私たちは、イラストHyewonクーパーに感謝します。

1。解剖このプロトコルを通して使用さゴキブリ食塩溶液は以下の組成を有する。 ゴキブリ食塩水36：（100ml 100ml用のグラム） 210のNaCl（1.227グラム） 2.9のKCl（0.0216グラム） 1.8のCaCl 2（0.0265グラム） 0.2のNaH 2 PO 4•2H 2 O（0.0032グラム） 1.8のNa 2 HPO 4•7H 2 O（0.0483グラム） （pHは7.2。1 M NaOHまたは1M HClでpHを調整する）。 <ol><li>堅牢cercusの複数形（ 図1）があり、貯蔵タンクの男性ゴキブリを選択します。男性は解剖が容易であり、かつ全く卵巣と卵の塊を含まない、男の最後のセグメントは、女性に比べて狭い。 Pの男性アメリカーナは cercusの複数形の間の短いスタイラスのペアを持っている。これらのスタイラスは、女性では観察されない。 </li><li>翼、足と頭を切り落とし、Diと体、腹側を上にして、ピンSHシリコーンエラストマーが並ぶ。 </li><li>鉗子で腹側のプレートをピックアップし、細かいハサミでそれらを切断し、後端から始まり、前方に取り組んでいます。 cercusの複数形の乾燥を維持しようとしているときには、必ず生理食塩水で湿った内臓を保つ。一つはcercusの複数形を濡らすから生理食塩水を防ぐために腹部を上方に配置するために、ワックスやゴムの部分を使用することができます。彼らが濡れた場合は、ティッシュペーパーの切れ端で、それらを乾燥させます。側に内臓し、白質（脂肪体）を押します。 VNCは、フィールドの中央である腹部の長さを実行し、光沢のある気管の間に表示されるはずです。神経索は半透明であり、照明は（ 図2）が適切に調整されるまで、最初は見えにくくすることができる。鉗子や虫ピンとVNCを処理しない、代わりにガラスプローブを使用して操作します。 </li><li>ピンセットで、微細なガラスの必要一対の神経索から可能な最良のように、動物の気管システムを一掃LESは、非常に慎重に、A6およびA5やA5とA4神経節（ 図3）の間で長手方向のVNC接続詞を分割します。クレードルcercusの複数形と短縮昆虫ピンとワックスまたは調製（ 図4AおよびB）を合わせてカット可能なシリコーンエラストマーのウエッジと生理食塩浴から上向きに腹部。神経節（ 図2Dおよび5）内に突出cercal神経を損傷しないように、最後の腹部のセグメント内に追加できるように注意してください。 </li></ol> 2。細胞外記録法<ol><li>解剖し準備、顕微鏡、および記録装置（ 図6）ニューロンからの信号をオーバーライドすることができ、外部、特に交流、電場を遮断するために、ファラデーケージの中に設定する必要があります。 </li><li>それは顕微鏡のステージを見下ろすされるように顕微鏡を配置します。製剤は、ステージ上に配置されると、高強度の照明ビームの位置を調整するそれを最大限可視化のために。 </li><li> （特定のハードウェアとソフトウェアの設定については、以前に25を説明してきた）統合されたデータ記録部にAC / DC差動アンプを接続します。吸引電極を保持ヘッドステージは、アンプに接続する必要があります。 Clで被覆された銀のアース線-より安定したレコーディング中の腹部の結果に挿入。