Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden unter Leitlinien von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der University of Louisville gesetzt durchgeführt, um Bundesvorschriften einzuhalten. 1. Vorbereitung der Low Ca 2+ und 2 mM Ca 2+ Künstliche Liquor (aCSF) Perfusaten <ol><li> Bereiten 2x niedrigen Ca 2+ (0,1 mM) Auf C-Puffer, 2x Normal Ca 2+ (2 mM) Auf A-Puffer und 2x Auf B-Puffer wie in Tabelle 1 beschrieben. Die einzelnen Stammlösungen erlauben Modifikation der Ionengehalt (zB niedrig oder null Ca 2+) und kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat gelagert werden. </li><li> Für intra Perfusion beim Präparieren, 100 ml 2x niedrigen Ca 2+ Lizenz C und 100 ml 2x Lizenz B in eine Plastikflasche auf 1x niedrigen Ca 2+ aCSF machen. Mischen und über Nacht bei 4 ° C oder machen frisch. </li><li> Für Durchblutung der ex vivo Rückenmark während imaging, fügen Sie 500 ml 2x Normal Ca 2+ Lizenz A und 500 ml 2x Lizenz B in einen 1 l Glasflasche auf 1x aCSF erzeugen. Mischen und über Nacht bei Raumtemperatur lagern oder kreiere frisch. </li><li> Der pH-Wert von aCSF Puffer auf 7,4. Während die aCSF bei Raumtemperatur, legen Sie die niedrige Ca 2+ aCSF auf Eis und dann Luftblasen beide Puffer mit Carbogen Gas (95% O 2, 5% CO 2) 30 Minuten vor der während der Perfusion verwendet und kontinuierlich. </li></ol> 2. Herstellung von Ex Vivo Imaging Kammer <ol><li> Wickeln Sie ein Heizdecke (keine automatische Abschaltung) um den aCSF Flasche und stellen Sie Hitze zu niedrig / mittlere Einstellung. </li><li> Legen Sie eine dedizierte aCSF Perfusionsleitung in die Flasche zu einem Perfusionspumpe und Inline-Heizung, die durch einen bipolaren Temperaturregler und Feedback-Temperaturfühler, wie in 1A gezeigt, gesteuert wird. </li><li> Befestigen Sie einen Flachmikroskoptisch Einsatz (152 x 102 mm) mit dem 2-Photonen-Anregung / confocal Mikroskoptisch mit einem Überlaufbehälter ausgestattet. </li><li> Stellen Sie ein großes Open-Bad Perfusionskammer (B x L x H; 12 x 24 x 8 mm) in den Überlaufbehälter zur Aufnahme und ermöglichen die kontinuierliche Zufuhr von frischer Sauerstoff angereicherte aCSF auf die Ex-vivo-Rückenmark (siehe Abbildung 1B nach einer geeigneten Ex- vivo-Bildgebung Kammer-Konstruktion). </li><li> Schließen Metall Ausgangs-Port des Inline-Heizung bis zur Ex-vivo-Imaging-Kammer mit geeigneten Schlauch. Legen Sie ein dünnes absorbierendes Kissen unter dem Ex-vivo-Imaging-Kammer, um die Temperatur der Puffer / Gewebe während der Bildgebung zu halten. </li><li> Beachten Sie die Ex-vivo-Imaging-Kammer, um den Boden des Überlaufbehälter / Bühneneinsatz mit abnehmbaren klebrig. Die Formbarkeit des klebrig ermöglicht je nach Bedarf, um sicherzustellen Lichtweg des Objektivs senkrecht zur Gewebeoberfläche der Kammer eingestellt werden. Verwenden Sie gegebenenfalls eine Bullseye Ebene, um die Kammer ein. </li><li> Sicher einDurchlauferhitzer Feedback-Temperaturfühler in der Nähe der Kammer Fluideinlass und einem Stahlstutzen Edelstahl mit einer Vakuumleitung an die Kammer Steckdose angeschlossen ist. Magnetband und geeignete Mikropipette Halter sind in dieser Hinsicht nützlich. Schalten Sie die Vakuumquelle. </li><li> Schalten Sie den Perfusionspumpe zu beginnen Füllung der Imaging-Kammer mit Sauerstoff angereichert aCSF. Stellen Sie die Perfusionspumpe 1,5-2 ml pro min. </li><li> Regeln Sie die Lautstärke des aCSF in der bildgebenden Kammer durch Anpassung der Unterdruckleitung. Es ist wichtig, dass es genug aCSF werden im Abbildungsraum, um das Segment des Rückenmarks zu decken und ausreichender Arbeitsabstand zwischen einer Wassertauchobjektiv und der Gewebeoberfläche. Myelin und Axone können in Mitleidenschaft gezogen werden, wenn die Gewebesegment nicht vollständig in frischem sauerstoffreichem aCSF taucht, die zu Experimentator bedingte Artefakte. </li><li> Stellen Sie die in-line-Heizung Temperaturregler, so dass Perfusat Temperatur in der Imaging-Kammer ist in der Nähe von Raumtemperatur. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissektion der erwachsenen Maus Halsmark <ol><li> Euthanize ein Erwachsener 6-10 Wochen alte thy1 -YFP transgene Maus (Einsatz geeigneter Stamm, fluoreszierende Protein-Expression in Dorsalwurzelganglionneuronen hat) durch Injektion einer Überdosis des Narkose Natriumpentobarbital (200 mg / kg) über intraperitoneale Injektion. </li><li> Einmal unter der richtigen Ebene der Anästhesie (zB keine Reaktion bis Fuß Prise und der Verlust der Blinkreflex), sorgfältig rasiert, die Haut über dem Rückenmark und Gehirn mit chirurgischen Schneidemaschinen. Reinigen Sie die Haut mit Betadin und 70% Ethanol-Pads. </li><li> Spray Brust / Bauchbereich mit 70% Ethanol und dann durchströmen das Thema transkardial Verwendung gekühlt, Carbogen-sprudelte niedrigen Ca 2+ aCSF. (Siehe Abbildung 1C für vorgeschlagen Präparation Labortisch aufgestellt). </li><li> Da die Leber verblasst, sichern Sie die Perfusion Nadel in das Herz mit einem kleinen Clip. Drehen Sie das Thema über die rasierte Rückenseite zugreifenGegenstand und wischen Sie die rasierte Fläche mit 70% Ethanol. </li><li> Machen Sie eine dorsalen Hautschnitt entlang der Mittellinie ausgehend von der Nase bis zur Hüfte mit Dissektion Schere, um das Gehirn und der Wirbelsäule (2A) aus. Sichern Sie die Vorbereitung, indem Stifte an der Nase und Keule. </li><li> Verwendung eines Dissektionsmikroskop von diesem Punkt an, fest auf der dorsalen Oberfläche des Schädels auf dem Niveau der Riechkolben geschnitten. Das eine Ende der Scherenspitzen in den seitlichen Kanten des Einschnitts und entlang den Rändern der Schädeldecke beidseitig bis Cerebellum geschnitten. HINWEIS: Nicht ganz die Schädeldecke herauszuschneiden, wie es später benötigt wird, um die darüber liegende Gewebe aus dem Rückenmark in der gesamten Dissektion heben (siehe Abbildung 2B). </li><li> Heben Sie die Schädeldecke, um das Gehirn aus. Vorsichtig schneiden Sie die linken und rechten Rand des Inkabein (im Kleinhirn befindet) und ziehen Sie sie zurück nach kaudal um den Hirnstamm / Rückenmark freizulegen (2C </strong&gt;). </li><li> Verwenden Sie feinen Spitzen Schere in einem 45 ° Winkel zur Tischoberfläche gehalten und schneiden Sie den Wirbel bilateral nur schlechter als die hinteren Nervenwurzeln. HINWEIS: Kontakt mit den hellen weißen Hinterstränge vermeiden. Diese Fasern sind diejenigen, die abgebildet werden sollen (2D) und kann leicht beschädigt werden. </li><li> Heben Sie die Schädeldecke und Rückenfläche der Wirbelsäule mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig Ziehen des darüberliegenden Gewebe in einem Stück wie Schnitte gemacht werden, um das Rückenmark aus. Weiterhin Wirbel der oberen Brust Ebene geschnitten, um eine 1-2 cm Segment der Halsmark für die anschließende Bildgebung (2E) zu isolieren. </li><li> Mit einer Schere das Gewebe / Knochen parallel zur Wirbelsäule und klare Gewebe unter der Spalte abgeschnitten. Nehmen Sie diese Schnitte möglichst waagerecht. Es ist sehr wichtig, dass das Gewebe flach in der Kammer, so dass das Kabel Ebene für die Bildgebung. </li><li> Verwenden Sie einen # 11 Skalpell, um den Hirnstamm durchschneiden (VergangenheitKündigung der Fasciculus gracilis Fasern) und an der oberen Brustniveau, um das Segment Halsmark zu isolieren (siehe 2F). Mit einer Schere