Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

Die folgenden Protokolle beschreiben die detaillierte Prozedur für C. elegans Haut zu verletzen und zum Testen von Wundreaktionen. 1. Nadel Verwundung 3,4 <ol><li> Wachsen gesunde unstarved Würmer auf Standard NGM (Nematoden Wachstumsmedium) Platten mit E. coli OP50 Bakterien als Nahrung, in einem 20 ° C Inkubator gehalten. HINWEIS: Methoden für die NGM-Agar-Platten und Routine Anbau von C. elegans kann www.wormbook.org 6. </li><li> Wählen Sie 25 L4-Stadium Würmer zu einer frisch ausgesät Platte 1 Tag vor Verwundung und Kultur bei 20 ° CO / N. </li><li> Vor der Verwundung, ziehen Nadeln aus Kapillaren mit einer Nadel Magnet. Die in Verwundung verwendeten Nadeln identisch mit denen für die Mikroinjektion von C verwendet werden elegans. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Würmer sind bei jungen Erwachsenen Bühne. Die Platte von Würmern auf Eis für ca. 30 min. Kühlung bewirkt, dass die Tiere träge zu sein, erleichtert Nadel Verwundung. <br /&gt; Hinweis: Innerhalb von 5 Minuten von der Entnahme aus dem Eis, werden die Würmer Zeiger sich normal bewegen. Es ist möglich, aber schwierig zu bewegenden Würmern aufgewickelt. Mit der Erfahrung, ist 5 Minuten genügend Zeit, um 25 Würmer gewickelt. Immobilisieren mit Medikamenten wie Levamisol (wie in Laser Verwundung verwendet, siehe unten), auch wenn Tiere wird länger dauern, sich zu erholen. </li><li> Entfernen Sie die Agar-Platte aus dem Eis zu einem Präpariermikroskop Stereomikroskop. Mit einem Pick-Wurm, verschieben 25 Würmer in der Mitte der Agar-Platte. </li><li> Stecken Sie die Nadel in einen 100 ul Pipettenspitze leichter halten Sie die Nadel. Punktion der vorderen oder hinteren Teil des Körpers der Schnecke mit der Nadel, die Vermeidung der Gonaden. Im allgemeinen versuchen, zwischen der hinteren Rachen und vorderen Gonade, oder zwischen dem hinteren Gonade und Rektum gewickelt. Wiederverwendung Nadeln mehrmals, bis sie brechen. HINWEIS: Achten Sie darauf, die Wunden sind kurze, sanfte Stiche, die die Nagelhaut und die Haut durchbohren, durchdringen ~ 5-10 um in das Tier. Die Nadel sollte das anim eingebenal ungefähr in einem rechten Winkel zu der Haut. Die Wunden sollten nicht dazu führen, offensichtlich Schäden an inneren Organen oder unmittelbaren Bruch des Körpers. Beachten Sie eine kleine Menge von Cytoplasma Nässen aus für ein paar Sekunden nach der Wunde; Wenn jedoch Zellinhalt austreten kann über einen längeren Zeitraum die Tiere nicht überleben. Für eine optimale Bildgebung, Wund die seitliche epidermalen Syncytium (hyp7) oder die seitliche Naht. HINWEIS: Dieses Verfahren umfasst die Verwendung einer Glasnadel. </li><li> Lassen Würmer bei RT bei 20 ° C zu erholen, dann Kultur. Beurteilen den Erfolg der Nadel Verwundung von einer Reihe von unten beschriebenen Assays. Mehr als 95% der Wildtyp-Tiere überleben 24 h nach der Nadel zu verletzen im jungen Erwachsenenstadium. Die Wirkung der Verwundung in Larven oder älteren Erwachsenen ist noch nicht umfassend untersucht. </li></ol> 2. Laser Verwundung 3 Verwenden Femtosekunden-Laserstrahlung (800 nm), um genauere Verwundung durchzuführen. <ol><li> Bereiten Agar pAnzeigen auf einem Objektträger mit geschmolzenem 2% Agar 7. Achten Sie darauf, die Pads ähnlich wie die Agar-Pads für die Live-Darstellung von C verwendet werden, elegans. </li><li> Übertragen Sie 10 jungen erwachsenen Würmer auf den Agarose-Pad mit Wurm holen, und fügen Sie ein 2 ul Tropfen 12 mM Levamisol