このプロトコルは、パーキンソン病で失われるドーパミン作動性ニューロンのカルシウムフラックスを定量化します。これは、異常なカルシウムがパーキンソン病でドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こす方法を理解するのに役立ちます.初めて、培養された一次中脳ニューロンにおける自発的なカルシウムフラックスを実証する。
この方法は、カルシウム媒介アポトーシスに関与する特定の受容体寄与を解剖するために使用することができる。我々の方法は、パーキンソン病のための特定の、効果的な神経保護化合物を発見するための高含有薬物スクリーンのための道を提供する。これらの神経保護化合物はドーパミン作動性ニューロンのカルシウム媒介アポトーシスを防ぐだろう.
まず、1皿あたり1マイクロリットルのhSyn-GCaMP6f AAVで無血清DMEM培地を1ミリリットル調製します。各皿から細胞培養培地を吸引し、hSyn-GCaMP6fで調製したDMEMの1ミリリットルに交換する。37°Cのインキュベーターに1時間戻します。
インキュベーション後、培地をAAVで吸引し、3ミリリットルの細胞培養培地に交換する。5~7日間、摂氏37度でインキュベートします。ウイルス感染のこの期間を通じて2〜3日ごとに培地を変更する。
HEPES記録バッファーの1リットル、20マイクロモルグルタミン酸記録バッファーの200ミリリットル、および原稿の方向に従って10マイクロモルNBQX記録バッファの200ミリリットルを調製する。滅菌35ミリメートルペトリ皿を3ミリリットルの記録バッファで満たします。インキュベーターから感染した培養物とペトリ皿を取り、慎重に細かい先端鉗子で1カバースリップの端をつかみ、記録バッファで皿に移します。
残りのカバースリップを培地に入れて摂氏37度のインキュベーターに戻し、録音バッファーで皿を共焦点顕微鏡に運びます。イメージング ソフトウェアを起動します。初期化中に、蠕動ポンプを起動し、記録バッファにラインを入れます。
その後、毎分2ミリリットルに流れを較正します。感染したカバースリップをペトリ皿から細かい鉗子で記録浴に移します。10X水浸しの目的と明視野光を使用して、焦点の平面を見つけ、ニューロン細胞体の高密度の領域を探し、40Xの目的に切り替えてサンプルを再び焦点を合わせます。
[色素]リストウィンドウで、AlexaFluor 488を選択して適用します。蛍光色素の露出過多や写真の漂白を防ぐために、低HVとレーザーパワー設定から始めます。AlexaFluor 488チャンネルの場合は、HVを500に、ゲインを1xに、オフセットをゼロに設定します。
488 レーザーラインの電力を 5% に設定します。ピンホールサイズを300マイクロメートルに増やし、フォーカスx2スキャンオプションを使用して、発光信号を亜飽和レベルに最適に調整します。各チャンネルの最適な表示に合わせて設定を調整できます。
顕微鏡の設定が最適化されたら、ステージを移動して、蛍光GCaMP6fの自発的な変化を示す複数の細胞を有する領域を見つけ、イメージング用の目的の平面に焦点を当てます。クリップ rect ツールを使用して、1 秒弱のフレーム間隔を達成できるサイズにイメージング フレームをクリップします。間隔ウィンドウの値を 1.0 に設定し、Num ウィンドウを 600 に設定します。
t シリーズ ムービーをキャプチャするには、[時間] オプションを選択し、[Xyt スキャン] オプションを使用してイメージングを開始します。イメージング進捗バーを見て、HEPES記録バッファから適切な時点で20マイクロモルグルタミン酸記録バッファにラインを移動します。イメージングが完了したら、シリーズ完了ボタンを選択し、完成したtシリーズムービーを保存します。
ニューロンの培養物が合計10分間グルタミン酸にさらされるように、さらに5分間グルタミン酸を浸透し続けます。画像を作成するカバースリップごとにこの手順を繰り返します。実験直後にカルシウムの痕跡や神経細胞の体を見ることは可能です。
楕円ツールを使用して、神経細胞のソーマの周囲に所望の数の ROI を描画します。また、[系列分析] ボタンを使用してトレースを視覚化します。グルタミン酸への追加の5分間の露出の後、細かい鉗子で浴室からカバースリップを取り除き、すべてのイメージ投射が完了するまで記録バッファとペトリ皿に戻します。
イメージングの日に、VM培養物をグルタミン酸またはグルタミン酸とNBQXの組み合わせで処理した。両方の条件において、GCaMP6fの蛍光の不均一および自発的変化が観察され、自発的なカルシウムフラックスを示す。グルタミン酸の適用は、自発的に活動的なニューロンと静止したニューロンの両方で堅牢で持続的なカルシウム応答を生成した。
NBQXの適用は、自発的な活動を減少させ、グルタミン酸応答を部分的に遮断した。グルタミン酸塗布が各条件でカルシウム応答を刺激した程度を、曲線下の領域、ピーク振幅、および遅延を利用して定量化した。応答に対する遅延は、NBQXおよびグルタミン酸状態下で増加した。
グルタミン酸媒介アポトーシスを測定するために、細胞を固定し、抗カスパーゼ-3抗体で染色した。平均カスパーゼ-3強度は、未治療の対照と比較して、両方の治療条件で有意に高かった。興奮した毒性細胞死のより徹底的な分析は、免疫染色体チロシンヒドロキシラーゼのコントロールおよびグルタミン酸処理状態における陽性ドーパミン作動性ニューロンの数を数えることによって行うことができる。
この技術は、ドーパミン作動性ニューロンにおけるカルシウム媒介アポトーシスに関与する異なる受容体および鉄チャネルの相対的な寄与を理解する道を開いた。
