Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

I seguenti protocolli descrivono la procedura dettagliata per C. pelle elegans ferendo e per saggiare le risposte ferite. 1. Ago Ferimento 3,4 <ol><li> Crescere vermi unstarved sani sullo standard NGM (terreno di crescita nematode) piatti con E. batteri coli OP50 come cibo, mantenute in un incubatore a 20 °. NOTA: I metodi per piastre di agar NGM e la coltivazione di routine di C. elegans può essere trovato alla www.wormbook.org 6. </li><li> Scegli 25 L4 vermi stadio ad un appena seminato piatto 1 giorno prima ferendo e cultura a 20 ° CO / N. </li><li> Prima di ferimento, tirare aghi da capillari con un estrattore ago. Gli aghi utilizzati in ferimento sono identici a quelli utilizzati per microiniezione di C. elegans. </li><li> Assicurarsi che tutti i vermi sono al giovane stadio adulto. Posizionare la piastra di vermi su ghiaccio per circa 30 min. Raffreddamento induce gli animali ad essere lenta, facilitando ago ferimento. <br /&gt; NOTA: Entro 5 minuti di allontanamento dal ghiaccio, i vermi inizierà a muoversi normalmente. E &#39;possibile, ma difficile da ferire vermi in movimento. Con l&#39;esperienza, 5 min è abbastanza tempo per ferire 25 vermi. Immobilizzarlo con farmaci come levamisolo (utilizzati in ferimento laser, vedi sotto), anche se gli animali ci vorrà più tempo per recuperare. </li><li> Rimuovere la piastra di agar dal ghiaccio di uno stereomicroscopio dissezione. Utilizzando un pick verme, spostare 25 vermi nel centro della piastra di agar. </li><li> Posizionare l&#39;ago in un puntale 100 microlitri di tenere più facilmente l&#39;ago. Perforare la parte anteriore o posteriore del corpo della vite senza fine con l&#39;ago, evitando gonade. In generale, tentare di ferire tra posteriore e anteriore della faringe gonadi, o tra gonade posteriore e il retto. Riutilizzo aghi molte volte, fino a quando non si rompono. NOTA: Assicurarsi che le ferite sono brevi, punture dolci che forare la cuticola e la pelle, penetrando ~ 5-10 micron nell&#39;animale. L&#39;ago deve entrare nel animal di circa un angolo retto rispetto alla pelle. Le ferite non devono causare danni evidenti agli organi interni, o rottura immediata del corpo. Osservare una piccola quantità di citoplasma trasudano per alcuni secondi dopo la ferita; Tuttavia, se i contenuti cellulari fuoriuscire per un periodo prolungato gli animali non sopravviverà. Per l&#39;imaging ottimale, ferita la syncytium laterale epidermico (hyp7) o la cucitura laterale. NOTA: Questo procedimento comprende l&#39;uso di un ago di vetro. </li><li> Consentire worm di recuperare a RT poi cultura a 20 ° C. Giudicare il successo di ago ferita da un certo numero di saggi descritti di seguito. Superiore al 95% del tipo di animali selvatici a sopravvivere 24 ore dopo l&#39;ago ferito nella fase adulta giovane. L&#39;effetto di ferire in larve o anziani non è ancora stato ampiamente analizzato. </li></ol> 2. Laser Ferimento 3 Utilizzare irraggiamento laser a femtosecondi (800 nm) per eseguire ferite più precise. <ol><li> Preparare agar pannunci su un vetrino con il fuso 2% agar 7. Assicurarsi che le pastiglie sono simili ai pad agar utilizzati per l&#39;imaging in tempo reale di C. elegans. </li><li> Trasferire 10 giovani vermi adulti sul pad agarosio con vite senza fine ritiro, e aggiungere una goccia 2 ml di soluzione di 12 Levamisolo mm. Coprire gli animali e il liquido con un vetrino. Attendere 1-2 minuti per il worm per paralizzare. </li><li> Posizionare il vetrino su un microscopio confocale spinning disk. Spostare lo stadio per trovare i vermi e concentrarsi sulle anteriore o posteriore sinciziale epidermide laterali con un obiettivo 100X (NA 1,4-1,46). </li><li> Impostare la potenza del laser a femtosecondi a 140 mW (misurata prima l&#39;obiettivo). Utilizzare il laser a femtosecondi ad una frequenza di ripetizione di 80 MHz. NOTA: due impulsi di 200 msec ciascuno (separati da 20 msec) sono sufficienti per il ferimento nelle nostre mani. </li><li> Concentrarsi sulla superficie apicale della cellula epidermica e ferita l&#39;epidermide. Osservare interruzione locale del citoplasma (bubbling), o sbiancamento locale of qualsiasi marcatore fluorescente usato. NOTA: Seguire le opportune procedure di sicurezza del laser quando si utilizza il laser a femtosecondi. Linea o punto di scansione con laser a femtosecondi, come quelli di due microscopi fotoni devono fornire potenza sufficiente per ferimento laser. NOTA: Anche se non abbiamo esperienza diretta di utilizzo di altri laser, in linea