Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

다음 프로토콜은 C.에 대한 자세한 절차를 설명 엘레 피부 상처와 상처 응답을 분석합니다. 1. 바늘 상처 3,4 <ol><li> 표준 NGM (선충 성장 매체) E.와 함께 접시에 건강한 unstarved 웜 성장 20 ° C 배양기에서 유지 음식으로 대장균 OP50 박테리아,. 참고 : NGM 한천 플레이트와 C의 일상 재배하는 방법 엘레 www.wormbook.org (6)에서 확인할 수있다. </li><li> 20 ° CO / N에서 부상과 문화 전에 갓 시드 플레이트 일일 25 L4 무대 웜을 선택합니다. </li><li> 부상하기 전에 바늘 풀러를 사용하여 모세 혈관에서 바늘을 빼냅니다. 상처에 사용되는 바늘의 C. 마이크로 인젝션에 사용되는 것과 동일하다 엘레. </li><li> 모든 벌레 젊은 성인 단계에 있는지 확인합니다. 약 30 분 동안 얼음에 벌레의 접시를 놓습니다. 냉각 동물 바늘 상처를 용이 부진 할됩니다. <li> 해부 실체 현미경으로 얼음에서 한천 플레이트를 제거합니다. 웜 픽을 사용하여 한천 플레이트의 중심에 25 벌레를 이동합니다. </li><li> 더 쉽게 바늘을 잡고 100 μL 피펫 팁에 바늘을 놓습니다. 생식선을 피하고, 바늘 웜 본체의 전방 또는 후방 부 천공. 일반적으로, 후방 및 전방 인두 생식선 사이 또는 후방 생식소와 항문 사이에 감겨 시도. 재사용 바늘 여러 번, 깨지까지. 주 : 동물에 ~ 5 ~ 10 μm의 침투, 상처가 표피와 피부에 구멍을 간략하게, 부드러운 거시기 있는지 확인. 바늘 ANIM를 입력해야합니다피부 알 대략 직각. 상처는 내부 장기에 손상이 없는지, 또는 신체의 즉각적인 파열의 원인이 안됩니다. 세포질 상처 후 몇 초 스며 나오는 모습을 소량 관찰; 휴대 내용이 장시간에 걸쳐 누출 그러나 동물들은 살아남지 못할 것이다. 최적 영상화, 횡 표피 syncytium (hyp7) 또는 측면 솔기 상처. 참고 :이 절차는 유리 바늘의 사용을 포함한다. </li><li> 웜은 20 ° C에서 다음 실온에서 문화를 복구 할 수 있습니다. 아래에 설명 된 분석의 수에 의하여 바늘 상처의 성공을 판사. 야생형 동물의 95 % 이상은 바늘이 젊은 성인 단계에서 부상 후 24 시간 생존. 유충 세 이상 성인에서 부상의 효과는 아직 광범위하게 분석되지 않았습니다. </li></ol> 2. 레이저 상처 3 보다 정확한 상처를 수행 할 펨토초 레이저 조사 (800 나노 미터)를 사용합니다. <ol><li> 한천 페이지 준비용융 2 % 한천 7 유리 슬라이드에 광고. C. 패드의 라이브 영상을 위해 사용 한천 패드 비슷 확인 엘레. </li><li> 웜 선택과 아가로 오스 패드에 10 젊은 성인 웜을 전송, 12 mM의 levamisole을 용액 2 μL 드롭을 추가합니다. 동물과 커버 슬립와 액체를 커버. 벌레가 마비 1-2 분을 기다립니다. </li><li> 회전 디스크 공 초점 현미경 상으로 유리 슬라이드를 놓습니다. 벌레를 찾아 100X의 목적으로 측면 전방 또는 후방 세포 융합 표피 (NA 1.4-1.46)에 초점을 무대로 이동합니다. </li><li> 140 메가 와트 펨토초 레이저의 파워를 설정 (목적 전에 측정). 80 MHz의 반복율로 펨토초 레이저를 사용한다. 