このプロトコルは、生きた動物における創傷治癒中の上皮細胞の可視化を可能にする。それは私達が細胞が彼らの自然な複雑な環境でどのように振る舞うかを見ることを可能にします。この技術は、細胞外マトリックスと細胞質に試薬を導入して、生きた動物の創傷治癒中の細胞の広がりと遊走に対するこれらの試薬の効果を研究します。
上皮創傷治癒とクリティアは、より複雑な動物の治癒に非常に似ています。したがって、創傷治癒のメカニズムとそれらがどのように始まったかについて、このシステムから多くを学ぶことができます。これらの手順を実演するのは、エリザベス・リーと研究技術者のエミリー・ワットです。
創傷のプロセスを開始するには、ピペットチップをハサミで切断し、直径約0.5〜0.7センチメートルの拡大開口部を作成して、修正トランスファーピペットを準備します。修正されたトランスファーピペットを使用して、確立されたポリープコロニーから収集されたメデューサを、メデューサX傘を上に向けて、くぼみスライドに置きます。十分な量の人工海水(ASW)が動物を覆っていることを確認してください。
細胞内および細胞間に微小な傷を作るには、動物の上にカバースリップを置きます。カバースリップはメソグレアを圧迫し、圧縮された組織のリバウンドは細胞をわずかに離します。作成された微小創傷を観察するために、動物をすぐに画像化します。
小さな上皮創傷を作成するには、前に示したように、修正されたトランスファーピペットを使用して、メデューサX傘を上に向けてメデューサをくぼみスライドに置きます。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、メデューサの表面をそっと引っ掻きます。穏やかな引っかき傷は、基底膜に裂け目を作る可能性があります。
イメージング用のカバースリップで動物を覆います。カバースリップを配置するだけで、引っかき傷がなくても小さな上皮の傷を作るのに十分な場合があります。マイクロピペットピラーとガラスキャピラリーチューブを使用して、テキストで概説されている手順に従って、マイクロインジェクションニードルを準備します。
空のマイクロインジェクションニードルをマイクロマニピュレーターに取り付けられたマイクロインジェクションホルダーに入れ、開口部が約20〜40ミクロンになるように針の先端を切断します。マイクロインジェクターの保持圧力をゼロに設定し、排出圧力を約20ポンド/平方インチに設定します。マイクロインジェクターを2秒間の空気パルスを供給するように設定します。
大きな上皮創傷を作成するには、前に示したように、メデューサをうつ病スライドに置きます。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロインジェクションの針先を水に注意深く浸し、メデューサの上皮表面に近づくように引っ込めて、マイクロインジェクション針の先端を水のすぐ上にとどまるように調整します。インジェクターのスタートを押して空気をパルスします。
先端の幅に応じて、同じ場所でパルスを2〜4回繰り返します。チップが大きいほど、必要なパルスは少なくなります。大きな傷を画像化するために、負傷した動物をカバースリップで覆います。
フォーカスを x 傘に合わせます。六角形のセルは透明でなければなりません。傷を手動で識別して画像化します。
画像をムービーとしてリアルタイムで収集するプログラム、または一連の画像を一定の間隔で収集するプログラムを起動します。進行状況を監視して、創傷領域が視野から外れないようにし、目的の細胞に焦点が合ったままであることを確認します。染料や薬を注入するには、テキストで概説されている手順に従ってマイクロ注射針を作ります。
メデューサに注射するための過剰量の染料または薬物を入れた長いピペットチップを使用して、マイクロインジェクションニードルを埋め戻します。改造トランスファーピペットを使用して、サブ傘を上に向けてメデューサをポリジメチルシロキサンまたはPDMS注射皿に入れ、動物を覆うのにちょうど十分なASWを入れます。皿を解剖顕微鏡のステージに置きます。
マイクロインジェクションの針先に焦点を合わせ、メデューサ近くの水中に進めます。マイクロマニピュレーターを使用して、針が曲がって折れるまで針を皿に押し込みます。約10〜20ミクロンの先端開口部を作成します。
マイクロマニピュレーターを使用して、X傘に穴を開けることなく、針の先端をサブ傘を通してメソグレアに挿入します。マイクロインジェクターで、保持圧力をゼロに設定し、射出圧力を20ポンド/平方インチ以下に設定します。1つまたは2つの象限に注入し、それぞれにその象限の領域の約4分の1の染料または薬物のスポットを充填します。
注入される染料または薬物に応じて、動物は新鮮なASWのビーカーに入れられ、染料または薬物の拡散とインキュベーションが可能になります。イメージングのために、修正されたトランスファーピペットを使用してメデューサをうつ病スライドに取り付け、X傘を上に向けて動物を配置します。注射された試薬の効果をテストするために、この段階で動物を負傷させることができます。
細胞内および細胞間の微小創傷は、創傷閉鎖中に小さな層状突起を形成した。これに続いて収縮し、傷は1分以内に治癒しました。小さな上皮創傷はまた、ラメリポディアの形成およびラメリポディア接触の伸展によって治癒した。
急速かつ進行性の創傷閉鎖は、新たに形成された創傷縫合に沿った組織収縮に先行した。経時的な全創傷面積のパーセンテージとして表された2つの小さな創傷の正規化された治癒率は、創傷閉鎖動態におけるいくらかの変動性を示した。14の異なる創傷からのデータを使用して、未処置動物における平均創傷治癒曲線を確立した。
基底膜損傷を有する小さな創傷では、辺縁細胞が損傷領域の周囲に広がり、隙間は巾着紐収縮で閉じた。組織が脱水状態になったり、損傷しすぎて修復できない場合、細胞の動きが止まったり、細胞のシート全体が破裂したりする可能性があります。大きな傷はいくつかの段階で治癒しました。
縁での収縮、ラメリポディアの形成、およびラメリポディアの伸展に続くエッジの平滑化は、マージンでの集合的な細胞移動、およびマージンから離れたいくつかの細胞層に接触し、大きなギャップを埋めました。核および膜染色は、試薬をECMにマイクロインジェクションすることによって達成されました。サイトカラシンBのマイクロインジェクションは、創傷後のラメリポディア形成を阻害した。
動物を優しく扱います。試薬を注入するときは、マイクロインジェクション針の先端がメソグレアにあり、動物を完全に通過していないことを確認してください。現在、トランスジェニック動物は蛍光タグタンパク質を用いて作製されており、蛍光と示差干渉コントラスト顕微鏡を組み合わせると、上皮創傷治癒における細胞事象のさらに鮮明な画像が得られます。
