Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

次のプロトコルは、Cの詳細な手順を説明します皮膚が負傷および創傷応答をアッセイするための虫 。 1.ニードル創傷は3,4 <ol><li> E.と標準NGM（線虫の増殖培地）プレート上の健康unstarvedワームを育てる20℃のインキュベーター中で維持食品として大腸菌 OP50細菌。 注：NGM寒天プレートとCのルーチン栽培のための方法エレガンス www.wormbook.org 6で見つけることができます。 </li><li> 20℃CO / Nで負傷し、培養の前に新鮮に播種プレート1日に25 L4ステージワームをピック。 </li><li>負傷する前に、針プラーを使用して、毛細血管から針を引っ張る。創傷に使用する針は、Cのマイクロインジェクションのために使用されるものと同じです虫 。 </li><li>すべてのワームは若い成人の段階であることを確認します。約30分間氷上でワームのプレートを置きます。冷却は、針の創傷を促進する、動物が低迷されます。 <li>解剖実体顕微鏡に氷から寒天プレートを取り外します。ワームのピックを使用して、寒天プレートの中央に25ワームを動かす。 </li><li>より簡単に針を保持するために、100μlのピペットチップに針を置きます。生殖腺を避け、針でワームの本体の前方または後方の部分を穿刺。一般的に、後部咽頭と前方生殖腺の間、または後の生殖腺と直腸の間で巻かしようとします。再使用の針を何度も、それらが破壊されるまで。 注：傷が動物に〜5-10ミクロンを貫通し、キューティクルや皮膚を穿刺簡単な、穏やかな呵責であることを確認してください。針はアニメーションを入力してください皮膚へらほぼ直角。傷は内臓に明らかな損傷、または身体の即時破裂が発生することはありません。傷の後に数秒間滲出細胞質の少量を観察。しかし、細胞内容が長時間にわたって漏れる場合、動物が生存しないであろう。最適な画像化のために、横方向の表皮シンシチウム（hyp7）または横方向の継ぎ目を巻か。 注：この手順は、ガラス針の使用を含む。 </li><li>ワームは20℃で、次に室温で文化を回復できるようにします。以下に記載のアッセイの数によって針創傷の成功を判断する。野生型動物の95％より多くは、針が若年成人段階で創傷後24時間を生き残る。幼虫や高齢者に負傷の影響がまだ広範囲に分析されていない。 </li></ol> 2.レーザー創傷は3 より正確な創傷を実行するためにフェムト秒レーザー照射（800 nm）を使用してください。 <ol><li>寒天Pを準備溶融した2％寒天7とガラススライド上に広告。パッドはCのライブイメージングのために使用される寒天パッドに似ていることを確認虫 。 </li><li>ワームのピックを持つアガロースパッドの上に10若い成虫を転送し、12 mMのレバミゾール液の2μlのドロップを追加。カバースリップで動物や液体をカバーしています。ワームは麻痺させるために1〜2分待ちます。 </li><li>スピニングディスク共焦点顕微鏡上にスライドガラスを置きます。ワームを見つけると100Xの目的とした横方向の前方または後方胞体表皮（NA 1.4から1.46）に焦点を当て、ステージを移動します。 </li><li> （対物前に測定）140 mWまでフェムト秒レーザーのパワーを設定します。 80 MHzのの繰り返し率でフェムト秒レーザーを使用してください。 注：（20ミリ秒で区切られた）200ミリ秒ずつの2つのパルスは、私たちの手の中に負傷のために十分である。 </li><li>表皮細胞の頂端面に焦点を当て、表皮を巻か。細胞質（バブリング）の局部的破壊、またはローカル漂白Oを守って使用する任意の蛍光マーカーF。 注：フェムト秒レーザーを使用するときに、適切なレーザー安全手順に従ってください。このような二光子顕微鏡のものとフェムト秒レーザーを使用して線または点走査は、レーザー創傷のための十分な電力を提供すべきである。 注：私たちは他のレーザーを使用しての直接の経験を持っていないが、原則として創傷に（C. elegansの細胞アブレーションに使用されるような）従来のUVレーザーを使用して可能にする必要があります。必要に応じて、表皮（N.プジョル、私信）を巻きつけ、ディスク共焦点を回転さに（FRAP）モジュールを光退色後の蛍光回復を使用しています。 </li></ol>創傷形成表皮のCa 2+応答の3可視化<ol><li>トランスジェニックC.