참고 : (20 밀리로 구분) 200 밀리 초 각의 두 펄스가 우리 손에 상처 충분합니다. </li><li> 표피 세포의 꼭대기의 표면에 초점 표피 상처. 세포질 (버블)의 현지 중단, 또는 로컬 표백 O를 관찰사용 된 형광 마커 바. 참고 : 펨토초 레이저를 사용하는 경우 적절한 레이저 안전 절차를 따르십시오. 이러한 두 광자 현미경에서와 펨토초 레이저를 사용하여 라인 또는 포인트 스캔 레이저 상처에 대한 충분한 전력을 제공해야한다. 참고 : 우리는 다른 레이저를 사용하여 직접 경험을하지 않지만, 원칙 상처에 (C. 세포 절제 엘레 간스에서 사용) 기존의 UV 레이저를 사용하여 수 있어야한다. 선택적으로, 표피 (N. 푸욜, 개인 통신) 상처는 디스크 공 초점을 회전에 (FRAP) 모듈을 광표백 후 형광 복구를 사용합니다. </li></ol> 상처에 표피 칼슘 응답 3. 시각화 <ol><li> 유전자 변형 C.를 사용하여 성인 상피 세포 특이 적 프로모터 COL-19 (그림 1A의 제어하에, 표피 (예 : GCaMP 시리즈의 것과 같은) 칼슘 센서를 표현 엘레 균주, 유전자는에 나열되어 있습니다 <stroNG&gt; 표 1). 형질 전환 유전자 발현 수준에 대한 내부 통제 등 tdTomato로 적색 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 유전자를 사용합니다. 참고 : 우리는 표피 tdTomato 형광이 상대적으로 안정적으로 유전자 발현을위한 내부 통제로 tdTomato를 사용하고 GCaMP 영상을 방해하지 않습니다. </li><li> 표피에 트리거 칼슘 상승 부상 바늘과 레이저 모두. 니들 상처 용이 스피닝 디스크 촛점을 수행 할 수 없습니다 그러나, 레이저 상처는 칼슘 응답 (도 1)의 정량 분석을하는 것이 바람직하다. </li><li> 100X의 목적으로 회전 디스크 공 초점 (NA 1.4-1.46) 및 적절한 필터 세트를 사용하여 다차원 획득 모드 (간격 시간 114 밀리 초 여기 레이저 노출 2 초)의 시간 경과 이미지를 획득 (GFP 필터는 GCaMP3에 대해 작동합니다). 참고 : 칼슘 RESP를 검사하는 데 약 2 시간 동안 시간 경과 이미지마다 30 초를 취득긴 시간의 과정을 통해 부상에 온세. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 백그라운드에서 표피 세포 세포질 다섯 중심 다섯 관심있는 (ROI)의 열 동등한 영역에서 평균 GCaMP 형광을 측정한다. </li><li> 그때 부상 전에 배경 5의 ROI 평균을 감산 표피에서의 ROI에서 5 형광의 평균을 기준선 형광 (F 0)을 얻었다. 기준선 [(F T는 -F 0) / F 0]에 대한 변화의 비율 ΔF 형광의 변화를 표현한다. </li></ol> 부상 후 F - 굴지 역학 4. 시각화 <ol><li> 주 : 바늘 상처에 응답하여, 서서히 상처 주위 폐쇄 상처 부위에서 액틴 링을 관찰한다. 이 프로토콜 부 분석법 액틴 링 직경을 측정함으로써 폐쇄 권취. </li><li> 이러한 융합 초파리 moesin 액틴 결합 도메인으로 F - 굴지 마커를 표현하는 유전자 변형 벌레를 생성GFP, 예컨대 (트랜스 juIs352) COL-19 (도 2a)로 표피 특이 적 프로모터의 제어하에 발현. 