Gewebe / Knochen an eben diesen zwei Punkten schneiden. Die isolierte Gewebe sollte 2/3 der Wirbelsäule umfasst das Schwanzhirnstamm, Halsanschwellung und oberen Brustrückenmarks (2G) enthalten. </li><li> Legen Sie die isolierten Wirbelsäule in eine Petrischale von Carbogen blasigen, gekühlt niedrigen Ca 2+ aCSF. Wenn nötig, schneiden Sie die darunter liegende Gewebe der Wirbelsäule, bis es in die Schüssel wieder glatt ist. </li><li> Übertragen der isolierten Wirbelsäule zur ex vivo Abbildungskammer und allmählich das Perfusat Temperatur während 1 h erhöht, um 36 bis 37 ° C. Halten Sie diese Temperatur während der Bildgebung. </li></ol> 4. Vermittlung von Ex vivo Rückenmark in Imaging Chamber und Myelin Markierung mit Nile Red <ol><li> Die Wirbelsäule vorsichtig zu sichern in der i-maging Kammer mit einem geeigneten Beschlag Scheibe halten Sie mit einer vertikalen Grid-Plattform, bestehend aus feinen Fäden Lycra modifiziert (entfernen mittleren Fäden der Grid-Plattform, um Platz für das Rückenmark zu ermöglichen; siehe 3A). </li><li> Tauwetter ein Aliquot Nile Red (5 mM Stamm in DMSO und 0,22 um gefiltert, kann für 1 Monat bei 4 ° C oder 6 Monate bei -20 ° C im Dunkeln gelagert werden). Unmittelbar vor Zugabe Nilrot zur Abbildungskammer, reduzieren die Strömung der Perfusionspumpe und Einstellen der Vakuumleitung, um sicherzustellen, das Fluid in der Kammer umfasst immer das Rückenmark. </li><li> In 5-10 ul Nilrot Stammansatzes auf den Imaging-Kammer in der Nähe der Schwanz Ende der Schnur (3B). Verwenden Sie eine 1 ml Pipette vorsichtig mischen Nilrot in der gesamten Kammer. Lassen Nilrot in Kammer für 1-2 min zu bleiben, dann legen Sie Druckleitung zurück und stellen Perfusionspumpe auf 1,5-2 ml pro Minute kontinuierlich durchströmen das Rückenmark. </li><li> Den Mikroskoptisch vorsichtig anhebenund Ausrichten des Ziels mit der Mitte des Rückenmarksegment und medial über die dorsalen Säulen, bis die Wasserimmersionsobjektiv ist ungefähr 10 mm von der Oberfläche des aCSF in der Kammer. Verwenden Sie die Mikroskopobjektivrevolver Fokus Rad, um das Ziel langsam senken, bis sie ihn leicht berührt die Oberfläche des aCSF. Verwenden Sie ein epifluoreszenten Lichtquelle, um die Hinterstränge in das Sichtfeld (Abbildung 3C) zu konzentrieren. </li></ol> 5. Ex-vivo-Bildgebung der Maus Spinal Cord mit TPLSM und Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen (Liščí) HINWEIS: Die posteriore Vene ein nützlicher Marker, um das Gewebe wie die gracilis fasciculus Fasern zu zentrieren (stammen vom Zellkörper der dorsalen Wurzelganglien und steigen von T6 und unten entlang der Mittellinie des Rückenmarks) parallel zu dieser Blutgefäßes. Die dickeren YFP + Halsalgan Projektionen bieten auch ein nützlicher Marker wie die Fasern und abstiegs seitlich zur YFP + gracilis fasciculus Fasern, die im Durchmesser kleiner sind. <ol><li> Sobald das Rückenmarksgewebe wird entsprechend ausgerichtet, Schalter Laser-Scanning-Modus Basislinie Abbildung der aufsteigend Fasciculus gracilis markhaltigen Fasern durchzuführen. Um sowohl YFP und Nilrot erregt, mit einem Zwei-Photonen-Laser-Quelle auf 950 nm Wellenlänge (~ 17 mW, gemessen bei der Ausfahrt eines 25X, 1,1 NA-Objektiv) und geeignete dichroitische (DM) und Bandpassfiltern abgestimmt, um die Fluoreszenzemission zu isolieren der Fluorophore (wir verwenden 525/50 DM560, DM640 600/60 und 685/70, zu YFP und Nilrot in gelb-orange, rot und erweiterte Kanäle jeweils getrennt). <ol><li> Wenn mehr als 3% der Axone axonalen Sphäroiden während der Baseline-Bildgebung (30-60 min) zeigen, entsorgen Sie die Vorbereitung durch Experimentator bedingte Artefakte. </li></ol></li><li> Induzieren