di principio ferimento dovrebbe essere possibile mediante laser UV convenzionali (come usato in C. elegans ablazioni cellulari). Facoltativamente, utilizzare un FRAP modulo (FRAP) sul disco rotante confocale per ferire l&#39;epidermide (N. Pujol, comunicazione personale). </li></ol> 3. Visualizzazione di Epidermal Ca 2+ Risposte ad Ferimento <ol><li> Utilizzare transgenico C. elegans ceppi che esprimono Ca 2+ sensori (come quelli della serie GCaMP) nell&#39;epidermide, sotto il controllo del promotore specifico epidermica adulto col-19 (Figura 1A; transgeni sono elencati <strong&gt; Tabella 1). Utilizzare un transgene che esprime una proteina fluorescente rossa come tdTomato come controllo interno per il livello di espressione del transgene. NOTA: Abbiamo usato tdTomato come controllo interno per l&#39;espressione del transgene come epidermica tdTomato fluorescenza è relativamente stabile e non interferisce con le immagini GCaMP. </li><li> Sia ago e laser ferendone grilletto Ca 2+ elevazione nell&#39;epidermide. Tuttavia, poiché l&#39;ago ferimento non può essere facilmente eseguita su un disco confocale filatura, ferimento laser è preferibile per l&#39;analisi quantitativa del Ca 2+ risposta (Figura 1). </li><li> Acquisire le immagini lasso di tempo in modalità di acquisizione multidimensionale (intervallo di 2 secondi con 114 msec esposizione laser eccitazione) utilizzando un confocale spinning disk con obiettivo 100X (NA 1,4-1,46) e appositi set di filtri (filtri GFP lavorerà per GCaMP3). NOTA: Acquisire immagini time-lapse ogni 30 sec per circa 2 ore per esaminare il Ca 2+ respOnse a ferendone più di un corso di tempo più lungo. </li><li> Utilizzando il software di analisi di immagine misurare la fluorescenza media GCaMP in dieci regioni equivalenti di interesse (ROI), cinque delle quali sono centrate sul citoplasma delle cellule epidermiche e cinque in background. </li><li> Ottenere fluorescenza basale (F 0) calcolando la media di fluorescenza in 5 ROI nell&#39;epidermide poi sottraendo la media di 5 ROI in background prima della ferita. Esprimere la variazione di fluorescenza Af come il rapporto di variazione rispetto alla linea di base [(F t -F 0) / F 0]. </li></ol> 4. Visualizzazione di Dynamics F-actina dopo aver ferito <ol><li> NOTA: In risposta a spillo ferite, osservare un anello di actina nel sito della ferita che chiude progressivamente intorno alla ferita. Questa sezione protocollo saggi avvolti chiusura misurando il diametro dell&#39;anello actina. </li><li> Generare vermi transgenici che esprimono un indicatore F-actina come il moesina actina dominio Drosophila legame fusoGFP, espresse sotto il controllo di un promotore specifico epidermica come col-19 (Figura 2A) (transgene juIs352). NOTA: Abbiamo ottenuto risultati simili utilizzando altre vincolante marcatori dominio come Lifeact o F-tractin (risultati non pubblicati) actina. </li><li> Eseguire ago ferendo on P col-19- GFP-moesina vermi transgenici. Dopo ago ferimento, osservare un anello di GFP-moesin intorno al sito della ferita da ~ 5 min. L&#39;anello actina diventa più piccolo diametro e alla fine chiude 2-3 ore dopo il ferimento in animali wild type (Figura 2a). </li><li> Preparare un tampone agar 2% su un vetrino e trasferire 10 vermi sul pad in 2 soluzione ul 12 Levamisolo mm. Immagine gli anelli GFP-moesina 1 ora dopo il ferimento usando la microscopia confocale convenzionali. NOTA: Utilizzare la microscopia confocale di acquisire z-stack (13 x 0,5 micron) di anelli di actina 1 ora dopo il ferimento. </li><li> Misurare il diametro degli anelli actina dopo il ferimento. Per quantificare epidermica GFP-moesin, prima fare una proiezione di massima intensità del z-stack e quindi disegnare 4 scansioni di linea (a 45 ° tra loro) oltre l&#39;anello GFP-moesin. Diametro dell&#39;anello è definito come il picco medio della distanza di picco dei quattro scansioni linea (Figura 2B). Per gli anelli che sono già chiuse, il diametro è definito come 0 micron. NOTA: F-actina anelli sono convenientemente misurate 1 ora dopo il ferimento in quanto questo è a circa metà strada attraverso il processo di chiusura della ferita nel tipo selvatico. Anelli F-actina possono essere misurate in più punti di tempo per ricavare un corso a tempo di chiusura della ferita. Tempo lapse film di chiusura della ferita possono essere acquisiti tramite worm levamisolo-immobilizzato e spinning disk microscopia confocale. </li></ol> 5. Assay induzione di epidermico antimicrobici Peptidi NOTA: Ferimento innesca anche le risposte immunitarie innate