を使用してください大人の表皮特異的プロモーターCOL-19（ 図1Aの制御の下で、表皮に（そのようなGCaMPシリーズのものなど）のCa 2+センサーを表現する線虫株は、導入遺伝子がにリストされています<stroNG&gt;表1）。そのような導入遺伝子発現レベルの内部対照としてtdTomatoなどの赤色蛍光タンパク質を発現する導入遺伝子を使用してください。 NOTE：表皮tdTomato蛍光が比較的安定しており、GCaMPイメージングと干渉しないように我々は、導入遺伝子発現のための内部コントロールとしてtdTomatoを使用している。 </li><li>表皮にトリガーのCa 2+の上昇が負傷針とレーザーの両方。針創傷容易スピニングディスク共焦点上で実行することができないようしかし、レーザー創傷は、Ca 2+応答（ 図1）の定量分析のために好適である。 </li><li> 100Xの目的とした回転ディスク共焦点（NA 1.4から1.46）と適切なフィルターセットを使用して多次元取得モード（インターバル時間114ミリ秒励起レーザー露光と2秒）でのタイムラプス画像を取得（GFPフィルタがGCaMP3のために動作します）。 注：CA 2+ RESPを調べるために約2時間毎に30秒タイムラプス画像を取得より長い時間経過にわたって負傷にオンセ。 </li><li>画像解析ソフトウェアを使用して、表皮細胞の細胞質ゾルおよびバックグラウンドの5つを中心とするそのうちの5つの近隣の10同等の領域（ROI）、平均GCaMP蛍光を測定する。 </li><li>傷害の前に、バックグラウンドで5 ROIの平均を引いた後、表皮における5のROIの蛍光を平均化することにより、ベースライン蛍光（F 0）を取得します。ベースラインに対する変化の比率として蛍光ΔFの変化を表現する[（F tは -F 0）/ F 0]。 </li></ol>創傷後F-アクチンダイナミクスの4可視化<ol><li>注：針創傷に応じて、徐々に傷の周りに閉じ創傷部位でのアクチンリングを観察します。このプロトコルセクションアッセイはアクチンリングの直径を測定することにより、創傷閉鎖。 </li><li>このように融合されたショウジョウバエモエシンアクチン結合ドメインとしてのF-アクチンのマーカーを発現するトランスジェニックワームを生成しますGFPは、（導入遺伝子juIs352）のcol-19（ 図2A）のような表皮特異的プロモーターの制御下で発現される。 注：私たちは、そのようなLifeactまたはF-tractin（未発表の結果）などの他のアクチン結合ドメインマーカーを使用して同様の結果を得た。 </li><li> P COL-19- GFP-モエシンジェニックワームに負傷針を実行します。針創傷後、約5分までに、創傷部位の周りにGFP-モエシンのリングを観察する。アクチンリングは直径が小さくなり、最終的には野生型動物（ 図2A）で負傷2-3時間後を閉じます。 </li><li>スライドガラス上の2％寒天パッドを準備し、2μlの12 mMのレバミゾール溶液にパッドの上に10のワームを転送する。画像GFP-モエシンリング従来の共焦点顕微鏡を用いて創傷後1時間。 注：使用し、共焦点顕微鏡1時間創傷後アクチンリングのzスタック（13×0.5μm）を取得する。 </li><li>創傷後アクチンリング径を測定します。表皮Gを定量するために、FP-モエシン、最初のzスタックの最大強度投影を行ってから、4ラインスキャンを描くGFP-モエシンリング上（互いに45°）。リングの直径は、4つのライン走査（ 図2B）のピーク距離平均ピークとして定義される。すでに閉じられているリングのために、直径が0以下のように定義されている。 注：これは、野生型創傷閉鎖過程を経て約半分の方法であるように、F-アクチンリングが便利に負傷1時間後に測定している。 Fアクチン環はまた、創傷閉鎖の経時変化を導出するために、複数の時点で測定することができる。創傷閉鎖のタイムラプスムービーは、レバミゾールを固定化したワームを使用して、ディスク共焦点顕微鏡を回転さを取得することができる。 </li></ol>表皮抗菌ペプチドの5アッセイの誘導注：創傷はまた、Cの自然免疫応答をトリガー虫の皮。抗菌性ペプチド（AMPS）をコードする遺伝子の転写は、INDです表皮にuced。 NLP-29（神経ペプチド様タンパク質）AMPが強く4を創傷により誘導される。表皮は、創傷後のAMPの発現を制御する方法の個々のAMPの転写レベルを検出するために、トランスジェニックレポーターまたはリアルタイムPCRを使用して、アッセイする。 <ol><li> 4が負傷に対する自然免疫応答のためのトランスジェニックレポーターアッセイ。 </li><li>内部コントロールとしてのP NLP-29- GFP とP COL-12-のDsRedが含まれているトランスジェニックレポーターfrIs7を発現する成体動物に（プロトコル1のように）針創傷を実行します。 GFPロングパスフィルタのような濃い赤やオレンジ無傷成体動物を観察します。 注：野生型のワームが負傷すると、PのNLP-29 -GFP発現を誘導しますが、オレンジ、黄色、またはGFPロングパス照明下で緑色にワームで、その結果、PのCOL-12 -dsRedには影響しません。そのようなPMK-1またはNSY-1な ​​どのp38 MAPK経路における遺伝子の機能の喪失は、NLP-29 -GFPをブロックします4を創傷後誘導。 PのNLP-29- GFPは、幼虫の段階で高いレベルで発現される</li><li>若い成人の動物でAMP誘導アッセイを行う。無傷対照動物は、GFPのレベルが低いことを確認してください。 注：P NLP-29- GFP発現は、浸透圧ストレス8によって誘導され、他の環境ストレスに敏感である。 </li><li>創傷後6時間、GFPロングパスフィルタでスコープを解剖蛍光を用いて、P NLP-29 -GFP誘導（ 図3）9 を持つワームの数をスコア。 注：1時間後創傷のP NLP-29- GFPが目に見えて、ピークから約6時間後に創傷に到達し、誘導された後、24時間後の創傷にまで上昇したままで。視覚的なスコアリング4,9によって発現を定量。あるいは、蛍光活性化セルソーターワーム4を用いて、発現レベルを定量化する。ワームソーターの場合は、少なくとも50の動物が負傷する必要がある。 </li><li>資格でのためのリアルタイムPCRアッセイ個々のAMP遺伝子の転写レベルをntitating。アッセイ転写物のいくつかの遺伝子のためのレベル：NLP-29、NLP-30、CNCの-1、およびCNCの-5。 </li><li>野生型または変異型ワームに負傷針を実行します（プロトコル1を参照） </li><li>希望の時間に50負傷したワームや50無傷ワーム（ 例えば、3、6、24時間）後の創傷を収集します。 </li><li>製造業者の指示に従って市販のキットを用いてRNAを抽出します。 </li><li>商業逆転写酵素キットを用いて全20μlのcDNAを取得するために逆転写を行います。 </li><li> RT-PCRのために、フルオレセインおよび0.2μMのプライマーと緑のスーパーミックスとの組み合わせで各サンプルから0.2μLのcDNA（1/40）を使用します。 RNAの品質を比較するために、参照としてAMA-1またはSNB-1 RT-PCRを使用します。内部統制（AMA-1またはSNB-1）に正規化することにより、AMPの相対発現レベルを比較し、またはノルムで（負傷したワーム/非創傷ワームでAMP誘導）誘導倍率創傷後を比較内部統制にalizing。 注：CNC-1とCNC-5は、その転写が10を負傷によって活性化され、家族の抗菌ペプチドをcaenacinされている。典型的には、針創傷は、4時間10の時間経過にわたる式（CNCの-1〜500倍）を誘導する。発表された研究に用いたプライマーを表2に示す。 </li></ol>創傷後6.アッセイサバイバル<ol><li>注：のCa 2+依存性の創傷修復経路および自然免疫応答経路：創傷は、表皮中に少なくとも2個の独立したシグナル伝達経路を活性化する。両方の経路は、無菌創傷の完全な生存のために必要とされる。変異体またはRNAi治療が創傷治癒に影響するかどうかをテストするには、24〜48時間後に創傷の生存率を測定する。必要に応じて、長寿4,9上負傷の影響を決定するために、従来の寿命アッセイを使用しています。 </li><li> （若年成人（L4 + 24時間）のワームで50ワームを負傷させた針を実行し、リピートセベ上記のプロトコル1以下RAL回）。コントロールとして非創傷ワームの同等の数を維持する。 </li><li>生存ごとに24時間を確認してください（新しい寒天プレートに24時間毎に負傷したワームを転送する）。そのようなGTL-2またはTIR-1、正規化された無傷対照動物にとして創傷修復における欠陥がある変異体において創傷後50％の生存〜24時間を守ってください。死は、ワームのピックによってタッチする運動応答の欠如として定義されている。 </li></ol>