eine Liščí durch Vergrößerung des Sichtfelds zu 30.3X (einen Durchmesser Ablation ~ 20 &amp; mgr; m zu erzeugen). Stellen Sie den Laser bis 800 nm, und erhöhen Sie die Leistung des Lasers auf ~ 110 mW beidie Probe. Lassen Sie 5 komplette Sichtfeld Laserscans, um sicherzustellen, Fasern vollständig durchtrennt werden. </li><li> Bestätigen Liščí indem Lasereinstellungen auf Bildeinstellungen (950 nm, 17 mW bei der Probe, 2.08X) und scannen Sie das Gewebe, um die Ablation zu visualisieren. Überprüfen der Durchmesser der Ablation und die Primär ablatiert Axone vollständig durchtrennt (siehe Figur 3D). Verwenden Sie Zeitraffereinstellungen am Mikroskop in Kombination mit z-Capture, um die Dynamik der Axone und Myelin um Verletzungen bis zu 8-10 + h nach der Verletzung zu erfassen. HINWEIS: Wenn der Ablation ist unvollständig (dh unvollständige Durchtrennung von Fasern), entsorgen Sie die Vorbereitung, die Bestimmung von primären und sekundären Verletzungsmechanismen wird verwechselt werden. Außerdem isoliert Rückenmarksegmente kann bis zu 24 Stunden nach der Liščí mit nur leichten abgebildet werden bis mittel Liščí unabhängige Gewebeschäden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir beschreiben ein Verfahren zur ex vivo-Bildgebung des Rückenmarks myelinisierten Axone (dh Fasciculus gracilis), kombiniert mit einem Laser-induzierte Verletzung des Rückenmarks, die dynamische Fortschreiten der primären und sekundären myelinisierten axonale Degeneration im Laufe der Zeit zu studieren. Ex-vivo-Bildgebung der Oberfläche das Rückenmark überwindet viele der Komplikationen, die mit in-vivo-Abbildung zugeordnet, wie Bewegungsartefakte und das Potential der Experimentator induzierte Hypoxie während längerer Bildgebungsvorgängen. Dieses Protokoll isoliert die gesamte Halswirbelsegment des Rückenmarks mit Sauerstoff angereichert Perfusaten, die niedrige Ca 2+ und vermeidet Schäden an den darüber liegenden axonale Fasern, ein häufig anzutreff Rückschlag im dorsalen Säule oder ventralen weißen Substanz Streifen Zubereitungen. Darüber hinaus ermöglicht es die Forscher Mikroumgebung des isolierten Rückenmark vor oder nach Verletzungen des Rückenmarks (zB Änderung der Ca 2+ zu manipulierenKonzentration und / oder Zugabe von pharmazeutischen Reagenzien). Im Gegensatz zur Durchtrennung, Quetschungen oder zerbrechen SCI Modelle, die einen weiten Bereich von Axonen beeinflusst, die stark fokussierten Natur Liščí ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung der initialen Verletzung (trennten Axone) und die später auftretenden sekundären axonalen Schäden. Das beschriebene ex vivo Bildgebung und LISCI Protokoll kann verwendet werden, um andere Komponenten des weißen Substanz Verletzungen einschließlich Demyelinisierung neuroinflammation von CNS-Wohnsitz Immunzellen einschließlich Mikroglia induziert und anoxischen / ischämischer Verletzung Mechanismen zu untersuchen. Diese Studien könnten auch an den Hinterstrang Axone zu konzentrieren, wie in der aktuellen Protokoll oder Modifikationen können den Bild andere oberflächlich gelegen spinalen weißen Substanz Wege hergestellt werden. Zusätzlich können andere transgene oder doppelt transgene Mäuse Stämme auch mit diesem Protokoll für die Aktivierung / Aktivitäten von ZNS-Zellen mit Wohnsitz studieren. Es gibt einige kritische conÜberlegungen für eine erfolgreiche Isolation und Abbildung einer Maus ex vivo Rückenmark. Zum einen müssen die aCSF Puffer gehalten Sauerstoff angereichert auf Hypoxie zu verhindern. Das Rückenmark ist, indem sie in der mit Sauerstoff angereicherten aCSF während und nach der Isolierung untergetaucht feucht gehalten werden. Während