in C. pelle elegans. Trascrizione di geni che codificano peptidi antimicrobici (AMP) è induced nell&#39;epidermide. NLP-29 (proteina neuropeptide-like) AMP è fortemente indotta da ferendo 4. Per saggiare quanto l&#39;epidermide controlla l&#39;espressione AMP dopo ferimento, usare i giornalisti transgenici o real-time PCR per rilevare i singoli livelli di trascrizione AMP. <ol><li> Transgenici test giornalista per la risposta immunitaria innata ferendo 4. </li><li> Eseguire ago ferimento (come nel protocollo 1) su animali adulti che esprimono il reporter transgenico frIs7, che contiene P nlp-29- GFP e P col-12- DsRed come controllo interno. Osservare gli animali adulti illesi rosso scuro o arancione in un filtro passaggio lungo GFP. NOTA: Ferita wild-type vermi indurre P nlp-29-GFP espressione, ma non influirà P col-12 -dsRed, con conseguente vermi che appaiono di colore arancione, giallo o verde sotto GFP passaggio lungo l&#39;illuminazione. La perdita della funzione dei geni nel pathway p38 MAPK, come PMK-1 o NSY-1 sarà bloccare nlp-29-GFPinduzione dopo ferendo 4. GFP P nlp-29- è espressa ad alti livelli in stadi larvali </li><li> Effettuare test di induzione AMP in giovani animali adulti. Assicurarsi che gli animali di controllo illesi hanno bassi livelli di GFP. NOTA: P nlp-29- espressione GFP è anche indotta da stress osmotico 8, e può essere sensibile ad altri stress ambientali. </li><li> 6 ore dopo il ferimento, segnare il numero di worm che hanno P nlp-29-GFP induzione (Figura 3) 9 con una fluorescenza dissezione portata con GFP filtro passa lungo. NOTA: A 1 ora post-ferimento P nlp-29- GFP è visibilmente indotto, raggiungendo un picco di circa 6 ore post-ferimento e poi rimanendo elevata fino a 24 ore dopo il ferimento. Quantificare l&#39;espressione del 4,9 punteggio visivo. In alternativa, quantificare i livelli di espressione con una fluorescenza attivato verme sorter 4. Per il sorter verme, almeno 50 animali hanno bisogno di essere feriti. </li><li> Real-time PCR per quantitating livelli di trascrizione dei singoli geni AMP. Livelli di trascrizione del dosaggio di diversi geni: nlp-29, nlp-30, cnc-1, e cnc-5. </li><li> Eseguire ago ferendo on wild-type o vermi mutanti (vedi protocollo 1) </li><li> Raccogliere 50 vermi feriti e 50 illesi vermi nei momenti desiderati (ad esempio, 3, 6, 24 ore) post-ferimento. </li><li> Estratto di RNA utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa per ottenere totale cDNA 20 microlitri utilizzando un kit trascrittasi inversa commerciale. </li><li> Per RT-PCR, utilizzare 0,2 microlitri cDNA (1/40) di ciascun campione in combinazione con un supermix verde con fluoresceina e 0,2 mM primers. Per confrontare la qualità RNA, utilizzare ama-1 o SNB-1 RT-PCR come riferimento; confrontare il livello di espressione relativa AMP normalizzando di controllo interno (AMA-1 o SNB-1), o confrontare induzione volte post-ferimento (induzione AMP in worms feriti / worm illesi) di normaalizing di controllo interno. NOTA: cnc-1 e cnc-5 sono caenacin famiglia peptidi antimicrobici la cui trascrizione è attivata da ferendone 10. In genere, l&#39;ago ferimento induce l&#39;espressione (~ 500 volte per cnc-1) per un corso tempo di 4 ore 10. Primers utilizzati nel lavoro pubblicato sono elencati nella Tabella 2. </li></ol> 6. Tenore di sopravvivenza dopo aver ferito <ol><li> NOTA: Ferimento attiva almeno due vie di segnalazione indipendenti nell&#39;epidermide: Ca 2+ ferita dipendente riparazione percorso e l&#39;innata percorso risposta immunitaria. Entrambi i percorsi sono necessari per la piena sopravvivenza del ferimento sterile. Per verificare se un mutante o un trattamento RNAi colpisce la guarigione della ferita, misurare la sopravvivenza a 24-48 ore dopo il ferimento. Facoltativamente, utilizzare test di durata della vita convenzionale per determinare l&#39;effetto di ferire sulla longevità 4,9. </li><li> Eseguire ago ferendo il giovane adulto (L4 + 24 ore) vermi (50 vermi, ripetere sevevolte RAL) seguenti sopra protocollo 1. Mantenere un numero equivalente di vermi illesi come controlli. </li><li> Controllare la sopravvivenza ogni 24 ore (trasferimento vermi feriti ad una nuova piastra di agar ogni 24 ore). Osservare ~ 50% di sopravvivenza 24 ore dopo il ferimento in mutanti che sono difettosi nella riparazione delle ferite, come GTL-2 o tir-1, quando normalizzata per animali di controllo illesi. La morte è definito come una mancanza di risposta locomotoria toccare con vite senza fine ritiro. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

