DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

注：すべての動物の手順は、連邦規則に付着し、ルイビル大学の施設内動物管理使用委員会によって設定されたガイドラインの下で行った。 ローのCa 2+および2mMのCa 2+人工脳脊髄液（aCSFの）の調製灌流液<ol><li> 表1に記載されるように2倍低いのCa 2+（0.1 mm）株価Cバッファー、2倍、通常のCa 2+（2 mm）株価バッファ、および2X証券Bバッファを準備します。個々の原液をイオン含有量の変更を許可（ 例えば、低いまたはゼロのCa 2+）及び1ヶ月まで4℃で保存することができる。 </li><li>解剖時の心臓内灌流のため、1倍低いのCa 2+ aCSFのを作るためにプラスチック製のボトルに2倍低いのCa 2+証券Cの100ミリリットルと2倍株式Bの100ミリリットルを追加します。混合し、4℃で一晩保存したり、新鮮作る。 </li><li>虚部の間にex vivoでの脊髄の灌流のためのINGは、1X aCSFのを生成するために、1リットルのガラスボトルに2倍、通常のCa 2+株式Aの500ミリリットルと2倍株式Bの500ミリリットルを追加します。混合し、室温で一晩保存したり、新鮮作る。 </li><li> 7.4にaCSFのバッファのpHを調整する。室温でのaCSFを維持しながら、氷上で低Ca 2+のaCSFのを配置し、気泡カルボゲンガスとの両方のバッファ（95％O 2、5％CO 2）で30分間前に、灌流中に連続的に使用する。 </li></ol> 生体外イメージング商工の調製<ol><li> aCSFのボトルの周りに加熱ブランケット（なし自動シャットオフ）をラップし、低/中の設定に熱を調整します。 </li><li>灌流ポンプ及び図1Aに示すように、バイポーラ温度コントローラ及びフィードバック温度プローブによって制御されているインラインヒータに接続されたボトルに、専用のaCSF灌流ラインを挿入する。 </li><li> 2光子励起/ confにフラット顕微鏡ステージインサート（152 X 102ミリメートル）を取り付け流出コンテナを装着しOCALの顕微鏡ステージ。 </li><li> （適切なEXについては、図1（b）参照 ex vivoでの脊髄に新鮮な酸素のaCSFの連続的な流れに対応し、提供するために、流出容器に、大規模なオープン浴灌流チャンバー（12×24×8ミリメートル幅×長さ×H）を配置）チャンバ設計を撮像する体内 。 </li><li>適切なチューブを使用してex vivoでのイメージング室にインラインヒータの金属出力ポートに接続します。撮影時のバッファ/組織の温度を維持するのを助けるためのex vivoイメージング室の下に薄い吸収パッドを配置します。 </li><li>取り外し可能な粘着性のタックを使用して流出コンテナ/ステージインサートの底にex vivoでのイメージング室を接着。目的の光路は、組織表面に対して垂直であることを確認するために、必要に応じて粘着性の粘着性の可鍛性は、チャンバが調整されることを可能にする。必要に応じて、チャンバを調整するブルズアイレベルを使用する。 </li><li>確保するチャンバの流体入口およびチャンバ出口での真空ラインに接続されたステンレス製の吸引チューブの近くにインラインヒータフィードバック温度プローブ。磁気テープ、適切なマイクロピペットホルダは、この点で有用である。真空源をオンにします。 </li><li>酸素化aCSFの持つイメージングチャンバーを充填開始する灌流ポンプをオンにします。毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを設定します。 </li><li>真空ラインを調整することにより、撮像チャンバ内のaCSFの音量を制御する。これは、十分なaCSFの脊髄セグメントをカバーし、水浸漬対物レンズと組織表面との間に十分な作動距離を可能にするために、撮像チャンバ内に存在することが重要である。組織セグメントは完全に実験者によって誘発されるアーティファクトをリードする新鮮な酸素aCSFの内に浸漬されていない場合、ミエリンと軸索は悪影響を受けることができます。 </li><li>撮像チャンバー内の灌流液の温度が室温付近になるように、インラインヒータ温度制御を調整する。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 3。アダルトマウス頸部脊髄の解剖<ol><li>腹腔内注射によって麻酔を、ペントバルビタールナトリウム（200 mg / kgを）の過剰摂取を注入することによって（後根神経節ニューロンにおける蛍光タンパク質の発現を有し、適切な株を使用する）、成人6-10週齢THY1 -YFPトランスジェニックマウスを安楽死させる。 </li><li>一度麻酔の適切なレベル（つま先のピンチとまばたき反射の消失に例えば、無反応）の下で、慎重に手術用バリカンで脊髄と脳を覆う皮膚を剃る。ベタジンおよび70％エタノールパッドを使用して皮膚を清潔。 </li><li>その後冷やし、カーボゲン-バブリング低Ca 2+のaCSFのを使用して経心件名を灌流、70％エタノールで胸/腹部領域をスプレーします。 （推奨解剖ベンチについては、図1Cは 、トップのセットアップを参照）。 </li><li>肝臓は見劣りとして、小さなクリップを使用して心臓に灌流針を固定します。の毛を剃っ背側にアクセスするための主題を裏返し被写体と70％エタノールで剃毛面積を拭く。 </li><li>脳と脊柱（ 図2A）を露出するために解剖ハサミを使用して、腰に鼻から始まる正中線に沿って背側皮膚切開を行います。鼻とハンチでピンを配置することで準備を固定します。 </li><li>この点から、解剖顕微鏡を用いて、しっかりと嗅球のレベルで頭蓋骨の背側表面を横切る。切開の側縁にはさみのヒントの1を挿入し、小脳まで両側性タツナミソウの縁に沿ってカット。 注：それは（ 図2Bを参照）解剖を通して脊髄から上にある組織を持ち上げるために、後に必要とされるように完全にスカルキャップを切除しないでください。 </li><li>脳を公開するスカルキャップを持ち上げます。 