der Dissektion, ist es am besten, um die mechanische Belastung der Wirbelsäule zu minimieren, wie übermäßiger Druck von Zurückziehen des darüberliegenden Gewebe zu fest und Stretching / Biegen des Rückenmarks beim Öffnen vom Gewebe unter der Wirbelsäule Segment. Darüber hinaus ist es wichtig, nicht berühren / komprimieren die Rückenmarkshinterstränge. Die Aufrechterhaltung der optimalen aCSF Perfusat Temperatur in der bildgebenden Kammer ist auch wichtig, da eine Hyperthermie-Umgebung kann das Rückenmarksgewebe betonen. Um sicherzustellen, dass die Axone werden vollständig während LISCI trennt, ist es wichtig, die Gewebesegments in den ex-vivo-Kammer immobilisieren potentiellen Gewebebewegung während des Laser ablat minimierenIonen. Darüber hinaus sollte das Gewebe an der gewünschten Ablationsstelle Wohnung in der bildgebenden Kammer liegen (senkrecht zum Objektiv). Liščí geführt auf Gewebe, die nicht Niveau führt zu einer gekippten Ablation, die anschließende Bildanalyse erschwert und verringert die Gesamtbildschärfe. Schließlich kann die Gewebetiefe der Laserablation die LISCI Ergebnisse beeinflussen. Wir schlagen vor, die zentrale Anlaufstelle für die Ablation auf etwa 12 bis 15 &amp; mgr; m unterhalb der Pia mater ist. Eine große Einschränkung für die Nutzung dieses ex vivo-Bildgebung Modell Axon und Myelinverletzungsmechanismen zu prüfen ist, dass die Auswirkungen der peripheren Blut-abgeleiteten Zellen folgenden Liščí nicht ermittelt werden kann. Weiterhin, da dies ein Terminalmodell, Verhaltens- und Regeneration Ergebnisse nach der Verletzung nicht ausgewertet werden kann. Eine Einschränkung dieser ex vivo Liščí Bildmodell, das mit in-vivo-Bildgebung genutzt wird, ist die Tiefe, die geeignet ist, gelöst ist aufgrund der starken Licht scattering Eigenschaften des Rückenmarks der weißen Substanz. Daher konzentriert sich diese ex vivo Rückenmarks Abbildungsmodell vornehmlich die zentralen Vorsprünge aufsteigend aus den Hinterwurzelganglien sensorischen Neuronen, die am leichtesten zugänglichen Fasern zu visualisieren, da sie entlang der dorsalen Oberfläche des Rückenmarks sind. Weitere markhaltigen Axonen Wege wie absteigend Motoraxonen unterschiedlich nach einer Verletzung im Vergleich zu den aufsteigender sensorischer Axone in diesem Protokoll dokumentiert reagieren. Eine weitere Gemeinsamkeit Begrenzung zur Abbildung in vivo und ex vivo mit den bildgebenden Protokoll wird die Abbildungsdauer. Während dieses ex vivo-Methode ist ein ausgezeichnetes Mittel, Studium akuten Verletzungen Mechanismen kann Bildgebung langfristig Längs axonalen Änderungen in der gleichen ex vivo Gewebesegment nicht machbar sein. Wir normalerweise Bild der isoliert Rückenmarksgewebe für 6-10 Stunden nach Liščí ohne nennenswerte Liščí unabhängige Gewebeschäden; wir haben jedoch eine Rückenmarksegment abgebildetebis zu 24 Stunden nach der Liščí mit moderater Gewebeabbau in keinem Zusammenhang mit der induzierten Verletzungen. Wenn jedoch ein Segment des Rückenmarks wurde für längere Zeit abgebildet, würde unweigerlich einige Gewebezerstörung, die von der Laserablation unabhängig ist. Trotz dieser Einschränkungen in unserer vorgeschlagenen Ex-vivo-Rückenmark Liščí Modell, das Wissen, das von dieser ex vivo-Bildgebung des Rückenmarks und Liščí Modell -von der neuartige Fähigkeit, zwischen primären und sekundären Verletzungen Verletzungen in Echtzeit auf die Bewertung der Wirksamkeit unterscheiden gewonnen werden können pharmazeutischer Wirkstoffe und Umwelt Manipulationen nach der verletzungs können wertvolle Einblicke in die Mechanismen der dynamischen axonalen und Myelin-Reaktionen nach einer Verletzung ergeben.