Lösung. Decken Sie die Tiere und die Flüssigkeit mit einem Deckglas. Warten Sie 1-2 Minuten für die Würmer zu lähmen. </li><li> Legen Sie die Objektträger auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Bewegen Sie die Bühne, um die Würmer zu finden und sich auf den seitlichen vorderen oder hinteren Syncytial Epidermis mit einer 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46). </li><li> Stellen Sie die Macht der Femtosekundenlaser bis 140 mW (gemessen vor dem Ziel). Verwenden der Femtosekundenlaser mit einer Wiederholungsrate von 80 MHz. HINWEIS: Zwei Pulse von 200 msec je (von 20 ms getrennt) sind ausreichend für Verwundung in unseren Händen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf der apikalen Oberfläche der epidermalen Zell und Wund die Epidermis. Beachten Sie die örtlichen Störung des Zytoplasma (Blasenbildung), oder lokale Bleich of jeder Fluoreszenzmarker eingesetzt. HINWEIS: Befolgen Sie die entsprechenden Lasersicherheitsverfahren bei der Verwendung des Femtosekundenlaser. Linien- oder Punkt Scans mit Femtosekundenlasern, wie sie in zwei Photonenmikroskope sollte ausreichend Leistung für die Laser Verwundung bereitzustellen. HINWEIS: Während wir keine direkte Erfahrung mit anderen Lasern im Prinzip Verwundung sollte möglich sein, mit konventionellen UV-Laser (wie verwendet in C. elegans Zelle Ablationen). Optional können Sie eine Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Modul auf Spinning-Disk-konfokale um die Epidermis (N. Pujol, persönliche Mitteilung) aufgewickelt. </li></ol> 3. Visualisierung von Epidermal Ca 2+ Responses to Verwundung <ol><li> Verwenden transgenen C. elegans-Stämme, die Ca 2+ Sensoren (wie beispielsweise solche der GCaMP Reihe) in der Epidermis exprimieren, unter der Kontrolle des Erwachsenen epidermalen spezifischen Promotor col-19 (1A; Transgene aufgeführt <strong&gt; Tabelle 1). Verwenden ein Transgen ein rotes Fluoreszenzprotein exprimieren, wie tdTomato als interne Kontrolle für die Transgen-Expressionsniveau. Anmerkung: Wir haben tdTomato als interne Kontrolle für die Expression des Transgens verwendet werden, wie epidermaler tdTomato Fluoreszenz relativ stabil ist und nicht mit GCaMP Abbildungs ​​stören. </li><li> Sowohl Nadel und Laser Verwundung Trigger Ca 2+ Erhebung in der Epidermis. Als Nadel Verwundung nicht ohne weiteres auf einer sich drehenden Scheibe konfokalen geführt werden, ist jedoch Laser Verwundung bevorzugt für die quantitative Analyse des Ca 2+ Antwort (Abbildung 1). </li><li> Erwerben Sie Zeitreihen-Aufnahmen in mehrdimensionalen Erfassungsmodus (Intervallzeit 2 s mit 114 ms Erregungslaserbelichtung) mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen mit 100X Objektiv (NA 1,4 bis 1,46) und geeigneter Filtersätze (GFP Filter für GCaMP3 funktionieren). HINWEIS: Erwerben Sie Zeitraffer-Aufnahmen alle 30 Sekunden für ca. 2 Stunden, um die Ca 2+ bzw. prüfenonse zu verwunden über einen längeren Zeitverlauf. </li><li> Verwendung von Bildanalysesoftware messen die durchschnittliche GCaMP Fluoreszenz in Zehn-Äquivalent Regionen von Interesse (ROI), von denen fünf auf der epidermalen Zellcytosol und fünf im Hintergrund zentriert. </li><li> Erhalten Fluoreszenzbasis (F 0) durch Mitteln Fluoreszenz in 5 ROIs in der Epidermis dann Subtrahieren der Durchschnitt von 5 ROIs im Hintergrund vor Verletzung. Drücken die Fluoreszenzänderung &amp; Dgr; F als Verhältnis der Änderung gegenüber der Basislinie [(F t F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualisierung