入浴記録方式は、最初のフリッケ（1984）8とビルらによって使用されていました。テールフリップ中に生成される電界を測定するために（1990）9。技術は後に彼の元大学院生博士ファディA.一茶と彼の元ポスドクを関連付ける博士イェンスHerberholzで博士ドナルドエドワーズ（ジョージア州立大学）の研究室で変更と改善されました。さらなる改良が行われており、新たな研究への応用は、メリーランド大学の博士イェンスHerberholzの研究室でテストされています。私は私が実験との助けのための彼のハイスピー​​ドビデオシステムと私の研究助手デイヴィッドRotsteinとウィリアムリーデンを使わせて同僚のデビッドイェガーに感謝します。

パート1：録音室<ol><li>録音室では、長方形の形状のものであり、薄肉のガラスで作られています。 3.5センチメートル合計の長さ（演壇から尾節に測定） - チャンバーの寸法は2.5の動物用× 2センチ× 5センチメートル（長さ×幅×高さ）8.5 cmである。 図を参照してください。実験に用いたチャンバーの例1。 </li><li>また、録音室は、他の材料（例えば、非毒性の透明なプラスチック）から行うことができます。チェンバースのサイズは、各実験シリーズ向けにカスタマイズされるべき実験手順やチャンバーに応じて異なる場合があります。最良の結果を得るために、チャンバーの大きさは、彼らの自然な行動に動物を拘束することなく可能な限り小さくする必要があります。経験則として、チャンバーの長さと幅は、動物の3倍以上のサイズでなければいけません。 </li></ol>パート2：バス電極とアース線<ol><li>記録電極と接地電極のいずれかのペアが使用されています。電極は絶縁銅線（0.25mmの絶縁26 AWG）で作られています。バス電極の一端は細胞外アンプ（AMシステムズ1700;下記参照）に接続され、0.5 - 絶縁体の1.0 mmのもう一方の端を、取り除かれます。アース線はアンプまたは他の接地された機器や断熱材の2-3 cmのグランドに接続され、もう一方の端を取り除かれている。 </li><li>バス電極とアース線は、非毒性接着剤で記録室の内壁に取り付けられている。記録電極は、互いに室と反対側（図1）の両方の短辺の中央に配置されています。 </li><li>接地電極は記録電極（図1）に録音室に垂直の一本の長い側に位置している。 </li><li>チャンバーは、脱イオン水で満たされている。最良の結果は、高抵抗の水（MΩ〜18）で得られる。 </li></ol>パート3：バス電極記録<ol><li>記録電極からの出力は、外アンプ（;モデル1700 AMシステム）によって（1000倍）増幅されています。記録電極からの信号は低周波（&lt;100 Hz）と高周波カットオフ値（&gt; 5 kHz）の組み合わせを用いて濾過する。その後、信号はスイッチボックスとデータ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）に接続されています。デジタル化されたデータは、記録保管、およびデータ収集ソフトウェア（フォトロンモーションツール）を用いて分析される。 </li><li>また、記録電極から増幅された信号は、他のアナログ - デジタル変換器（例えば、MDS解析技術、Digidata 1440）を使用してデジタル化することができるデジタル化されたデータの前に他の市販のデータ集録ソフトウェア（; Axoscopeなど、MDS解析技術）を使用して記録されます。 </li></ol>パート4：刺激的なプローブ<ol><li>刺激的なプローブは、細線の一対の電極を備えたガラスピペット（14センチ長さ）で作られています。電極チップは、動物がプローブに触れている電気信号を生成する（0.2 mm）の公開されています。これは刺激の正確な時間を計測することができる。 </li><li>刺激プローブからの出力は外アンプ（;モデル1700 AMシステム）によって（1000倍）増幅されています。信号は低周波（&lt;100 Hz）と高周波カットオフ値（&gt; 5 kHz）の組み合わせを用いて濾過する。その後、信号はスイッチボックスとデータ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）に接続されています。デジタル化されたデータは、記録保管、およびデータ収集ソフトウェア（フォトロンモーションツール）を用いて分析される。 </li></ol>パート5：ビデオの録画<ol><li>高速度ビデオカメラ（FASTCAM - X 1280 PCI、フォトロン）は側面図を提供するために録音室に垂直に配置されている。録音室内の明るさのレベルは、鎌首の照明または他のフォーカス可能な光源を使用してなどし最良の結果を、提供するために調整する必要があります。 </li><li>高速ビデオ撮影を一緒にし、ブレイクアウトボックス＆データ集録ボード（ナショナルインスツルメンツ）を使用して、電子記録と同期しています。バス電極から増幅された信号は、BNCケーブルを使用してブレークアウトボックスとデータ集録ボードに接続されています。外付けのハンドスイッチのトリガーは、同期した映像とデータ収集を開始します。 </li></ol>第6部：実験方法<ol><li>単一の動物をチャンバーに導入し、5分間順応させています。エスケープ尾を反転さはそれぞれ、頭部や腹部に異なる強度のシングルタップによって誘発されています。タップの強さは、実験者によって制御されます。各エスケープテールフリップは1000 F /秒のフレームレートでの高速ビデオで記録され、電子電場電位のデータポイントは、25 kHzで記録されます。お風呂やビデオ録画の開始トリガーボックスの手動スイッチによって開始されます。録音時間は、選択されたフレームレート（例えば、1000 F /秒= 4秒、合計録音時間）によって決定されます。ポストとプレトリガー録画時間を選択することができます。 </li><li> ないeは：バス電極の録音は、他の利用可能な録音方法とバス電極記録を組み合わせることにより、各試験種に一度検証する必要があります。