図2C（静かに（小脳に位置する）interparietal骨の左右の端をカットし、脳幹/脊髄を露出させるために尾戻ってそれを引っ張る</stroNG&gt;）。 </li><li>テーブル面に対して45°の角度で保持細い先端ハサミを使用して、後部神経根への二国間だけで劣る椎骨をカット。 注：明るい白背側の列との接触を避ける。これらの繊維は、（ 図2D）画像化され、簡単に破損することができるものです。 </li><li>カットが脊髄を露出させているように優しくワンピースでその上の組織を引っ張って、細かい傾いて鉗子で脊柱のスカルキャップと背側表面を持ち上げます。その後のイメージングのため頸髄（ 図2E）1-2センチセグメントを分離するために、上部胸椎レベルに脊椎カットし続けます。 </li><li>脊柱と列の下に明確な組織への組織/骨の並列をカットするはさみを使用してください。できるだけ水平これらのカットを行います。これは、コードがイメージング用のレベルになるように組織がチャンバ内に平らにすることが非常に重要である。 </li><li>過ぎて（脳幹を横断するために＃11メスを使用してくださいGRACILE束繊維の終了）と頸髄セグメントを分離するために、上部胸椎レベルで（ 図2Fを参照してください）。これらの同じ2つの点での組織/骨をカットするはさみを使用してください。孤立した組織は、尾側脳幹、子宮頸拡大し、上部胸髄（ 図2G）を網羅する脊柱の2/3を含める必要があります。 </li><li>カルボゲン-バブリング、チルド低いのCa 2+のaCSFのシャーレに孤立した脊柱を置きます。必要であればそれは皿に平らになるまで、脊柱の下に組織をトリミング。 </li><li> ex vivoでのイメージング室に孤立した脊柱を転送し、徐々に36に1時間かけて灌流液の温度を上げる- 37℃。撮像中にこの温度を維持する。 </li></ol>ナイルレッドとイメージング商工およびミエリンの標識に生体外脊髄の4の配置<ol><li>慎重に私に脊柱を確保適切なフィッティングスライスとmaging室が（; 図3Aを参照してください脊髄用の領域を確保するために、グリッドプラットフォームの真ん中のスレッドを削除します）細かいライクラ糸からなる垂直グリッドプラットフォームで修飾された押し続けます。 </li><li> （DMSO中に5 mMストックし、ろ過し、0.22μmのは、4℃、または暗闇の中で-20℃で6ヶ月で1ヶ月間保存することができます）ナイルレッドのアリコートを解凍する。単に撮像チャンバーにナイルレッドを添加する前に、灌流ポンプの流量を減少させ、チャンバ内の流体は、常に脊髄を覆うことを確認するために真空ラインを調整する。 </li><li>コード（ 図3B）の尾終わり近くイメージング室に5〜10μlのナイルレッド原液を追加します。優しく室全体にナイルレッドを混合するために1ミリリットルピペットを使用してください。ナイルレッドが戻って真空ラインを配置し、継続的に脊髄を灌流する毎分1.5〜2ミリリットルに灌流ポンプを調整した後、1〜2分間チャンバー内に滞在することを許可する。 </li><li>慎重に顕微鏡ステージを上げる水浸対物レンズは、チャンバー内のaCSFの表面から約10mmになるまでと背側の列の上に脊髄セグメントの中心とし、内側に目標を合わせます。それは優しくaCSFの表面に触れるまでゆっくりと目的を持って来るために顕微鏡ノーズピースフォーカスホイールを使用してください。視野（ 図3C）に後柱をフォーカスする落射光源を用いる。 </li></ol> TPLSMとレーザ誘起脊髄損傷マウス脊髄の5 例vivoイメージング（LiSCI） 注：後部静脈がGRACILE束繊維のような組織を中央に有用なマーカーを提供していますが、（後根神経節の細胞体に由来し、T6から上昇し、下に脊髄の正中線に沿って）この血管平行に走る。繊維はYに横方向に昇降などの厚いYFP +頚椎後根の予測も有用なマーカーを提供FP +直径が小さい薄束束繊維。 <ol><li>脊髄組織を適切に位置合わせされると、昇順薄束束有髄線維のベースラインイメージングを実行するためにレーザ走査モードに切り替える。両方YFP及びナイルレッドを励起し、蛍光発光を分離するために950nmの波長（〜25X、1.1 NA対物レンズの出口で測定された17 mW）とし、適切な色性（DM）とバンドパスフィルタに同調二光子レーザー光源を使用フルオロフォアの（我々は黄橙色、および拡張赤チャンネル、それぞれにYFP、ナイルレッドを分離するために、50分の525のDM560、60分の600のDM640、および70分の685を使用します）。 <ol><li>軸索の3％以上がベースラインイメージング（30〜60分）の間に軸索スフェロイドを示した場合は、原因実験者によって誘発されるアーティファクトに準備を捨てる。 </li></ol></li><li> 30.3Xに視野を拡大しLiSCIを誘導する（〜20μmの直径アブレーションを作成するため）。曲が800nm​​のレーザー、および少なくとも〜110ミリワットのレーザーのパワーを増加させるサンプル。繊維が完全に離断されていることを確認するために、ビューのレーザースキャンの5完全なフィールドを許可します。 </li><li> （サンプル、2.08Xで950 nmの、17 MW）をイメージングの設定に戻ってレーザーの設定を変更することでLiSCIを確認し、アブレーションを可視化する組織をスキャンします。アブレーションの直径を確認して、主要なアブレーションされた軸索が完全に離断していること（ 図3Dを参照）。損傷後の8-10 +時間までの損傷に軸索とミエリンの動的応答を記録するために、Zキャプチャと組み合わせる顕微鏡タイムラプス設定を使用します。 注：切除が不完全である場合（ すなわち 、繊維の不完全な離断）、一次および二次損傷機構の判定が混同されるように、調製物を捨てる。さらに、単離された脊髄セグメントはLiSCI非依存組織損傷を緩和するために軽度に24時間後LiSCIまで撮像することができる。 </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