von F-Actin Dynamics Nach Verwundung <ol><li> HINWEIS: Als Reaktion auf die Nadel Verwundung, beobachten eine Aktin-Ring an der Wundstelle, die nach und schließt sich um die Wunde. Diese Protokollabschnitt Assays Wundverschluss durch Messung der Aktin-Ringdurchmesser. </li><li> Gene transgenen Würmer, die eine F-Aktin-Marker Eil wie Drosophila Moesin Aktin-Bindedomäne fusioniertGFP, exprimiert unter der Kontrolle eines Epidermis-spezifischen Promotor, wie col-19 (2A) (Transgen juIs352). HINWEIS: Wir haben ähnliche Ergebnisse mit anderen Aktin-Bindedomäne Marker wie LifeAct oder F-tractin (unveröffentlichte Ergebnisse) erhalten. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf P col-19-GFP-Moesin transgenen Würmer. Nach Nadel Verwundung, beobachten einen Ring von GFP-Moesin um die Wunde von ca. 5 min. Die Aktin-Ring kleiner im Durchmesser und schließlich schließt 2-3 Stunden nach der Verwundung in Wildtyp-Tiere (Abbildung 2A). </li><li> Bereiten Sie eine 2% Agar-Pad auf einem Glasträger und übertragen 10 Würmer auf das Pad in 2 ul 12 mM Levamisol Lösung. Bild der GFP-Moesin Ringe 1 Stunde nach der Verletzung mit herkömmlichen konfokalen Mikroskopie. HINWEIS: Die Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um z-Stapel (13 x 0,5 um) von Aktin-Ringe 1 Stunde nach der Verletzung zu erwerben. </li><li> Messen Sie die Aktin-Ringdurchmesser nach der Verwundung. Zur Quantifizierung epidermalen GFP-Moesin, zuerst eine maximale Intensität Projektion der Z-Stapel und ziehen 4 Linien-Scans (bei 45 ° zueinander) über die GFP-Moesin Ring. Ringdurchmesser wird als die mittlere Spitze-Spitze-Abstand der vier Zeilenabtastungen (2B) definiert ist. Für Ringe, die bereits geschlossen haben, wird der Durchmesser als 0 &amp; mgr; m definiert. HINWEIS: F-Actin-Ringe sind bequem gemessen 1 h nach der Verwundung, da dies etwa auf halbem Weg durch den Wundverschluss Prozess im Wildtyp. F-Actin-Ringe können auch zu mehreren Zeitpunkten gemessen werden, um einen zeitlichen Verlauf des Wundverschlusses abzuleiten. Zeitraffer-Filme des Wundverschlusses kann mit Levamisol-immobilisiert Würmer und Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie erworben werden. </li></ol> 5. Assay Induktion von Epidermal antimikrobielle Peptide HINWEIS: Verwundung löst auch angeborenen Immunantwort in der C elegans Haut. Transkription von Genen, antimikrobielle Peptide (AMP) kodiert, indin der Epidermis uced. Die NLP-29 (Neuropeptid-like protein) AMP ist stark durch Verwundung 4 induziert. Um zu untersuchen, wie sich die Epidermis steuert AMP Expression nach Verwundung, verwenden transgenen Reporter oder Echtzeit-PCR, einzelne AMP Transkriptniveaus erkennen. <ol><li> Transgene Reporter-Assay für die angeborene Immunantwort zu verwunden 4. </li><li> Führen Nadel Verwundung (wie in Protokoll 1) an erwachsenen Tieren die transgenen Reporter frIs7, die P nlp-29- GFP und P col-12-DsRed als interne Kontrolle enthält auszudrücken. Beachten unverwundete erwachsenen Tieren so dunkel rot oder orange in einer GFP-Langpassfilter. HINWEIS: Verwundung Wildtyp-Würmer P nlp-29 -GFP Expression zu induzieren, jedoch nicht auf P col-12 -dsRed, was zu Würmern, orange, gelb, grün oder unter GFP langen Pass Beleuchtung angezeigt. Der Verlust der Funktion von Genen in der p38 MAPK-Weg, wie Tempel-1 oder NSY-1 blockieren nlp-29 -GFPInduktion nach Verwundung 4. P nlp-29- GFP wird in großen Mengen in Larvenstadien exprimiert </li><li> Führen AMP Induktionsassays in