I metodi qui presentati per ago e ferimento laser offrono approcci complementari di valutazione della capacità dell&#39;epitelio epidermica per riparare i danni. Ferimento laser è relativamente localizzato e (a seconda della configurazione laser) può essere limitato l&#39;epidermide, mentre ferimento ago sconvolge l&#39;epidermide, cuticola, e probabilmente membrane basali interni. Ago ferimento può assomigliare più accuratamente le ferite inflitte da agenti patogeni o danni meccanici in ambiente naturale. Come reg...

Pelle ferita meccanismi di guarigione sono di interesse biologico di base e rilevanti per la salute umana. La guarigione delle ferite nei vertebrati e mammiferi comprende una complessa serie di risposte coordinate di diversi tessuti e di segnalazione 1. Molti semplici organismi modello genetico sono anche in grado di guarire le ferite della pelle 2. È quindi interessante analizzare modelli geneticamente trattabili di riparazione delle ferite della pelle. Noi e altri abbiamo iniziato a utilizzare Caenorhabditis elegans come nuovo modello per la pelle ferita guarigione 3,4. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di consentire una più ampia serie di ricercatori da utilizzare C. elegans come strumento per indagare i meccanismi molecolari e cellulari della epidermica guarigione delle ferite. Il C. pelle elegans comprende l&#39;epidermide (noto anche come ipoderma) e la cuticola extracellulare 5. L&#39;epidermide adulto è formato da un piccolo numero di sincizi multinucleate, di cui il più grande è il sincizio known come hyp7. L&#39;epidermide è un epitelio semplice che secerne cuticola sulla sua superficie apicale. La pelle può difendere attivamente contro gli agenti patogeni-pelle penetrante e riparare piccole ferite 4. Riparazione della ferita del C. pelle elegans è robusto, come quasi tutti i tipi di animali selvatici sopravvivono possono sopravvivere piccole punture provocate da aghi, o danni alla pelle locale causati da irraggiamento laser. C. elegans pelle ferimento innesca una serie di reazioni, tra cui una risposta epidermica innata immunitaria, la chiusura della ferita, e la formazione di cicatrici 4. L&#39;epidermide adulti è post-mitotico, e la guarigione delle ferite comporta risposte cellulari locali in contrasto con la proliferazione epidermica o la migrazione delle cellule. Abbiamo dimostrato che il ferimento pelle innesca un grande e costante aumento in epidermica Ca 2+, che richiede il canale di membrana TRPM GTL-2 e interni di Ca 2+ negozi 3. Il segnale è richiesto epidermica Ca 2+ per la formazione e la chiusura di anelli F-actina al wound sito. Ferimento induce anche le risposte immunitarie innate che attivano la trascrizione di AMP, come la PNL-29. La trascrizione ferimento indotto di AMP è dipendente da un TIR-1 / PMK-1 p38 MAP chinasi cascade agire autonomamente nell&#39;epidermide 4. Difetti in entrambi la segnalazione via Ca 2+ o nella risposta immunitaria innata porterà alla sopravvivenza inferiore post-ferimento. La struttura relativamente semplice del C. elegans epidermide, la sua trattabilità genetica e vantaggi per imaging in vivo ne fanno un sistema eccellente per studiare i molteplici aspetti di riparazione delle ferite. Qui vi presentiamo i protocolli per i due metodi comuni di ferimento: ferimento ago e ferimento laser. Ferimento dell&#39;ago non richiede attrezzature specializzate (diverso estrattore ago), e con esperienza può essere eseguita su centinaia di vermi al giorno. Ferimento ago viene eseguita su animali in crescita su piastre di agar. Al contrario, ferimento laser viene eseguita su anesanimali thetized montati su agar pad sotto un coprioggetto, ed è adatto per l&#39;imaging dal vivo delle risposte cellulari al danno.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510-8</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Petri plate</td><td>Tritech Research</td><td>T3308</td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L9756</td><td>12 mM</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller</td><td>Sutter Instrument&amp;nbsp;</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Worm pick (platinum wire)</td><td>Tritech Research</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>M9 solution</td><td>Home-made</td><td></td><td>3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>Use 500 ml for 50 worms</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green</td><td>Bio-Rad</td><td>1708882</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>Bio-Rad</td><td>C1000/CFX96</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR tubes</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Molecular Devices</td><td>Metamorph</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