私たちは、表面のイメージングex vivoでの脊髄髄軸索（ すなわち、GRACILE束）時間をかけて、プライマリとセカンダリの両方の有髄軸索変性の動的な進行を研究するためにレーザ誘起脊髄損傷と組み合わせる。 生体外イメージングの方法を説明脊髄は、そのような動きアーチファクトと長時間のイメージングセッション中実験者誘発性低酸素症の可能性として、in vivo</em...

軸索の変性は神経外傷、脳卒中、自己免疫、および神経変性疾患を含むいくつかの神経学的状態にまたがる罹患率の顕著な原因である。末梢神経系（PNS）、中枢神経系とは異なり（CNS）の軸索は、一度による内因性および外因性障壁（ すなわち、ミエリン変性時の瘢痕形成の間に生成され、遊離した軸索成長の阻害分子）1の両方に負傷再生する限られた能力を有している-7。これらの障害のいくつかは、広く調査されてきたが、CNS軸索変性を防ぐ頑強な軸索再生を促進し、機能的な連結的に復元することを目的とした治療的介入は、限定されるもので残る。 一度彼らの相馬から分離軸索は軸索腫脹、回転楕円体の形成及び（8にレビュー）最終的な断片化することを特徴とするウォーラー変性として知られている変性のステレオタイプのプロセスを経る。で対照的に、離断周辺軸索の細胞体との連続性に残る近切り株は、その端部に腫脹を形成し、バックランヴィエの最も近いノードに死亡した後、その後の軸索再生のために必要な成長円錐の形成、重要な前提条件を開始することができます9-11。対照的に、多くの中央軸索の軸索近位末端は、特徴的な「endbulbs」または後退電球を形成成長円錐を形成し、その代わりに離れて、それらが損傷した後に12〜15ヶ月のままで、損傷部位から後退させることができない。主要な軸索損傷に加えて、追加の軸索損傷/損失も大幅に最初の損傷から免れた軸索に発生する可能性があります。最初は免れる軸索のこの遅延軸索損失は、二次的軸索変性と呼ばれている。傷害にCNSの軸索のこの固有の応答は、機能的な軸索再生の脳や脊髄に達成するために、さらに困難な目標をレンダリングします。 haであるが軸索損傷（ 例えば、回転楕円体の形成、後退電球）のllmarksがよく、死後組織と軸索変性の実験モデルから特徴づけられている、これらの動的プロセスの根底にある分子メカニズムの解明が制限されています。これらの研究のほとんどは、本質的に時間をかけて、個々の軸索の応答を捕捉するために失敗した静的なエンドポイントでの観察に依存していた。しかし、外因的に軸索トレーサーは静的セクションから、ライブイメージング中の軸索の応答を解明する有用であった適用、遺伝的にコードされた軸索マーカーの可用性が大幅に蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで軸索を可視化する当社の能力を向上させた。実際、ケルシェンシュタイナーや同僚からの精液報告書は、第一脊髄の背側の列に自分の予想を送るニューロンのサブセットで緑色蛍光タンパク質をコードしてはThy1 -GFP-Sのマウスを用いたin vivoでの軸索変性と再生の直接的な証拠を提供したコード16。ライブイメージングは、2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）を使用して接近し、関心のある細胞の遺伝的蛍光タンパク質標識は、軸索変性のような多くの多様な動的プロセスへの直接的な証拠と機構的洞察を提供し続けたCa 2+シグナル伝達、軸索再生、星状細胞生理学、ミクログリア生理学、傷害17-25への応答。 軸索とは対照的に、ほとんどリアルタイムで負傷ミエリン反応知られている。ミエリンは、PNSにおけるCNSおよびシュワン細胞におけるオリゴデンドロサイトによって生成され、維持白質の重要なコンポーネントです。ミエリンは、軸索の表面の99％を絶縁し、そうすることによって、最近Buttermore らによる審査、迅速かつ効率的な跳躍インパルス伝播をサポートする高抵抗、低容量保護カバーを提供しています。26。傷害に対するミエリンの動的応答をキャプチャするために、我々はソルバ、親油性を使う蛍光染料ナイルレッド27。この生体染色のソルバトクロミック特性は、物理化学的環境28,29に依存し、その発光スペクトルのスペクトルシフトを可能にする。これらの特性は、axomyelinic損傷のメカニズムへの洞察を得るために有用であり、適宜選択ダイクロイックおよび発光フィルターを用いて可視化またはスペクトル顕微鏡27を使用して解決することができる。例えば、ナイルレッドの発光スペクトルは、ブルーシフトなどの脂肪細胞と正常なCNSミエリン（発光ピーク〜580から590 nm）の27に見られるような極性の低い、脂質の豊富な環境である。