reife junge Tiere. Stellen Sie sicher, dass unverletzten Kontrolltiere haben geringe Mengen an GFP. HINWEIS: P nlp-29- GFP-Expression wird auch durch osmotischen Stress 8 induziert, wobei jedoch auch andere Umwelteinflüsse sein. </li><li> 6 Stunden nach der Verwundung, punkten die Anzahl der Würmer, die P-29 nlp -GFP Induktion (Abbildung 3) 9 mit einem Fluoreszenz Binokular mit GFP Langpassfilter haben. HINWEIS: Bei 1 Stunde nach der Verwundung P nlp-29- GFP sichtbar induziert und erreichte einen Höchststand von 6 Stunden nach der Verwundung und dann bleibt bis zu 24 Stunden nach der Verletzung erhöht. Quantifizieren Ausdruck durch visuelle Scoring 4,9. Alternativ zu quantifizieren Expressionsniveaus mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Wurm Sortierer 4. Für die Schneckensortierer, müssen mindestens 50 Tieren, die verletzt werden. </li><li> Echtzeit-PCR-Assay für quantitating Transkriptniveaus der einzelnen AMP-Gene. Assay Transkriptionsniveaus für mehrere Gene: NLP-29, NLP-30, CNC-1 und CNC-5. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf Wildtyp oder mutierten Würmer (siehe Protokoll 1) </li><li> Sammeln Sie 50 verwundet Würmer und 50 unverwundete Würmer zu den gewünschten Zeiten (zB 3, 6, 24 Stunden) nach der Verwundung. </li><li> Extrahieren RNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Führen Sie die reverse Transkription zu insgesamt 20 ul cDNA erhalten unter Verwendung eines kommerziellen Reverse-Transkriptase-Kit. </li><li> Für die RT-PCR, verwendet 0,2 ul cDNA (1/40) von jeder Probe in Kombination mit einem grünen supermix mit Fluorescein und 0,2 uM Primer. Um RNA-Qualität zu vergleichen, verwenden ama-1 oder snb-1-RT-PCR als Referenz; Vergleichen Sie die relativen Expressionslevel AMP durch die Normalisierung der internen Kontrolle (ama-1 oder snb-1), oder vergleichen fache Induktion nach der Verwundung (AMP Induktion in verwundeten Würmern / unverwundete Würmer) von Normalizing die interne Kontrolle. HINWEIS: CNC-1 und CNC-5 sind caenacin Familie antimikrobielle Peptide, deren Transkription durch Verwundung 10 aktiviert. Typischerweise Nadel Verwundung induziert Ausdruck (~ 500fach für CNC-1) über einen Zeitverlauf von 4 h 10. Primer, die in veröffentlichten Arbeiten sind in Tabelle 2 aufgeführt. </li></ol> 6. Assay Überleben nach der Verwundung <ol><li> HINWEIS: Anschweissen aktiviert mindestens zwei unabhängige Signalwege in der Epidermis: die Ca 2+ abhängige Wundreparaturwegs und der angeborenen Immunantwort Wegs. Beide Wege sind für die vollständige Überlebens steriler Verwundung erforderlich. Um zu testen, ob eine Mutante oder RNAi-Behandlung wirkt Wundheilung, messen Überleben nach 24-48 Stunden nach der Verwundung. Optional können Sie mit herkömmlichen Lebensdauer-Tests, um die Wirkung der Verwundung auf Langlebigkeit 4,9 zu bestimmen. </li><li> Führen Nadel Verwundung auf junge Erwachsene (L4 + 24 h) Schnecken (50 Würmer, wiederholen several mal) folgende Protokoll 1 oben. Pflegen Sie eine entsprechende Anzahl von unverletzten Würmer als Kontrollen. </li><li> Überprüfen Überleben alle 24 h (Transfer verwundet Würmer auf eine neue Agarplatte alle 24 h). Beachten ~ 50% Überlebensrate 24 Stunden nach der Verletzung in Mutanten, die an der Wundheilung defekt sind, wie gtl-2 oder tir-1, bei Normierung auf unverletzten Kontrolltieren. Der Tod wird als ein Mangel der lokomotorischen Reaktion auf durch Schnecken Pick berühren definiert. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