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D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

針、レーザー創傷のためにここに提示される方法は、損傷を修復する表皮上皮の能力を評価するための補完的なアプローチを提供する。針創傷は表皮、キューティクル、そしておそらく内部基底膜を破壊に対し、レーザー創傷は、表皮に限定することができ、比較的ローカライズと（レーザーの構成に応じて）である。針創傷は、より正確に病原体または自然環境での機械的な損傷によって?...

皮膚創傷治癒のメカニズムは基本的な生物学的興味のものであり、人間の健康に関連する。脊椎動物および哺乳動物における創傷治癒は、複数の組織および1シグナルの協調的応答の複雑な系列を含む。多くの単純な遺伝的モデル生物はまた、皮膚創傷2治癒することができる。これは、皮膚創傷修復の遺伝的に扱いやすいモデルを分析することが重要である。我々と他の人は肌のための新しいモデルは3,4創傷治癒などの線虫（Caenorhabditis elegans）を使用し始めている。このプロトコルの目的は、Cを使用する研究者のより広範なセットを可能にすること表皮の創傷治癒の分子·細胞メカニズムを調べるためのツールとして虫 。 C.虫の皮膚は（また皮下組織として知られている）、表皮および細胞外のキューティクル5を備えている。大人の表皮は最大でシンシチウムkがあるの多核合胞体の数が少ないから形成されているnownとしてhyp7。表皮は、その頂端表面にキューティクルを分泌する簡単な上皮である。皮膚は積極的に皮膚浸透性の病原体から身を守る、小さな傷4を修復することができます。 C.の創傷修復エレガンススキンはすべて、野生型動物は針、又はレーザ照射による局所的な皮膚損傷による小さな刺し傷に耐えることができる生き残るほぼ、ロバストである。C. elegansの皮膚創傷は、表皮自然免疫応答、創傷閉鎖、および瘢痕形成4を含む応答のスイートを、トリガされます。大人の表皮は有糸分裂後で、創傷治癒、上皮増殖または細胞移動とは対照的に、局所的な細胞応答を含む。我々は、皮膚の創傷が膜TRPMチャネルGTL-2と内部のCa 2+を格納3を必要とする、表皮のCa 2+が大きく、持続的な増加を誘発することが示されている。表皮のCa 2+シグナルは、少なくともF-アクチンリングの形成及び閉鎖WOために必要とされるウントサイト。創傷はまた、NLP-29のようなAMPの転写を活性化する自然免疫応答を誘導する。 AMPの創傷誘導性転写は、表皮4に自律的に動作するTIR-1 / PMK-1 p38 MAPキナーゼカスケードに依存している。どちらのCa 2+シグナル伝達経路におけるまたは先天性免疫応答の欠陥は低い生存創傷後につながる。 C.の比較的単純な構造elegansの表皮、in vivoイメージングのためにその遺伝従順および利点は、創傷修復の複数の側面を研究するためにそれを優れたシステムを作る。 針創傷およびレーザー創傷：ここでは、創傷の2つの一般的な方法のためのプロトコルを提示する。ニードル創傷は（針プラー以外）何の特殊な装置を必要とせず、経験で一日あたりのワームの何百もの上で実行することができます。針創傷寒天プレート上で生育した動物に対して行われる。対照的に、レーザー創傷はanes上で実行されるthetized動物はカバーガラスの下のパッド寒天上に搭載されており、損傷に対する細胞応答のライブイメージングに適しています。