Degeneration von Axonen ist eine prominente Ursache für Morbidität über mehrere neurologischen Erkrankungen einschließlich Neurotrauma, Schlaganfall, Autoimmunerkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen. Im Gegensatz zu dem peripheren Nervensystem (PNS), Zentralnervensystem (ZNS) Axone haben eine begrenzte Kapazität zu regenerieren, sobald aufgrund sowohl intrinsische als auch extrinsische Barrieren (dh inhibitorische Moleküle axonale Wachstum während der Narbenbildung während der Myelindegeneration produziert und freigesetzt) ​​1 verletzt -7. Obwohl einige dieser Hindernisse wurden intensiv erforscht, therapeutische Interventionen Ziel, ZNS-axonale Degeneration verhindern, fördern robuste axonale Regeneration und Wiederherstellung funktions verbindend, begrenzt bleiben. Axone einmal von ihren Soma getrennt durchlaufen eine stereotype Prozess der Degeneration wie Waller-Degeneration, die durch axonalen Schwellungen, Sphäroid Bildung und eventuelle Fragmentierung (in 8 mit Beiträgen) gekennzeichnet ist bekannt. InDagegen ist der proximale Stumpf, der in Kontinuität mit dem Soma eines durchtrennten peripheren Axonen bleibt, bildet eine Schwellung an seinem Ende, Matrizen zurück zur nächsten Knoten Ranvier, und kann dann zu initiieren Wachstumskegel Aufstellung für nachfolgende axonale Regeneration eine wichtige Voraussetzung erforderlichen 9-11. Im Gegensatz dazu sind die proximalen Enden von axonalen vielen zentralen Axone bilden charakteristische &quot;endbulbs&quot; oder Einfahren Glühbirnen, nicht zu Wachstumskegeln bilden, und statt zurückzuziehen von der Verletzungsstelle, wo sie für die Monate nach der Verletzung 12-15 bleiben. Neben der primären axonalen Schädigung, können zusätzliche axonalen Schäden / Verluste auch Axone, die im Wesentlichen aus der anfänglichen Verletzung verschont auftreten. Diese verzögerte axonalen Verlust zunächst verschont Axone wird als Sekundär axonale Degeneration bezeichnet. Diese inhärente Reaktion von ZNS Axone Schädigung macht funktionale axonale Regeneration noch schwieriger Ziel im Gehirn und Rückenmark zu erreichen. Obwohl hallmarks der axonalen Schädigung (zB Sphäroidbildung, Rückzug Glühbirnen) wurden auch von post-mortem Gewebe und experimentellen Modellen der axonale Degeneration gekennzeichnet hat Aufklärung der molekularen Mechanismen dieser dynamischen Prozesse sind beschränkt. Die meisten dieser Studien angeführten statischen Endpunkt Beobachtungen, die von Natur gescheitert einzelne axonalen Antworten über die Zeit zu erfassen. Obwohl exogen applizierten axonalen Tracern nützlich gewesen zu axonalen Antworten von statischen Abschnitten und während der Live-Bildgebung zu klären, hat die Verfügbarkeit von genetisch kodierten axonalen Marker stark verbessert unsere Fähigkeit, Axone in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar zu machen. In der Tat, eine wegweisende Bericht Kerschensteiner und Kollegen zunächst vorgesehen unmittelbarer Nachweis der axonalen Degeneration und Regeneration in vivo mit Thy1 -GFP-S Mäuse, die das grün fluoreszierende Protein in Teilmengen von Neuronen, die ihre Projektionen in die Hinterstränge des Rücken senden kodierenKabel 16. Live-Imaging-Ansätze mit Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) und genetische fluoreszierende Protein Markierung von Zellen von Interesse nach wie vor direkte Beweise und mechanistischen Einblick in viele verschiedene dynamische Prozesse wie axonale Degeneration, Ca 2+ Signal, axonale Regeneration, Astrozyten Physiologie liefern, Mikroglia Physiologie und Reaktion auf eine Verletzung 17-25. Im Gegensatz zu den Axonen ist sehr wenig von Myelin Reaktionen auf Verletzungen in Echtzeit bekannt. Myelin ist ein wesentlicher Bestandteil der weißen Substanz produziert und von Oligodendrozyten im ZNS und Schwann-Zellen in der PNS erhalten. Myelin isoliert 99% der Oberfläche von Axonen und dadurch eine hochohmige, kapazitätsarme Schutzabdeckung, die eine schnelle und effiziente saltatory Impulsausbreitung, die kürzlich von Buttermore et al. 26 überprüft unterstützt. Um die Dynamik von Myelin, um Verletzungen verwenden wir die solvatochromen, lipophile erfassenFluoreszenzfarbstoff Nile Red 27. Solvatochromen Eigenschaften dieses Vitalfärbung erlauben Spektralverschiebungen seines Emissionsspektrums, das von der physikalisch-chemischen Umgebung 28,29 ist. Diese