その理由は、体腔内の溶液が皿の中の入浴流体と接触していない場合には、記録電極に関連付けられた流体は、接地のままである。 </li><li> 4 kHzに記録周波数を設定します。 500 mVで（これは微量の可視化を最適化するように調整することができる）に電圧スケール（y軸）を設定する。刺激に反応して神経活動を記録するために、連続またはオシロスコープモードで録音ソフトウェアを実行します。 </li><li> A5に近いのVNC接続詞の1をカットし、吸引電極にA6に装着切り口を置く。 Pに確認してください神経を吸引する前に内部の銀線をカバーするために吸引電極に生理食塩水をULL。 </li><li>各尾角に位置して毛の上の乾燥ピペットブロー空気と。記録された結合に尾角の同側の毛を刺激すると、反対側の1とは異なる応答を与えるかどうかを確認します。応答の振幅と刺激中の指定された時間間隔でのスパイクの数をメモします。 </li><li>記録cercal神経に吸引電極を移動します。必要に応じて、より良いフィット感を得るために、より小さな開口部に電極先端に切り替える。 </li><li> A6に近いcercal神経を切断し尾角につながる神経を吸う。活動電位の自然発火があるはずです。今、尾角に空気を吹き付けると応答に注意してください。 </li></ol> 3。電気的に募集を決定するために、感覚神経を刺激<ol><li>それはトレース（100〜500 MSEを記録するようにモードを掃引する録音ソフトを変更するC）たびに刺激がトリガされます。 </li><li>刺激装置の出力に刺激電極を接続します。 </li><li> 2ミニフックリードまたはクリップで、刺激ケーブルを接続します。 </li><li>記録部上のトリガ入力に刺激装置からのBNCトリガ出力を接続します。 </li><li> 10ミリ秒、周波数：1Hzで、電圧：必要に応じて（ちょうどしきい値を超えると、最大応答を得ることができること）のレコーディングに信号を得るために調整し、：時間：ディレイ0.3秒以下の刺激パラメータは、応答を呼び起こす必要があります。高電圧が神経にダメージを与えることができるように募集のための最大しきい値よりもはるかに高い電圧に行く理由はありません。 </li><li>長い神経根を刺激吸引電極（ 図7、矢印の頭）に引き込むことができるように、可能な限り遠位としてcercal神経を切った。 A6およびA5または別のセグメントより前方の間の結合を使用することができます。 </li><li>記録吸引電極を設定することができますので、PU電極中に切断された結合を事前にチェック！神経を吸引する前に内部の銀線をカバーするために、吸引電極にいくつかの生理食塩水を引くようにしてください。刺激電極はまた、（A3近い腹部に最適です）バス生理食塩水に接地されていることを確認します。 </li><li>活動電位が画面に表示されるまで増加する電圧の単一刺激のシリーズを提供します。一つは、応答を募集する最小限の刺激電圧と継続時間の記録を確認する必要があります。接続詞におけるシナプス応答が観察されるまで、強度を上げる。巨大軸索からの大きなスパイク（細胞外のAP）が最初に表示され、その後、他の小さいのAPも観察することができる。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立が存在しないことを宣言します。