Die Nadel und Laser Verwundung hier dargestellten Verfahren stellen komplementäre Ansätze, um die Fähigkeit des Epidermisepithel um Schäden zu reparieren. Laser Verwundung relativ lokalisierte und (je nach Laserkonfiguration) kann auf die Epidermis beschränkt werden, wobei nadel Verwundung stört die Epidermis, Kutikula und wahrscheinlich interne Basalmembranen. Needle Verwundung kann genauer ähneln Wunden, die durch Krankheitserreger oder mechanische Schäden in der natürlichen Umwelt zugefügt hat. In der Regel...

Wundheilung der Haut Mechanismen der biologischen Grundlagen Interesse und relevant für die menschliche Gesundheit. Wundheilung in Wirbeltieren und Säugetieren umfaßt eine komplexe Reihe von koordinierten Antworten von mehreren Geweben und Signalisierungs 1. Viele einfache genetische Modellorganismen sind auch fähig, Heilung von Hautwunden 2. Es ist daher von Interesse, genetisch manipulierbaren Modelle der Haut die Wundheilung zu untersuchen. Wir und andere haben damit begonnen, Caenorhabditis elegans Verwendung als neues Modell für die Haut Wundheilung 3,4. Ziel dieses Protokolls ist es, eine breitere Gruppe von Forschern, C. nutzen zu können elegans als Werkzeug zur molekularen und zellulären Mechanismen der epidermalen Wundheilung zu untersuchen. Die C. elegans Haut besteht aus der Epidermis (auch als Unterhaut bekannt) und die extrazelluläre Schuppenschicht 5. Die erwachsenen Epidermis ist aus einer kleinen Anzahl von mehrkernigen Syncytien, von denen der größte der Syncytium k gebildetnown als hyp7. Die Epidermis ist ein einfaches Epithel, das die Nagelhaut auf ihrer apikalen Oberfläche absondert. Die Haut kann aktiv gegen die Haut eindringenden Krankheitserreger zu verteidigen und zu reparieren kleine Wunden 4. Wundreparatur des C. elegans Haut ist robust, da fast alle Wildtyp-Tiere überleben können kleine Stichverletzungen durch Nadeln oder lokale Hautschäden durch Laserbestrahlung verursacht überleben. C. elegans Haut Verwundung löst eine Reihe von Reaktionen, einschließlich einer epidermalen angeborenen Immunantwort, Wundverschluss und die Narbenbildung 4. Die erwachsenen Epidermis ist postmitotischen und Wundheilung umfasst lokale Zellreaktionen im Gegensatz zu epidermalen Proliferation oder Zellmigration. Wir haben gezeigt, dass Haut Verwundung löst einen starken und nachhaltigen Anstieg der epidermalen Ca 2+, erfordern die Membran TRPM Kanal GTL-2 und der internen Ca 2+ Geschäfte 3. Für Bildung und Schließung von F-Actin Ringe an der wo ist der epidermale Ca 2+ Signal erforderlichund Ort. Verwundung induziert auch angeborene Immunantworten, die die Transkription AMPs wie NLP-29 zu aktivieren. Die Verwundung induzierten Transkription AMPs ist abhängig von einer TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-Kinase-Kaskade wirkt sich autonom in der Epidermis 4. Defekte entweder in der Ca 2+ Signalweg oder in der angeborenen Immunantwort zu niedrigeren Überleben nach der Verwundung führen. Der relativ einfache Aufbau der C. elegans Epidermis, seine genetische Lenkbarkeit und Vorteile für die in-vivo-Bildgebung machen es ein ausgezeichnetes System, um mehrere Aspekte der Wundheilung zu untersuchen. Hier präsentieren wir Protokolle für die beiden häufigsten Methoden der Verwundung: needle Verwundung und Laser Verwundung. Needle Verwundung erfordert keine spezielle Ausrüstung (mit Ausnahme der Nadel puller) und mit der Erfahrung kann auf Hunderte von Würmern pro Tag durchgeführt werden. Needle Verwundung auf Tiere wachsen auf Agar-Platten durchgeführt. Im Gegensatz dazu wird die Laser Verwundung auf anes geführtthetized Tieren montiert auf Agar-Pads unter einem Deckglas, und ist für die Live-Darstellung der zellulären Reaktionen auf Schäden geeignet.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