참고 : 우리는 Lifeact 또는 F-tractin (게시되지 않은 결과)로 도메인 마커 바인딩 다른 액틴을 사용하여 유사한 결과를 얻었다. </li><li> P COL-19- GFP-moesin 유전자 변형 웜에 상처 바늘을 수행합니다. 바늘 상처 후 ~ 5 분으로 상처 부위 주변 GFP-moesin의 반지를 관찰합니다. 액틴 링 직경이 작아지고 결국 야생형 동물 (그림 2A)에 부상 2 ~ 3 시간 게시물을 닫습니다. </li><li> 유리 슬라이드에 2 % 한천 패드를 준비하고 12 mM의 2 μL의 levamisole 용액에 패드 (10) 상에 웜을 전송. 기존의 공 초점 현미경을 사용하여 부상 후 이미지 GFP-moesin 반지 1 시간. 참고 : 사용 공 초점 현미경은 1 시간 부상 후 액틴 링의 Z-스택 (13 X 0.5 μm의)을 취득합니다. </li><li> 부상 후 액틴 링의 직경을 측정한다. 표피 G를 정량하는 방법FP-moesin 먼저 Z 스택의 최대 강도 투사을 다음 4 라인 스캔을 그릴 GFP-moesin 링을 통해 (서로 45 °에서). 링 직경은 4 개의 라인 스캔 (그림 2B)의 피크 거리에 평균 피크로 정의된다. 이미 닫은 반지를 들어, 직경은 0 μm의로 정의된다. 참고 :이 야생형에 상처 봉합 과정을 통해 약 절반 방법이기 때문에 F - 굴지 링 편리 부상 1 시간 게시물을 측정한다. F 액틴 링은 또한 상처 폐쇄 시간 코스를 유도하도록 여러 시점에서 측정 될 수있다. 상처 폐쇄의 시간 경과 영화의 levamisole 고정화 웜을 사용하여 디스크 공 초점 현미경을 회전 얻을 수있다. </li></ol> 표피 항균 펩타이드의 5 분석 유도 참고 : 상처도 C에서 선천성 면역 반응을 유발 엘레 피부. 항균 펩타이드 (AMPS)를 코딩하는 유전자의 전사 산업사입니다표피 uced. NLP-29 (신경 펩타이드와 같은 단백질) AMP 강력 4 명이 부상에 의해 유도된다. 표피 상처 후 AMP 발현을 조절하는 방법을 개별 AMP 사체 레벨을 검출하는 트랜스 제닉 리포터 또는 실시간 PCR을 사용하여 분석한다. <ol><li> 4 명이 부상에 대한 선천성 면역 반응에 대한 유전자 변형 기자 분석. </li><li> 내부 통제로 P의 NLP-29- GFP 및 P COL-12을 DsRed를 포함하는 유전자 변형 기자 frIs7을 표현 성인 동물 (프로토콜 1과) 바늘 상처를 수행합니다. GFP 긴 패스 필터에 어두운 빨간색이나 주황색 unwounded 성인 동물을 관찰한다. 참고 : 상처 야생 형 웜 P의 NLP-29 -GFP 발현을 유도하지만 GFP 긴 패스 조명 아래 오렌지, 노란색 또는 녹색을 표시 벌레 결과, P의 COL-12 -dsRed에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 PMK-1 또는 p38 MAPK 경로에서의 유전자의 기능의 상실 nsy-1 차단 NLP-29 -GFP4 명이 부상 후 유도. P의 NLP-29- GFP는 유충 단계에서 높은 수준으로 발현된다 </li><li> 젊은 성인 동물 AMP 유도 분석을 수행합니다. unwounded 제어 동물 GFP의 낮은 수준을 가지고 있는지 확인하십시오. 주 : P-29- NLP GFP 발현은 또한 삼투 스트레스 (8)에 의해 유도되고, 다른 환경 스트레스에 민감 할 수있다. </li><li> 상처 후 6 시간은 GFP 긴 패스 필터와 범위를 해부 형광을 이용하여 P의 NLP-29 -GFP 유도 (그림 3) 9이 웜의 수를 점수. 