この古典的な製造のための技術を発揮する理由の一つは、cercusの複数形のシステムがあったことであり、まだ神経回路の発達の問題に対処するだけでなく、シナプスの修復および再生26〜31についての質問での研究の活発な分野である。ゴキブリ腹側神経索において活性を誘発するいずれかの方法は、神経系機能に対する薬理学的物質又は殺虫剤の効果を調べるために使用することができる。これらの実験は、単純に生理食塩水に神経活性化学物質を溶解することによって行われます。接続詞または運動神経から記録しながら、通常の入浴培地でこの溶液を交換した後、誘発または自発的活動の変化は、CNSの機能に対する化学物質の効果の一貫性のある読み出しを与えるように観察することができる。 すべての神経生理学の実験のように、一般的な問題は、電気的なノイズです。これらの製剤のための信号品質の、おそらく最大の要因I神経組織のSの吸引電極シール。完全cercal神経または結合で描画しないタイトなシールが理想的です。記録はまた、神経索および鉱物油およびワセリンの混合物でVNC絶縁膜下に置かれた二重フック電極を作製することができる。この混合物をシリンジに充填し、神経索32の周囲に排出することができる。また、慎重な解剖は、いかなる中枢神経系の調製と、ここのように非常に重要です。いくつかは、それが簡単に背キューティクルを解剖によってCNSにアクセスするために見つけることができます。これは、腹側神経索を損傷する可能性を低減しながら、このアプローチを用いて内臓の全てを除去することはより困難であることができる。 それはここでは説明しませんが、この準備は巨大介在ニューロン32,33の細胞内記録に適している。全体の神経索はまた、同時に複数の記録及び刺激電極を収容するために除去することができる。触角葉、キノコBOのファクト探査DY、およびその他の前部CNS構造が進行中34〜35のままです。ゴキブリ中枢神経系は、現代の神経生物学的研究に光を当てるために続けているが、この特定の準備は、学部学術の研究室で使用するのに十分に簡単です。