ザリガニでは、銀電極のペアは、外科的腹神経索の周囲に移植することができる。エスケープ尾を反転誘発刺激が適用され、移植されたとバス電極を比較することができるの電子痕跡を記録することができます。 </li><li>テールフリップ動作と対応する神経活動をエスケープする捕食者の攻撃の間、または2つのザリガニのアゴニスト最中に、視覚的な脅威への応答など、異なる様々な文脈の内に記録することができます。チェンバーのサイズ、記録モード、などがそれに応じて調節する必要があります（説明を参照）。 </li></ol>パート7：データの分析<ol><li>単一のビデオフレームは、モーションツールソフトウェア（フォトロン）を用いて分析されています。電子トレースはそれぞれの刺激によって活性化された神経回路の種類を識別するために使用されています。ビデオデータは、動物と活性化神経回路の動きを決定するために同期生理的録音と比較されます。各アクティブ回路は、特性電子署名を（ 代表的な結果を参照）を生成します。 </li><li>プローブの接触および神経/筋肉の応答との間の待ち時間は、プローブ信号の発症とバス電極で記録された信号の発症との間の遅延を測定することにより、それぞれの実験のために計算されます。 </li></ol>パート8：代表的な結果若年性ザリガニの頭部または尾部（図2）に配信触覚刺激に応じて単一の高速ビデオフレームとエスケープテールフリップに対応する電界のレコーディングのシリーズ。 図。 2A：頭部への強力な触覚刺激は内側巨大な回路によって制御されるテールフリップを誘発。巨大ニューロン（アスタリスク）の記録されたスパイクと、次の大きな相のたわみが非曖昧識別テールフリップ巨大ニューロンの活性によって媒介として可能になります。ビデオのトレースに示すように後方への移動が活性化した神経回路（MG）のIDが決まります。 図。 2B：横方向の巨大な回路でテールフリップを介した強力な触覚刺激が尾に適用された後。上前方にビデオで見られる動きは、巨大なスパイクを表示する同期電子トレースと一緒にトレースし、大規模な、一過性の初期たわみは、活性化神経回路（LG）のIDが決まります。 図。 2C：テールフリップ以外の巨大な回路によって制御される。より緩やかな触覚刺激は、動物の胸部に配信されました。ビデオのキャプチャされた動きが活性化された回路の明確な識別を可能にするものではありませんが、電子記録は、巨大なスパイクを欠いていると活性化回路（非G）を識別する非常に小さなたわみで構成されています。 図。 3：エスケープの全3種類のレイテンシ測定テールが反転します。プローブの接触と生理反応との間の時間は、7匹のために測定した。巨大介在テールフリップ大幅に高速化以外の巨大なテールフリップよりも誘発されています。 <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> 図1：合計の長さの2.5〜3.5センチメートルの動物のために私たちの実験で使用した録音室のための例。アース線は、バス電極にチャンバーと垂直の長辺に接続されている間はバス電極は、チャンバの反対側に接着されています。 図2：刺激、3種類の1000 F /秒と、対応する電子記録で記録された単一のビデオフレーム。 <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A）強い触覚刺激は、動物の頭に配信され、内側の巨人（MG）はテールフリップ媒介誘発された。 6つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。バス電極で得られた記録のトレースは青で示されています。挿入図は、大規模な一過性変形の前に小さな巨大軸索のスパイクを示しています。グレーのバーが左に示すビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、プローブと接触した後のフレーム＃3、七ミリ秒で発生しました。 <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B）の強力な触覚刺激は、動物の尾に配信され、横方向の巨大な（LG）を介したテールフリップを誘発した。 6つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。で得られた記録のトレースバス電極が赤色で表示されます。挿入図は、大規模な一過性変形の前に小さな巨大軸索のスパイクを示しています。グレーのバーが左に示すビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、8ミリプローブと接触した後、フレーム＃3で発生した。 <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C）弱と徐々に触覚刺激は、動物の頭に配信され、非巨大な（非G）を介したテールフリップを誘発した。 8つのビデオフレームが左側に表示されています。動物に触れるために使用するプローブからの記録のトレースは灰色で表示され、接触点は、黒い矢印で示されます。バス電極で得られた記録のトレースは黒で示されています。トレースは、巨大なスパイク電位、大規模な初期たわみを欠いているとはるかに小さい振幅の電位で構成されています。ライトグレーのバーは左側に表示されているビデオフレームに対応しています。ザリガニの尾の最初の注目すべき動きは、プローブとのファーストコンタクトの後のフレーム＃6、115ミリ秒で発生しました。 <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> 図3：男女と同じようなサイズの両方の7つの動物の応答遅延の測定（長さを平均値± stdv：3.2センチメートル± 0.2 cmであり、尾節に演 ​​壇から測定）。 MG（青いバー）とLGは（赤いバー）フリップテールは、より大幅に短い応答待ち時間がテールフリップ非G（黒バー）回路によって媒介。平均と標準偏差が表示されます。同じ文字を持つ棒（ペアワイズ比較、P &lt;0.05のためにウィルコクソン符号付き順位検定）は互いに有意な差はなかった。