참고 : 1 시간 후 상처의 P NLP-29- GFP가 눈에 띄게 유도에서, 다음 6 시간 후 - 상처에 대한 피크에 도달하고하면 24 시간 후 상처까지 상승 남아. 시각 득점 4,9에 의해 발현을 정량화. 대안 적으로, 형광 활성화 웜 소터 4를 사용 발현 수준을 정량화. 웜 분류기를 들어, 적어도 50 동물 부상 될 필요가있다. </li><li> ...로서 실시간 PCR 분석AMP 개별 유전자의 전 사체 수준을 ntitating. 여러 유전자 ​​분석 성적 수준 : NLP-29, NLP-30, CNC-1 및 CNC-5. </li><li> 야생형 또는 돌연변이 웜에 상처 바늘을 수행합니다 (프로토콜 1 참조) </li><li> 원하는 시간에 50 명이 부상 웜 및 50 unwounded 웜 (예 : 3, 6, 24 시간) 후 상처를 수집합니다. </li><li> RNA는 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 압축을 풉니 다. </li><li> 상업 역전사 효소 키트를 사용하여 총 20 μl의 cDNA의를 얻기 위해 역전사를 수행합니다. </li><li> RT-PCR의 경우, 녹색 형광 및 수퍼 믹스와 0.2 μM 프라이머와 조합하여 각 샘플 0.2 μL의 cDNA (1/40)을 사용한다. RNA의 질을 비교하기 위해 기준으로서 AMA-1 또는 SNB-1 RT-PCR을 사용한다; 내부 통제 (AMA-1 또는 SNB-1)로 정규화하여 AMP 상대적 발현 량을 비교, 또는 규범에 의해 (부상 웜 / unwounded 웜에 AMP 유도) 배 유도 후 상처를 비교내부 통제를 지향 모델. 참고 : CNC-1과 CNC-5는 누구의 전사 10 명이 부상에 의해 활성화되는 가족 항균 펩티드를 caenacin 있습니다. 전형적으로, 바늘 상처가 발현을 유도 (CNC-1 ~ 500 배) 4 시간 10 시간 걸쳐. 출판 작업에 사용되는 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다. </li></ol> 6. 분석 생존 후 부상 <ol><li> 참고 : 칼슘 의존 상처 수리 경로 및 선천성 면역 반응 경로 : 상처는 표피에 적어도 두 개의 독립적 인 신호 전달 경로를 활성화합니다. 두 경로 멸균 상처의 전체 생존을 위해 필요합니다. 돌연변이 또는 RNAi의 치료는 상처 치유에 영향을 미치는 여부를 테스트하기 위해, 24 ~ 48 시간 포스트 상처에서 생존을 측정한다. 선택적으로, 장에 -4,9- 부상의 효과를 결정하기 위해 종래의 수명 세이를 사용한다. </li><li> (젊은 성인 (L4 + 24 시간) 웜에 50 벌레 부상 바늘을 수행, 반복 세비위의 프로토콜 한 다음 RAL 회). 컨트롤과 같은 unwounded 웜의 동등한 수를 유지한다. </li><li> 생존에게 (새로운 한천 판 매 24 시간에 전송 부상 웜) 매 24 시간을 확인합니다. 이러한 GTL-2 또는 사격-1, 정규화 unwounded 제어 동물로 상처 수리에 결함이 돌연변이 체에서 부상 후 50 %의 생존율 ~ 24 시간을 관찰한다. 죽음은 웜의 선택에 의해 접촉하는 전위의 응답의 부족으로 정의된다. </li></ol>