Eigenschaften sind nützlich, um Einblick in die Mechanismen der axomyelinic Verletzungen zu gewinnen und können mit entsprechend ausgewählten dichroitische und Emissionsfilter sichtbar gemacht oder gelöst mit spektralen Mikroskopie 27 werden. Zum Beispiel ist Nilrot Emissionsspektrum blau-verschoben in weniger polare lipidreichen Umgebungen, wie sie in Adipozyten und normale CNS Myelin (Spitzenemission ~ 580-590 nm) 27 gefunden. Im Gegensatz dazu Emissionsspektrum Spitzen dieser Vitalfarbstoff ist bei ~ 625 nm in endbulbs wie Axone gebildet ziehen axonalen Sterben 27. Obwohl die genauen Mechanismen dieser spektralen Verschiebungen speziell in endbulbs gegenüber normalen Myelin unklar bleiben, können solche spektralen Veränderungen zugrunde liegenden Veränderungen der Proteinakkumulation oder Desorganisation, die zu enthüllenExposition von hydrophoben Bindungsstellen 27. Während in-vivo-Bildgebung ist die entscheidende Messgröße für die Beobachtung des Rückenmarks axonalen Verletzungen Dynamik in ihrer natürlichen Umgebung, es ist technisch anspruchsvoll und erfordert erhebliche chirurgischem Know-how und oft wiederholen Operationen, um die dorsalen Säule, die experimentellen Artefakten führen kann ausgesetzt werden (zB Entzündungen und Narben Bildung). Außerdem ist teure Ausrüstung oft notwendig, um Suspendierung und Positionierung von einem intakten Tier unter der Mikroskopobjektivlinse ermöglicht. Die Tiere müssen sorgfältig überwacht werden, als auch, um sicherzustellen, bleiben sie warm, um sicherzustellen, Flüssigkeiten wieder aufgefüllt werden, und um sicherzustellen, gibt es keine Anzeichen von Hypoxie aufgrund längerer betäubt Imaging-Sitzungen. Letzteres ist äußerst wichtig, da Axone und Myelin unbedingt benötigen konstante Durchblutung und eine angemessene Sauerstoffgehalt lebensfähig zu bleiben. Dies ist jedoch oft nicht gemeldet oder in den meisten in-vivo-Studien zu überwachenDatum. Zusätzlich Bewegungsartefakte durch Herzfrequenz und Atmung (Isofluran erwachsenen Maus: ~ 300-450 Schläge pro Minute (BPM) ist optimal, um 97 bis 98% Sauerstoffsättigung (wie normal ~ 632 BPM) und pflegen ~ 55-65 Atemzüge pro min (normal ist ~ 163 Atemzüge pro min), beziehungsweise)) 30 während der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make begegnet differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie Herausforderung als auch die schnellsten Laserscans unvermeidlich unterliegen diese Bewegung Artefakte. Fortschritte in der ultraschnellen Resonanzscanner in Verbindung mit einem implantierbaren starren Wirbel gerahmte Fenster können Abbildung der Maus Rückenmark bei wachen Tieren zu ermöglichen, aber schnellere Scanzeiten zwangsläufig das Signal-Rausch-Verhältnis Bild erniedrigender Qualität. Weitere Verbesserungen in der Rückenmarksbildgebenden Verfahren, wie sie derzeit für die Bildgebung des Gehirns verwendet werden, können viele dieser Hindernisse zu überwinden und potenziellen verwechselt von ina eingeführt begrenzendequate Gewebedurchblutung, zB 31-33. Vieles, was über der weißen Substanz Physiologie und Mechanismen der weißen Substanz Verletzungen bekannt wurde nach den in vitro oder ex vivo Zubereitungen der weißen Substanz von Sehnerv, der peripheren Nerven und Bänder des Rückenmarks weißen Substanz 34 bis 41 bestimmt. Diese Präparate weiterhin unser Wissen über weißen Substanz Verletzungsmechanismen zu fördern, da sie ermöglichen eine kontrollierte Veränderungen der Umweltfaktoren, kontrollierte Anwendung von Arzneimitteln und Reagenzien, Funktionsprüfungen mit der Elektrophysiologie und die direkte Fluoreszenzmikroskopie Beobachtungen der Axone und Myelin in lebendem Gewebe. Doch einige frühere Ansätze zur Axone Rückenmark dorsalen Säule Streifen oder ventralen weißen Substanz Streifen beobachten unweigerlich verletzen Oberfläche Axone während der Entfernungsstufe, die die Reaktion von eng gegen Axone beeinflussen können. Um auf die experimentelle Manipulationen oben zu nutzen und vermeiden Schäden an der very Fasern untersucht, verwenden wir eine ex vivo Halsmark-Modell, da es einen direkten Kontakt der Dorsalseite des Kabels verhindert. Somit ist die Architektur der Pia und neben oberflächlichen dorsalen Säule Axone tragfähige und gelassen bleiben, während der Isolierung. Hier beschreiben wir eine relativ einfache Methode, die direkte Visualisierung von zentraler markhaltigen