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

C. elegansの表皮とキューティクルが負傷に起因する局所的な損傷を修復することができますシンプルで洗練されたスキン層を形成する。このモデルにおける創傷応答および修復の研究は、細胞骨格および組織損傷に対するゲノム応答の我々の理解を照らしている。 C.を創傷に、2つの最も一般的に使用される方法虫の大人の皮膚マイクロインジェクション針、および現地レーザー照射との呵責である。針創傷は、局所的にキューティクル、表皮、および関連する細胞外マトリックスを破壊し、また内部組織を損傷することがあります。より局所的な損傷でレーザー照射をもたらす。創傷は、上昇した表皮のCa 2+（秒分）、創傷部位（1〜2時間）でのアクチン含有環の形成及び閉鎖、抗菌ペプチド遺伝子の上昇転写（2-24含め容易にアッセイした応答の連続をトリガーする時間）、および瘢痕形成。基本的にすべての野生型の大人の動物は、どこに創傷を生き残る創傷修復または他の応答における欠損変異株として生存率の低下を示している。詳細な針とレーザー創傷のためのプロトコル、および定量および創傷応答と修復プロセス（カルシウム動態、アクチン動態、抗菌ペプチドの誘導、および生存）の可視化のためのアッセイが提示されている。

そのようなGCaMPsとしてCAセンサ（ 図1）を用いて可視化などのレーザーやニードル創傷は、表皮のCaレベルが急速かつ持続的上昇をトリガーします。 Caの上昇は数秒以内に発生し、数十分のために上昇したままです。針創傷を再現創傷部位（ 図2）におけるF-アクチンリングの形成をもたらす。これらは、数分以内に表示され、創傷後1〜2時間かけて徐々に近い。アクチ...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em&gt; C。エレガンス</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K ビュー.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

神経科学

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

生物工学

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

行動学

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96ウェルプレートに細胞遊走/創傷治癒を行う装置

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

発生生物学

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

免疫・感染学

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

医学

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル<em&gt; C.虫</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

生物学

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ

要約

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Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

マイクロインジェクションアッセイをキズや

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

96ウェルプレートに細胞遊走/創傷治癒を行う装置

創傷による多重化を研究するショウジョウバエモデル

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル

刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ

要約

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Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

マイクロインジェクションアッセイをキズや

線虫集団ベースの化学感覚嗜好アッセイの自動解析

96ウェルプレートに細胞遊走/創傷治癒を行う装置

創傷による多重化を研究する ショウジョウバエ モデル

マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

後部皮下ポリビニルアルコールスポンジの移植と切除テール皮膚創傷モデルを用いた急性創傷治癒の評価

インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー

における虚血/再灌流のための無酸素飢餓モデル

刺胞動物モデル生物Clytia hemisphaericaを用いたin vivoでの上皮創傷治癒の特徴付け

創傷による多重化を研究するショウジョウバエモデル