対照的に、〜625nmの軸索として形成endbulbsであるこの生体染色色素の発光スペクトルのピークは、軸索立ち枯れ27を受ける。通常のミエリンに対するendbulbsで特異的にこれらのスペクトルシフトの基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、このようなスペクトルの変化は、タンパク質の蓄積や組織崩壊につながる基礎となる変化を明らかにすることができる疎水性結合部位27の露出。 in vivoイメージングは、それらのネイティブ環境で脊髄軸索損傷のダイナミクスを観察するための究極の測定基準であるが、それは技術的に困難であり、かなりの外科専門知識を必要とし、多くの場合、実験の成果物（ 例えば、炎症や傷跡を導入することが脊柱を露出するために手術を繰り返す形成）。また、高価な機器は、多くの場合、顕微鏡対物レンズ下で無傷動物の懸濁液及び位置決めを可能にするために必要とされる。動物は慎重に、彼らは、流体が補充されることを確認するために、そして長引く麻酔をイメージングセッションに低酸素症の兆候がないことを確認するために、温かいまま確保するためにも監視する必要がある。軸索とミエリンは絶対生存したまま一定灌流および適切な酸素レベルを必要とする後者は非常に重要である。しかし、これは、しばしばin vivo研究ほとんどの報告または監視されていない日付。による心拍数及び（イソフルラン麻酔成体マウスの呼吸に加えて、動きアーチファクト：〜毎分300〜450ビート（BPM）は、97から98パーセントの酸素飽和度（通常レート〜632 BPM）および〜55-65呼吸を維持するために最適であるでも最速のレーザースキャンが避けられないこれらの動きを受けますように、生体内の脊髄イメージング中に発生した））は、それぞれ、（通常のレートは毎分〜163呼吸である）毎分30は、挑戦的な高解像度の蛍光顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化するアーティファクト。移植可能な剛性椎フレームウィンドウと組み合わせる超共鳴スキャナの進歩は、覚醒動物におけるマウス脊髄のイメージングを可能にすることができるが、より速いスキャン時間が必然的に画質を劣化させる信号対雑音比を減少させる。 、現在、脳イメージングに使用脊髄イメージング技術の更なる改善は、これらの障害の多くを克服し、伊那によって導入ポテンシャル交絡を制限することができるdequate組織灌流、 例えば、31-33。 白質生理学および白質損傷のメカニズムについては知られていることの多くは、 インビトロまたは視神経、末梢神経、および脊髄白質34-41のストリップからの白質のエクスビボ調製物において使用して決定されている。これらの製剤は、彼らが環境要因で制御さの変化、薬剤や試薬の制御された適用、電気生理学を用いて機能の評価、および生体組織における軸索とミエリンの直接の蛍光顕微鏡観察を可能にするように白質傷害メカニズムの知識を進めるために続けている。しかし、脊髄後カラムストリップまたは腹側白質ストリップから軸索を観察するためにいくつかの以前のアプローチは、不可避的に密接に反対した軸索の応答に影響を与える可能性が除去段階で表面軸索を傷つける。上記の実験操作を活用し、VEのへの損傷を避けるため、それはコードの背側面の直接接触を防止するように、調査中のryの繊維は、我々は、ex vivoで頸髄モデルを使用する。このように、軟膜と隣接する表面的な脊柱軸索のアーキテクチャでは、単離の間生存可能で、非摂動残る。 損傷後の10+時間 - ここでは、それらが動的に最大8リアルタイムで局所損傷に反応するように、中央髄軸索の直接可視化を可能にする比較的単純なアプローチを説明します。レーザー誘起脊髄損傷（LiSCI）モデルが空間的に時間をかけて拘束されたままに原発巣（アブレーション部位）などの一次および二次軸索損傷メカニズムの間の区別を可能にします。オープンバス撮像チャンバは、治療的介入、試薬送達、および環境の操作にアクセス可能である。推定上のaxomyelinic保護剤は、迅速に組織プロセスを伴う長くて費用のかかる実験に対して直接観察によりリアルタイムで評価することができる、る、免疫染色、画像キャプチャ、および分析を区画ため、生きた動物で実験的なエージェントをテストする前に急性応答および保護の操作を評価するための有用な代理モデルを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