Il C. elegans epidermide e cuticola formano uno strato di pelle ma sofisticato semplice che può riparare i danni localizzati derivanti da ferire. Studi di risposte ferita e riparazione di questo modello hanno illuminato la nostra comprensione del citoscheletro e risposte genomiche per danni ai tessuti. I due metodi più comunemente usati per la ferita C. elegans pelle adulta sono punture con aghi microiniezione e irraggiamento laser locale. Ago ferendo localmente interrompe la cuticola, epidermide, e matrice extracellulare associati, e può anche danneggiare i tessuti interni. Risultati irradiazione laser a danni più localizzato. Ferimento innesca una serie di reazioni prontamente analizzati, tra cui elevata epidermica Ca 2+ (secondi minuti), la formazione e la chiusura di un anello-actina contenenti presso il sito della ferita (1-2 ore), elevata la trascrizione di geni peptidi antimicrobici (2-24 hr), e formazione di cicatrici. In sostanza tutti gli animali adulti wild type sopravvivono ferimento, dovecome mutanti difettose nella riparazione delle ferite o altre risposte mostrano ridotta sopravvivenza. Vengono presentati i protocolli dettagliati per ago e il ferimento laser, e saggi per la quantificazione e la visualizzazione delle risposte della ferita e dei processi di riparazione (dinamica Ca, dinamiche actina, induzione peptide antimicrobico, e la sopravvivenza).