Axonen, da sie dynamisch mit einer Brenn Verletzungen in Echtzeit bis zu 8 reagieren können - 10+ Stunden nach der Verletzung. Die laserinduzierte Verletzung des Rückenmarks (Liščí) Modell erlaubt die Unterscheidung zwischen primären und sekundären axonalen Verletzungsmechanismen als primäre Läsion (Ablationsstelle) bleibt räumlich über die Zeit eingeschränkt. Die Open-Bad Abbildungskammer ist zugänglich für eine therapeutische Intervention, Reagenz Lieferung und Umwelt Manipulationen. Vermeintliche axomyelinic Schutzmittel lassen sich schnell in Echtzeit durch direkte Beobachtungen gegenüber langwierigen und kostenintensiven Experimenten mit Gewebeprozess bewertet werdening, Schneiden, Immunfärbung, Bildaufnahme und Analyse und daher eine nützliche Ersatzmodell zu akuten Reaktionen und Schutz Manipulationen vor der Prüfung die experimentellen Agenten mit lebenden Tieren zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Verletzte CNS Axone nicht zu regenerieren und oft zurückziehen von der Verletzungsstelle. Axone aus der anfänglichen Verletzung verschont später sekundärmetallurgisch axonale Degeneration. Mangel an Wachstumskegel Bildung, Regeneration, und der Verlust von weiteren markhaltigen Axonen Projektionen im Rückenmark stark einschränkt neurologische Erholung nach einer Verletzung. Um zu beurteilen, wie zentral myelinisierten Axone im Rückenmark, um Verletzungen zu reagieren, haben wir eine ex vivo lebenden Rückenmark-Modell unter Verwendung von transgenen Mäusen, die gelb fluoreszierenden Proteins in Axonen und eine Brenn und hoch reproduzierbare Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen zum Ausdruck bringen, um das Schicksal zu dokumentieren Axone und Myelin (lipophilen Fluoreszenzfarbstoff Nile Red) im Laufe der Zeit mit Zweiphotonenanregung Zeitraffer-Mikroskopie. Dynamische Prozesse wie akute axonale Verletzung, axonale Retraktion und Myelin-Degeneration sind am besten in Echtzeit untersucht. Doch die Nichtschwerpunkt Natur Prellung basierte Verletzungen und Bewegungsartefakte auftretenwährend der in-vivo-Bildgebung des Rückenmarks Make differen primären und sekundären axonalen Verletzungen Reaktionen mit hochauflösenden Mikroskopie Herausforderung. Der Ex-vivo-Rückenmark-Modell hier beschriebenen imitiert verschiedene Aspekte der klinisch relevanten Prellung / Kompression induzierte axonalen Pathologie einschließlich axonalen Schwellungen, Sphäroidbildung, axonalen Durchtrennung und peri-axonalen Schwellungen ein nützliches Modell, um diese dynamischen Prozesse in Echtzeit zu studieren. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind ausgezeichnet räumlich-zeitliche Auflösung, die Differenzierung zwischen Primär- Beleidigung, die direkt verletzt Axonen und sekundären Verletzungsmechanismen ermöglicht; kontrollierte Infusion von Reagenzien direkt auf den Perfusat Bade das Kabel; präzise Änderungen der Umgebungsmilieu (zB Calcium, Natriumionen, bekannt Beitrag axonale Verletzung, aber praktisch unmöglich, in vivo zu manipulieren); und Maus-Modelle bieten auch einen Vorteil, da sie die Möglichkeit bieten, zu visualisieren und zumanipulieren genetisch identifizierten Zellpopulationen und subzellulärer Strukturen. Hier beschreiben wir, wie die Isolierung und das lebendige Bild Rückenmark von Mäusen, um die Dynamik der akuten axonalen Verletzungen zu erfassen.

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Aufrufe.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Serie: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Live-Imaging von Spinalganglien Axone nach Rhizotomie

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser-Nanochirurgie der Kleinhirn-Axone<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging der Maus Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Photothrombosis induzierte fokale Ischämie als ein Modell der Rückenmarksverletzungen in Mäusen

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Medizin

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Eine Drosophila In Vivo Verletzungen Modell für das Studium Neuroregeneration in den peripheren und zentralen Nervensystems

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

Echtzeit-Beurteilung der Rückenmarksmikroperfusion in einem Schweinemodell der Ischämie/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Ein

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