負傷CNSの軸索が再生し、多くの場合、離れて、損傷部位から退避に失敗する。最初の損傷から免れる軸索は、後に二次的軸索変性を受けることができる。脊髄内の追加髄軸索投射の成長円錐の形成の欠如、再生、および損失が大幅に損傷後の神経学的回復を制限します。脊髄の髄軸索が傷害に応答するかを中央評価するために、我々は、軸索に黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いたex vivoでの生活脊髄モデルとの運命を文書化するための焦点と再現性の高いレーザー誘起脊髄損傷を開発二光子励起タイムラプス顕微鏡を用いて軸索と時間をかけてミエリン（親油性蛍光色素ナイルレッド）。そのような急性の軸索損傷、軸索退縮、およびミエリン変性などの動的プロセスは、最高のリアルタイムで研究されている。しかし、挫傷ベースの怪我や運動アーチファクトの非焦点性質が遭遇in vivoでの脊髄撮影時の挑戦的な高解像度の顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化する。ここで説明するex vivoでの脊髄モデルは軸索腫脹、回転楕円体の形成、軸索切断し、リアルタイムでこれらの動的過程を研究するために有用なモデルを提供して腫れ周囲の軸索を含む臨床的に関連する挫傷/圧縮によって誘発される軸索の病態のいくつかの側面を模倣。このモデルの主な利点は、直接軸索と二次的損傷のメカニズムを傷つける主要侮辱間の区別を可能にする優れた時空間分解能である。直接灌流液入浴コードへの試薬の制御注入。環境環境（ 例えば、カルシウム、ナトリウムイオン、軸索損傷に対する既知の貢献者が、 生体内で操作することが不可能に近い）の正確な変化は、それらは可視化する機会を提供したように、マウスモデルも利点を提供遺伝的に同定された細胞集団および細胞内構造を操作します。ここでは、急性の軸索損傷のダイナミクスをキャプチャするためにマウスから住んで脊髄を分離して画像にする方法について説明します。