そこに4,000人以上のゴキブリ種があるが、約30の家庭害虫である。おそらく最も有名なアフリカに起源名前の誤りワモンゴキブリワモンゴキブリであり、現在では地球上のほぼどこにでも発見された。熱帯地方での急速な走行速度1と回避行動に加えて、P.アメリカーナは、飛行2,3することが可能である。 ゴキブリ中枢神経系（CNS）の主な特徴は、制御プロセス4,5のセグメント化され、その性質および分散化である。脳、胸部、および腹部神経節、腹側神経索（VNC）を形成する一対の神経節間の結合子によって結合されている。 各セグメントでの神経節はセンターを統合している。これらは、単にそれらの下に血液脳関門透過性を担う細胞を含む外、皮質領域、および神経細胞の細胞体のorigiから構成されているその神経節でのNAT変換。これらの細胞体はニューロン、調節ニューロン、または運動ニューロンに属していてもよい。彼らは、原点（ローカル介在ニューロン）の神経節内にとどまる軸索、またはCNSの神経節の間に突出した軸索（神経節間の介在ニューロン）を供給または周辺筋肉細胞（運動ニューロン）に終了します。ほとんどの細胞体は、神経節皮質5に腹または腹部外側に位置している。対になった、神経節間の結合子だけ軸索なし神経細胞体が含まれています。 神経節の神経網は、グリア細胞（神経膠）、軸索管、軸索の束、および神経細胞の樹状突起（神経突起）が含まれています。神経網は、神経細胞体を欠いている。これは神経細胞および入力の積分間の直接的な通信が発生するシナプス神経節内の領域である。 ワモンゴキブリPの能力（足、漢を検出して、急に近づいて捕食者への対応アメリカーナD などが 。）cercusの複数形と巨大な繊維系の6,7で構成されていますリフレックス回路に起因している。 cercusの複数形は、腹部の終わり（ 図1）上にある角状、風の影響を受けやすい構造のペアです。 Pにアメリカーナ各尾角の腹面は約200糸状（糸）14の列に編成された毛髪が含まれています。これらの列のうち9は、一貫して関連した受容体細胞および軸索の応答特性に応じて異なる動物で同定することができる。それぞれの髪は、それが列固有である1面内で最も容易に曲げることを可能にするソケットです。その面に沿って一方向に髪の動きは、受容体細胞内の脱分極および感覚神経における活動電位のバースト（AP）を誘導する。反対方向への移動が進行中の自発的APが8を阻害する。レスポンスのたわみや方向性の好ましい面は、各列に異なっている。このように、filiform本の毛髪 - レセプター複合体は空気の動きを検出するだけでなく、APは、気流が発信された方向の形で、「コーディング」のためだけでなく、担当している。 CNSによるこの情報の処理は、「適切な」逃避反応6,7になる。感覚毛のこの機能は、柱状特異性は、動物から動物に保存されている。 各糸状の毛の受容体細胞は、（受容体細胞の軸索9のAPのバーストまたは阻害をもたらす神経イベントに毛の機械的変位を伝達する責任があります。APはcercal介して端子腹部神経節（A6）に旅行彼らは腹側神経索（VNC）の巨大軸索とシナプス神経XIは、巨大軸索は、逃避行動6,10,11をもたらす、運動ニューロンの伝達およびその後の励起に関与すると考えられている。 行動レイテンシーOPの逃避反応F アメリカーナは、任意の動物7の最短の一つです。行動待ち時間が機械受容の刺激の到着と逃避応答の開始の間の時間です。攻撃ヒキガエルから試行脱出を記録するために、高速撮影技術を用いた実験では、ゴキブリを移動7,12ゴキブリ舌伸長の開始から約40ミリ秒（時間的に離れてヒキガエルからの回転を開始することが観察された。制御された風力パフを使用して、行動の待ち時間は11ミリ秒に減少させることができた。他の実験はさらに低い速度（3ミリメートル/つつ（2ミリ秒600ミリメートル/加速度付き）12ミリメートル/秒の最小風パフ速度は、逃避反応を呼び起こすことができることを明らかにした秒）は12を移動を停止する、ゆっくり歩いてゴキブリが発生していました。 通常、巨大ファイバシステムと逃避行動の間に存在する強い相関関係がうまく13,14文書化されています。 instの中特定のセルが必要な特定の行動を喚起するのに十分であるancesセルは、コマンドニューロン15,16と呼ばれている。 Pの風エスケープ回路巨大介在ニューロン（GIS） アメリカーナは反射的に必要ではない。実験的に切除されたGISを活用した動物は、まだそのため、これらのGIをコマンドニューロン17,18考慮されていない逃避行動を示す。感覚回路に吻側である子宮頸部接続詞を切断することも脳からの入力を下降するエスケープ19の方向に影響を与えることを示す、行動に影響を与える。細かい制御と冗長性のこれらの局面は、生物の生存にとって最も重要であり、生体アミン20を介して神経化学的変調によって補完されています。 P.アメリカーナ神経索の準備はRoederの&lt;の先駆的な仕事から始めて、過去何十年にわたってneuroethologistsためのエレガントなモデルシステムでした&gt; 21 SUP。これは、ディスプレイを記録し、それらの入力22,23,24に巨大介在ニューロンによる一次知覚活動とその結果応答を分析するために学生を可能にします。識別可能な神経回路は、環境への行動反応の根底にあるという考えを伝えることに加えて、これらの演習は、この一般的な家庭害虫によって行われた生物学的な貢献に感謝を植え付ける必要があります。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