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The authors are not aware of any competing interests.

바늘과 레이저 상처 여기 제시된 방법은 손상을 복구하는 표피 상피의 능력을 평가하기위한 보완적인 접근법을 제공한다. 바늘 상처가 표피, 표피 및 내부 가능성 기저막을 방해하는 반면 레이저 상처는 표피에 국한 될 수 비교적 지역화 및 (레이저 구성에 따라)이다. 바늘 상처보다 정확하게 병원균이나 자연 환경에서 기계적 손상에 의해 입은 상처과 유사 할 수 있습니다. 일반적으로, 바늘 상?...

피부 상처 치유 메카니즘은 기초 생물학이 관심있는 인간의 건강에 관련된. 척추 동물 및 포유 동물에서 상처 치유가 코디 응답 여러 조직 및 1 시그널링의 복잡한 시리즈를 포함한다. 많은 간단한 유전자 모델 생물은 피부 상처 (2)를 치유 할 수있다. 이는 피부 상처 복구 유전자 취급 용이 모델을 분석하는 것이 흥미 롭다. 우리와 다른 피부 상처에 대한 새로운 모델이 3,4 치유로 예쁜 꼬마 선충을 사용하기 시작했다. 이 프로토콜의 목적은 C.을 사용하는 연구자의 ​​광범위한 세트를 활성화하는 것 도구로 elegans의 표피 상처 치유의 분자 및 세포 메커니즘을 조사합니다. C. 엘레 피부 (피하도라고도 함) 및 표피 세포 외 5 표피를 포함한다. 성인 표피가 가장 큰 k를 syncytium 인 multinucleate syncytia의 소수로부터 형성된다nown으로 hyp7. 표피는 선 단면에 표피를 분비 단순한 상피이다. 피부는 적극적으로 피부를 관통 병원균에 대한 방어 및 작은 상처 (4)를 복구 할 수 있습니다. C.의 상처 수리 엘레 피부 모두 야생형 동물 바늘, 또는 레이저 조사에 의한 로컬 피부 손상에 의한 작은 천공 상처 견딜 수 생존 거의 견고하다. C. 엘레 피부 상처는 표피 선천성 면역 반응, 상처 폐쇄 및 흉터 형성 (4)를 포함하여 응답의 제품군을 트리거합니다. 성인 표피 포스트 - 유사 분열하고, 상처 치유 표피 증식 또는 세포 이동과 반대로 지방 세포 반응을 포함한다. 우리는 피부에 상처가 막 TRPM 채널 GTL-2 및 내부 칼슘 저장 (3)을 필요로하는, 칼슘 2 + 표피에 큰 지속적인 증가를 유발 보여 주었다. 표피 칼슘 신호에서 F - 굴지 고리의 형성과 폐쇄 WO 필요싶게 사이트. 상처를 입는 또한 NLP-29 암페어의 전사를 활성화 선천성 면역 반응을 유도한다. 앰프의 상처에 의한 전사는 TIR-1 표피 4 자율적으로 행동 / PMK-1 P38의 MAP 키나제 캐스케이드에 따라 달라집니다. 중 칼슘 신호 전달 경로 또는 선천성 면역 반응의 결함은 낮은 생존 후 상처로 이어질 것입니다. C.의 비교적 간단한 구조 elegans의 표피, 생체 내 이미징을위한 유전의 취급 용이성 및 장점은 상처 수리의 여러 측면을 연구하기 위해 그것에게 우수한 시스템을 확인합니다. 바늘 상처 및 레이저 상처 : 여기에서 우리는 상처의 두 가지 일반적인 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 바늘 상처는 (바늘 풀러 제외)에는 전문 장비가 필요하지 않으며, 경험 하루에 벌레 수백 수행 할 수 있습니다. 바늘 상처는 한천 플레이트에 성장 동물에서 수행됩니다. 대조적으로, 레이저는 상처에 대해 수행된다 anesthetized 동물 커버 슬립 아래 패드 한천에 장착하고, 손상 세포 반응의 라이브 영상에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

C. elegans의 표피와 표피는 부상으로 인한 국부적 손상을 복구 할 수있는 간단하면서도 정교한 피부 층을 형성한다. 이 모델에 상처 응답 및 수리의 연구는 세포 골격과 조직 손상에 대한 게놈의 답변에 대한 우리의 이해를 조명했다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법을 권취하기 C. 엘레 성인 피부는 미세 주사 바늘 및 지역의 레이저 조사와 거시기 있습니다. 로컬 부상 바늘은 표피, 표피 및 관련 세포 외 매트릭스를 방해하고, 또한 내부 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 더 현지화 된 손상에 레이저 조사 결과. 상처는 상승 표피 칼슘 (초 분) 형성과 상처 사이트 (1-2 시간), 항균 펩타이드 유전자의 높은 전사에서 액틴 함유 링의 폐쇄를 포함하여 쉽게 분석 응답의 연속 (2-24 트리거 시간), 흉터 형성. 본질적으로 모든 야생형 성인 동물 여기서 상처 생존상처 수리 또는 다른 응답에 결함이있는 돌연변이로 생존을 감소 보여줍니다. 자세한 바늘과 레이저 상처에 대한 프로토콜 및 정량 상처 응답 및 복구 프로세스 (칼슘 역학, 굴지 역학, 항균 펩타이드 유도, 생존)의 시각화에 대한 분석은되게됩니다.

이러한 GCaMPs 같은 칼슘 센서 (그림 1)과 시각으로 레이저 또는 바늘 상처는 표피 칼슘 수준의 신속하고 지속적인 상승을 트리거합니다. 칼슘 상승 초 이내에 발생하고 수십 분에 대한 높은 남아있다. 재현성 부상 바늘 상처 사이트 (그림 2)에서 F - 굴지 고리의 형성을 초래; 이러한 분 이내에 나타나며, 부상 후 점차 가까이 1-2 이상의 시간. 액틴 링이 적게보다 정확한 레이?...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K 조회수.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

연구

신경과학

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

생체공학

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

선충 집단에 기반한 화학 감응도 선호 분석의 자동화 된 분석

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

행동분석학

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

발생학

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

상처로 인한 다중계를 연구하는 드로소필라 모델

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

기계적 자극 및 높은 해상도 C. 선 충 의 이미징에 대 한 마이크로 장치를 사용 하 여

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

등지성 폴리비닐 알코올 스폰지 이식 및 절제 꼬리 피부 상처 모델을 사용하여 급성 상처 치유의 평가.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

면역학 및 감염병학

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

의학

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

생물학

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험

요약

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