単離生存能力を維持するために必要な設定の適切な研究室の詳細、および画像エキソビボ脊髄は、 図1に示されている。顕微鏡は波長可変パルスフェムト秒レーザー、適切dicroicsおよび発光フィルター、および水を装備する必要がある高開口数の対物レンズを浸漬（≥1.0）。解剖時に脊髄の生存を確保するために、手順42を封止する、単離された軸索の膜のための十...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K ビュー.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

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Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

横方向の流体のパーカッション：マウスにおける外傷性脳損傷のモデル

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

神経科学

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivoデュオ カラー霊長類脊髄損傷血管動態のイメージング手法

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

脊髄とトレッドミル上のアクティビティ ベースのトレーニング負傷 Wistar ラット

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) occlusion of the middle cerebral artery (MCA) using a catheter. This generally accepted technique, however, has some limitations, thereby limiting its extensive use. Stroke induction by this method is often characterized by high variability in the localization and size of the ischemic area, periodical occurrences of hemorrhage, and high death rates. Also, the successful completion of any of the transient or permanent procedures requires expertise and often lasts for about 30 minutes. In this protocol, a laser irradiation technique is presented that can serve as an alternative method for inducing and studying brain injury in rodent models.
When compared to rats in the control and MCAO groups, the brain injury by laser induction showed reduced variability in body temperature, infarct volume, brain edema, intracranial hemorrhage, and mortality. Furthermore, the use of a laser-induced injury caused damage to the brain tissues only in the motor cortex unlike in the MCAO experiments where destruction of both the motor cortex and striatal tissues is observed.
Findings from this investigation suggest that laser irradiation could serve as an alternative and effective technique for inducing brain injury in the motor cortex. The method also shortens the time for completing the procedure and does not require expert handlers.

The protocol presented here shows a technique to create a rodent model of brain injury. The method described here uses laser irradiation and targets motor cortex.

ラットの運動皮質におけるレーザー誘発脳損傷

A common technique for inducing stroke in experimental rodent models involves the transient (often denoted as MCAO-t) or permanent (designated as MCAO-p) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

マウスにおける完全なトランセクション型脊髄損傷の誘導

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

末梢神経または脊髄損傷を伴うげっ歯類の機能回復を評価する自動歩行分析

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...