Laser o ago ferimento attiveranno elevazione rapida e sostenuta in epidermiche livelli di Ca, come visualizzato con sensori Ca quali GCaMPs (Figura 1). L&#39;elevazione Ca avviene in pochi secondi, e rimane elevata per decine di minuti. Needle ferendo riproducibile provoca la formazione di anelli F-actina in siti ferita (Figura 2); queste appaiono in pochi minuti, e gradualmente vicino oltre 1-2 ore dopo il ferimento. Anelli actina sono meno spesso si formano dopo più preciso ferimento...

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Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.3K Views.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

Video: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In vivo Laser assotomia in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Ricerca

Neuroscienze

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

Microiniezione Wound Assay e<em&gt; In vivo</em&gt; Localizzazione di Epidermal Wound risposta Giornalisti a<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Bioingegneria

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

Un dispositivo per realizzare la migrazione delle cellule / Wound Healing in una piastra a 96 pozzetti

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Biologia dello sviluppo

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it contains more than the diploid copy of its chromosomes, which is a result of endoreplication or cell fusion. In tissue repair, wound-induced polyploidization (WIP) has been found to be a conserved healing strategy from fruit flies to vertebrates. WIP has several advantages over cell proliferation, including resistance to oncogenic growth and genotoxic stress. The challenge has been to identify why polyploid cells arise and how these unique cells function. Provided is a detailed protocol to study WIP in the adult fruit fly epithelium where polyploid cells are generated within 2 days after a puncture wound. Taking advantage of D. melanogaster&#39;s extensive genetic tool kit, the genes required to initiate and regulate WIP, including Myc, have begun to be identified. Continued studies using this method can reveal how other genetic and physiological variables including sex, diet, and age regulate and influence WIP&#39;s function.

A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization

Wound-induced polyploidization is a conserved tissue repair strategy where cells grow in size instead of dividing to compensate for cell loss. Here is a detailed protocol on how to use the fruit fly as a model to measure ploidy and its genetic regulation in epithelial wound repair.

Un modello di Drosophila per studiare la poliploidizzazione indotta dalle ferite

Polyploidy is a frequent phenomenon whose impact on organismal health and disease is still poorly understood. A cell is defined as polyploid if it ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

Immunologia e infezioni

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Medicina

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Un modello di anossia-fame per ischemia / riperfusione in<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Biologia

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while protecting them from infection. Therefore, it is not surprising that the ability to repair epithelial wounds is critical to all metazoans. Epithelial wound healing in vertebrates involves overlapping processes, including inflammatory responses, vascularization, and re-epithelialization. Regulation of these processes involves complex interactions between epithelial cells, neighboring cells, and the extracellular matrix (ECM); the ECM contains structural proteins, regulatory proteins, and active small molecules. This complexity, together with the fact that most animals have opaque tissues and inaccessible ECMs, makes wound healing difficult to study in live animals. Much work on epithelial wound healing is therefore performed in tissue culture systems, with a single epithelial cell-type plated as a monolayer on an artificial matrix. Clytia hemisphaerica (Clytia) provides a unique and exciting complement to these studies, allowing epithelial wound healing to be studied in an intact animal with an authentic ECM. The ectodermal epithelium of Clytia is a single layer of large squamous epithelial cells, allowing high-resolution imaging using differential interfering contrast (DIC) microscopy in living animals. The absence of migratory fibroblasts, vasculature, or inflammatory responses makes it possible to dissect the critical events in re-epithelialization in vivo. The healing of various types of wounds can be analyzed, including single-cell microwounds, small and large epithelial wounds, and wounds that damage the basement membrane. Lamellipodia formation, purse string contraction, cell stretching, and collective cell migration can all be observed in this system. Furthermore, pharmacological agents can be introduced via the ECM to modify cell:ECM interactions and cellular processes in vivo. This work shows methods for creating wounds in live Clytia, capturing movies of healing, and probing healing mechanisms by microinjecting reagents into the ECM.

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

This paper describes a method to create wounds in the epithelium of a live Clytia hemisphaerica medusa and image wound healing at a high resolution in vivo. Additionally, a technique to introduce dyes and drugs to perturb signaling processes in the epithelial cells and extracellular matrix during wound healing is presented.

Metodi per la pelle Ferimento e saggi per risposte ferita

Riepilogo

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