします。独自のファイル形式が選択されている場合、マクロはピクセルサイズとZステップを直接読み取ります。
アセチルコリン受容体ストライプ間の距離を計算するには、中央ウィンドウの上部にある定量メニューを選択します。[ツール]タブをクリックし、強度を選択して、ラインプロファイルアイコンをクリックします。[オーバーサンプリング] を 1 に設定し、[チャネルの並べ替え] にチェックマークを付けます。
[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、描画ラインアイコンをクリックして、複数のストライプまたはジャンクションフォールドを垂直に交差するラインをトレースします。最初のピークの上部をクリックし、マウスの左ボタンを押しながらマウスポインタを動かし、次の最大ピークに達するまで移動します。
2 つのピーク間の距離に対応する DX 値に注意してください。右側のウィンドウの画像でマウスを右クリックし、[ROIの保存]を選択します。矢印アイコンをクリックした後、ROIをクリックし、ビンアイコンをクリックして削除します。
アセチルコリン受容体ストライプの幅を計算するには、左上のパネルの[ツール]タブで強度を選択し、[FWHMの決定]アイコンをクリックして、ソートチャネルにチェックマークを付けます。次に、[プロジェクトを開く]タブをクリックし、分析するフィルタリングされた画像を選択します。次に、右側のウィンドウのトップメニューにある長方形の描画アイコンをクリックします。
水平または垂直のストライプを選択し、ストライプに対して垂直に長方形を描画します。中央のウィンドウにプロファイルが表示されます。左側のパネルにある[平均投影]メニューの垂直または水平のいずれかをクリックし、ストライプの向きが垂直か水平かによって異なります。
中央のウィンドウの統計をクリックしてFWHM値を読み取り、前に示したようにROIを保存および削除します。蛍光α-ブンガロトキシンで標識されたシナプス後運動エンドプレートは、2つのマウス系統の変異体でより小さく、断片化して現れました。カスタマイズされたImage Jマクロを使用して神経筋接合部Zスタックを定量化したところ、対照と比較して、両方の疾患モデルでエンドプレート体積、最大強度投影、および相対的な曲がり角が著しく減少し、神経筋接合部の成熟障害が示されました。
Image Jカスタムマクロを使用してシナプス前軸索末端分岐分布を定量化すると、免疫標識が増加した2つの動物モデルでニューロフィラメントM分布のパターンが変化していることが明らかになりました。シナプス小胞糖タンパク質2染色により、Smn 2B/マウスにおいて、隣接する神経終末活動ゾーンを有するアセチルコリン受容体含有領域の占有率の43%低下が観察された。神経筋接合部シナプス後終末板の様相は、蛍光α-ブンガロトキシン標識および強度プロファイル解析によって明確に視覚化された。
神経筋接合部パラメータを評価すると、変異体の腓腹筋におけるアセチルコリン受容体ストライプの接合部襞距離と幅の増加が明らかになりました。信頼できる結果を得るには、筋肉の束を分離するために適用される強度に特に注意を払いながら、筋肉を適切にいじめることが重要です。このプロトコルは、以前は透過型電子顕微鏡などの複雑で時間のかかる手順によってのみ説明されていた神経筋接合部のより詳細な形態学的特徴付けを取得するのに役立ちます。
STEDイメージング手順は、神経筋接合部に影響を与える疾患の病態生理に寄与するシナプス前後のマーカーに関する新しい洞察の調査への道を開いた。