Die C. elegans Epidermis und Cuticula bilden eine einfache, aber anspruchsvolle Hautschicht, die lokalisierte Schäden durch Verwundung was zu reparieren. Untersuchungen der Wunde Antworten und Reparatur in diesem Modell haben unser Verständnis des Zytoskeletts und genomische Reaktionen auf Gewebeschäden beleuchtet. Die beiden am häufigsten verwendeten Verfahren, um die C gewickelt elegans erwachsenen Haut sticht mit Mikroinjektionsnadeln und lokale Laserbestrahlung. Nadel lokal Verwundung stört die Kutikula, Epidermis und der extrazellulären Matrix assoziiert und können auch innere Gewebe beschädigen. Laserbestrahlung führt zu mehr lokalisiert Schaden. Verwundung löst eine Reihe von leicht getestet Antworten einschließlich erhöhter epidermaler Ca 2+ (Sekunden-min), die Bildung und die Sperrung eines aktinhaltigen Ring an der Wundstelle (1-2 h), erhöhte Transkription des antimikrobiellen Peptids Gene (2-24 h) und die Narbenbildung. Im Wesentlichen alle erwachsenen Tiere Wildtyp überleben Verwundung, woMutanten in der Wundheilung oder andere Reaktionen defekt zeigen verringerte Überleben. Detaillierte Protokolle für die Nadel und Laser Verwundung und Assays zur Quantifizierung und Visualisierung von Wundantworten und Reparaturprozesse (Ca Dynamik Aktindynamik, antimikrobielles Peptid Induktion und Überlebensrate) dargestellt.

Laser oder Nadel Verwundung wird eine schnelle und anhaltende Erhöhung der epidermalen Ca Ebenen auslösen wie bei Ca Sensoren wie GCaMPs (Abbildung 1) visualisiert. Das Ca Höhen tritt innerhalb von Sekunden und erhöht bleibt für zehn Minuten. Nadel Verwundung reproduzierbar resultiert in der Bildung von F-Actin-Ringe an Wundstellen (Figur 2); erscheinen diese innerhalb von Minuten, und nach und nach in der Nähe über 1-2 Stunden nach der Verwundung. Aktin-Ringe weniger oft nach ge...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K Aufrufe.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Serie: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Forschung

Neurowissenschaften

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Mikroinjektion Wound Assay und<em&gt; In-vivo-</em&gt; Lokalisierung von Epidermal Wundreaktion Reporter in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Biotechnik

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Verhalten

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Eine Vorrichtung zur Durchführung Zellmigration / Wundheilung in einer 96-Well-Platte

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Entwicklungsbiologie

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Ein Drosophila-Modell zur Untersuchung der Wund-induzierten Polyploidisierung

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Verwendung von einem Mikrofluidik-Gerät für mechanische Stimulation und High Resolution Imaging von C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Immunologie und Infektion

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Scratch Migration Assay und Dorsal Skinfold Kammer für In Vitro und In Vivo Analyse der Wundheilung

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Medizin

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Ein Anoxia-Hunger-Modell für Ischämie / Reperfusion in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Biologie

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Verfahren zur Haut Verwundung und Assays für Wound Antworten in

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