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	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

単一ニューロンの活動や神経回路の活性化の非侵襲的な録音は、無拘束の動物で得ることが困難です。このメソッドは、天然に存在する行動の根底にある神経活性化のパターンを識別する手段を提供するここで説明する。 過去には、我々は成功し、ビジュアルな脅威3に対応して、最近では天敵2、からの攻撃の間に、社会的優位性の階層1の形成?...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

神経活動と対応する行動の発現のパターンとの関係は、無拘束の動物で確立することは困難である。従来の非侵襲的な方法は、少なくとも部分的に抑制された研究課題を必要とし、彼らが同時に活性化ニューロンの多数の識別のみを許可。一方、神経細胞や個々のニューロンのアンサンブルは、大幅に低減調製物から得られる単一細胞記録を用いて測定することができます。自然な行動の発現が抑制され、解剖動物で限られているため、そのような動作を制御する基本的な神経機構は、識別が困難です。 ここで、私は自由に動物を振る舞うの神経回路の活性化を測定することができる非侵襲的生理的手法を提示する。水で満たされたチャンバ内のワイヤ電極のペアを使用して、バス電極は、自然または実験的に誘発エスケープ応答中に幼若ザリガニによって生成された神経と筋肉の電場電位を記録する。ザリガニの主なエスケープ応答は、刺激の点から動物を移動するテールフリップ、3つの異なるタイプによって媒介される。テールフリップの各タイプは、独自の神経回路によって制御され、2最速かつ最も強力なエスケープ応答は、大規模なコマンドのニューロンの異なるセットの活性化を必要とする。行動観察と組み合わせることで、バス電極の録音は、これらのニューロンが明確に識別し、関連する神経回路を可能にする。このように自然に発生する動作の基礎となる神経回路の活動が奔放動物では、さまざまな行動の文脈で測定することができます。

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

自由に動物を振る舞うの神経活動パターンの非侵襲計測は、高速ビデオ撮影で神経生理学的記録を組み合わせることによって得られる。

自由に動物を振る舞うの神経回路のアクティベーションの記録

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K ビュー.  University of Maryland. 自由に動物を振る舞うの神経活動パターンの非侵襲計測は、高速ビデオ撮影で神経生理学的記録を組み合わせることによって得られる。

ビデオ: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

光の全細胞録音は網膜スライスにおける興奮性シナプス電流を誘発

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

生物学

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

で小動物の筋肉の生着のダイナミクスの追跡インビボでの蛍光イメージング

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

自由にザリガニを移動でハートと換気率の措置

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

マウスの錐体光受容体からの単一細胞サクション録音

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPアーゼ活性化アッセイ

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

回路基板と生体膜のモデル化と軸索の電気信号の測定：学生研究室の演習を

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

アイソレーションと試験管内で</emの>活性化線虫（Caenorhabditis elegans）精子

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

自由に動物を振る舞うの神経回路のアクティベーションの記録

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