ゴキブリ腹側神経索調製物は神経動物行動学実験のために、ニューラルネットワークモデル、および殺虫剤の生理学的効果を試験するための扱いやすいシステムである。この記事では、昆虫の神経系は、環境摂動にどのように応答するかを分析するために使用することができゴキブリの感覚モダリティの範囲を説明しています。ここに重点がワモンゴキブリにおける巨大ファイバ伝送にcercusの複数形が介在する逃避行動である。これは、その場に備えて神経活動の再現性のある録音を生成するために、中程度の解剖技術および電気生理学的な専門知識を必要とします。ペプチドまたは他の化学試薬は、次いで生理食塩水を含む溶液中で、神経系に直接適用することができる。中枢神経系の興奮状態のためのプロキシとして働くことができる殺虫剤はまた、前の切開およびエスケープ回路に投与することができる。これに関連して本明細書中に記載のアッセイはまた、rに有用であろう四肢再生とどのPの神経系の発達の進化に興味esearchers アメリカーナは、確立されたモデル生物である。

空気のパフによるcercusの複数形の毛の刺激は、いずれかの腹部神経節またはcercal神経自体（ 図8）との間に接続詞に付着した細胞外吸引電極を用いて記録することができ、一次感覚ニューロンの放電が発生します。二つの領域から記録されたスパイク振幅がミリボルト、数マイクロボルトのオーダーである。なぜなら神経節における感覚統合の複合活動電位またはcercal神経から記録された個々のスパイクとして観測スパイクの数は、連結語からの記録で観察されるよりも格段に大きい。しかしまた、原因電極と神経組織との間の緊密なシールするために、結合の記録が実質的にノイズの少ないがあることに注意してください。 cercusの複数形大きなスパイクで空気を吹くことによって結合子（ 図8A）で観察することができる。この刺激法を用いて、A3とA4との間の典型的なレコーディング<html> LY巨大ニューロン（単数または複数）の大きなスパイク特性を示す。物理的に鉗子でcercusの複数形をこすりながらcercal神経からの記録は、活動の強力なバスト（ 図8B 1）を生成した。他の記録では、空気の2パフは、それぞれcercal神経の急激なつぶし応答（ 図8B 2）を生成した。電気A3とA4の間の結合における吸引電極と記録とのcercal神経を刺激すると、1は（ 図8C 1）の応答を誘発する刺激閾値を観察することができます。 cercal神経の電気刺激は、明らかにこのような温度（ 図8C 2）のような操作的薬理学的薬剤を用いた研究や、地域の環境を取り囲んで、ために定量することができる接続詞での応答を誘発する。 <html> fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。そのままcercusの複数形とワモンゴキブリ 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> 図2。取り外し腹キューティクルに見られるようなゴキブリ神経索の腹側図（A）。矢印で概説されたセグメントの拡大図（B）に見られる。 （C）において、接続詞は、ガラスプローブとA4とA3の間にこぼれた。 6 番目の腹部神経節は2 cercal神経が尾終わりに出ると、（D）に示されている。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> 図3。ゴキブリ神経索の概略腹側のビュー。 YS &quot;&gt; <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> 図4。cercusの複数形は、生理食塩水浴から上向きに配置されている。開いた腹部が出cercusの複数形を保つために、シリコーンエラストマーの小さな楔形状片を上昇さローチの尾の端に生理食塩水（A）が殺到することができます浴の（B）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> 図5。（矢印で概説さ）cercal神経と6 番目の腹部神経節。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> 図6。機器が設置しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">LARを見るにはここをクリックしてください</a>GER図。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> 図7。刺激と記録電極を設置しました。 <img alt="図8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> 図8。様々な刺激手順に接続詞やcercal神経の神経録音。cercusの複数形で空気を吹かしながら、A3とA4の間に接続詞から吸引電極で記録（A）。物理的に（B 1）または空気パフを提供する、（B 2）cercal神経の活動の急速なバーストで結果をこすりながら、どちら吸引電極を有する一次cercalニューロンから記録。電気cercal神経を刺激することは接続詞で応答を生成します（ <strong&gt; C 1）。刺激強度が徐々に増加する（矢印は刺激アーティファクトの振幅を示している）し、次の誘発反応の強さに注意してください。 cercal神経の電気刺激は、応答（C 2）を定量化するための刺激における一貫性のためcercal神経を刺激することが、比較的より制御された手段を提供します。

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Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

この記事では、ゴキブリ腹神経索の解剖とcercal神経と結合子から細胞外記録を記述する。誘発反応はcercal神経またはcercusの複数形の直接的な機械的刺激の電気刺激によって生成されます。

無傷のゴキブリ神経系の神経回路の録音

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.1K ビュー.  University of Kentucky. この記事では、ゴキブリ腹神経索の解剖とcercal神経と結合子から細胞外記録を記述する。誘発反応はcercal神経またはcercusの複数形の直接的な機械的刺激の電気刺激によって生成されます。 

ビデオ: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

マルチカラーで神経回路の地形を明らかにし

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

神経科学

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

神経応答を記録し、トレーサーを注入するための覚醒マウスの作製

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

中枢神経系から細胞を変換するためのレンチウイルスベクターの生産

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

第三令キイロショウジョウバエの中枢神経活動の電気生理学的記録

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

複数の中枢神経系領域からのマウスグリアの解剖と分離

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.