Name: an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time
Uploaded: 2014-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri Federal düzenlemelere bağlı kalarak, Louisville Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından belirlenen kurallar çerçevesinde gerçekleştirildi. Düşük Ca 2+ ve 2 mM Ca 2 + Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (aCSF) 1. hazırlanması guruplarına <ol><li> Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi 2x düşük Ca 2 + (0.1 mM) Stok C tampon, 2x, normal Ca 2 + (2 mM) Stok bir tampon ve 2x Stok B tampon hazırlayın. Bireysel stok solüsyonları iyon içeriği değiştirilmesine izin (örn, düşük ya da sıfır, Ca + 2) ve bir aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Diseksiyon sırasında intrakardiyak perfüzyon için, 1x düşük Ca 2+ aCSF yapmak için plastik bir şişenin içine 2x düşük Ca 2 + Stok C 100 ml ve 2x Stok B 100 ml ekleyin. Mix ve 4 ° C&#39;de gece boyunca saklamak veya taze yapmak. </li><li> Imag sırasında ex vivo olarak omuriliğin perfüzyon içining 1x aCSF oluşturmak için bir 1 L&#39;lik bir cam şişe içine 2 x normal bir Ca + 2 Hazır A 500 ​​ml ve 2 x stok B 500 ilave edin. Karıştırınız ve oda sıcaklığında gece boyunca depolamak ya da taze olun. </li><li> 7.4 aCSF tampon pH ayarlayın. Oda sıcaklığında aCSF tutarken, buz üzerinde düşük Ca 2 + aCSF yerleştirin ve kabarcık karbojen gazı ile iki tampon (% 95 O2;% 5 CO2) 30 dakika önce, perfüzyon sırasında sürekli olarak kullanmak için. </li></ol> Ex Vivo Görüntüleme Odası 2. Hazırlık <ol><li> ACSF şişe etrafında bir ısıtma battaniye (hayır otomatik kapanır) sarın ve düşük / orta ayarda ısı ayarlayın. </li><li> Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi iki kutuplu bir sıcaklık kontrol ve geri besleme sıcaklık probu vasıtasıyla kontrol edilir ısıtıcı bir perfüzyon pompaya ve hat-içi bağlı şişe içine özel bir CSF perfüzyon hattı yerleştirin. </li><li> 2-foton uyarma / conf düz bir mikroskop sahne eki (152 x 102 mm) takınocal mikroskop sahne bir dökülme kabı ile donatılmış. </li><li> Büyük bir açık-banyo perfüzyon odasına yerleştirin (G x U x Y; 12 x 24 x 8 mm) dökülme kabına (uygun ex Şekil 1B görmek uyum ve ex vivo omurilik taze oksijenli aCSF sürekli akışını sağlamak için ) odası tasarımı görüntüleme vivo. </li><li> Uygun boru kullanılarak ex vivo görüntüleme odasının giriş-line ısıtıcının metal çıkış portuna bağlayın. Görüntüleme sırasında tampon / doku sıcaklığını korumaya yardımcı olmak için, ex vivo görüntüleme odasının altında ince bir emici pedi yerleştirin. </li><li> Çıkarılabilir yapışkan yapışma kullanarak dökülme konteyner / sahne ucun altına ex vivo görüntüleme odasına uyun. yapışkan tack malleability AMAÇ ışık yolu doku yüzeyine dik olduğundan emin olmak için gerektiği gibi odası ayarlanır sağlayacaktır. Gerekirse, bölme ayarlamak için bir daireye düzeyini kullanır. </li><li> Güvenli birbölmesi sıvı girişinin yakınına, ısıtıcısı geri besleme sıcaklık probu ve oda çıkışında bir elektrik hattına bağlı bir paslanmaz çelik emme tüpü. Manyetik bant ve uygun mikropipet sahipleri, bu bağlamda da faydalıdır. Vakum kaynağı açın. </li><li> Oksijenli aCSF ile görüntüleme odasını dolduran başlamak için perfüzyon pompası açın. Dakika başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlayın. </li><li> Vakum hattı ayarlayarak görüntüleme odasında aCSF düzeyini kontrol eder. Bu omurilik kesimi kapsayacak ve su daldırma objektif ve doku yüzeyi arasında yeterli çalışma mesafesi sağlamak için görüntüleme odasının yeterli aCSF olması önemlidir. Doku segmenti tamamen için deneyci kaynaklı eserler önde gelen taze oksijenli aCSF altındayken değilse miyelin ve akson zararlı etkilenebilir. </li><li> Görüntüleme odasında o perfüzyon sıcaklığı oda sıcaklığına yakın yani in-line ısıtıcı sıcaklık kontrolörü ayarlayın. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Yetişkin Kemirgen Servikal Omurilik diseksiyonu <ol><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi sodyum pentobarbital (200 mg / kg) aşırı dozda enjekte edilerek bir yetişkin, 6-10 haftalık thy1 -YFP transjenik fare (Dorsal kök ganglion nöronlarının floresan protein ekspresyonu sahip kullanılması uygun suş) ile öldürülür. </li><li> Bir kez anestezi seviyesinin doğru (örneğin, ayak tutam ve göz kırpma refleksinin kaybı yok reaksiyon), dikkatle cerrahi makası ile omurilik ve beyin örten cilt tıraş altında. Betadin ve% 70 etanol yastıkları kullanarak cildi temizlemek. </li><li> % 70 etanol ile göğüs / karın alan Sprey, daha sonra soğutulmuş, karbojen-kabarmış düşük Ca kullanarak transkardiyal konuyu serpmek 2+ aCSF. (Bakınız Şekil 1C önerilen diseksiyonu tezgah üst kurmak). </li><li> Karaciğer sönük kalır gibi, küçük bir klip kullanarak kalbin içine perfüzyon iğne sabitleyin. Traş dorsal yüzü erişmek için konu üzerinde çevirinkonu ve% 70 etanol ile traş bölgeyi silin. </li><li> Beyin ve omur sütunu (Şekil 2A) maruz diseksiyon makas kullanarak kalça burun başlayarak orta hat boyunca dorsal cilt kesi yapmak. Burun ve kalça de işaretçilerine koyarak hazırlık sabitleyin. </li><li> Bu noktada bir diseksiyon mikroskop kullanarak, sıkıca koku ampuller düzeyinde kafatasının dorsal yüzeyi boyunca kesti. Kesi lateral kenarları içine makas ipuçlarından birini yerleştirin ve bilateral beyincik kadar takke kenarlarında kesilmiş. NOT: diseksiyon boyunca omurilikten örten doku kaldırmak için daha sonra gerekli gibi tamamen takke tüketim etmeyin (Şekil 2B bakınız). </li><li> Beyin maruz takke kaldırın. Yavaşça (beyincik bulunan) interparietal kemik sol ve sağ kenarları kesilmiş ve (beyin sapı / omurilik maruz kaudal geri Şekil 2C çekin </strong&gt;). </li><li> Masa yüzeyine 45 ° açıda ince uçlu makas kullanın ve posterior sinir köklerine ikili sadece alt vertebra kesti. NOT: Parlak beyaz dorsal sütunları ile temastan kaçının. Bu lifler (Şekil 2B) yansıması olacak ve kolayca zarar görebilir olanlardır. </li><li> Keser omuriliği ortaya çıkarmak için yapılır gibi yavaşça tek parça örten doku çekerek, ince uçlu forseps ile vertebral kolonun takke ve dorsal yüzeyini kaldırın. Sonraki görüntüleme (Şekil 2E) servikal kord 1-2 cm&#39;lik bölümünü izole etmek üst torakal düzeyde vertebra kesmeye devam. </li><li> Sütununun altında vertebral kolon ve net dokuya doku / kemik paralel kesmek için makas kullanın. Mümkün olduğunca aynı seviyede bu kesim yapmak. Kord görüntüleme için seviyede olacak şekilde doku bölmesi içinde olmasını sağlayacak çok önemlidir. </li><li> Geçmiş (beyin sapı transect için 11. neşter kullanıngracile fasikül liflerin) ve servikal spinal kord segmenti izole üst torakal düzeyde sonlandırma () Şekil 2F Bkz. Bu aynı iki noktada doku / kemik kesmek için makas kullanın. İzole doku kuyruk beyin sapı, servikal genişleme ve üst torakal spinal kord (Şekil 2G) kapsayan vertebral kolonun 2/3 içermelidir. </li><li> Karbojen-kabarmış, soğutulmuş düşük Ca bir petri 2+ aCSF içine izole omuriliğe yerleştirin. Gerekirse bu çanak düz yatıyor kadar, omurganın altında doku kırpın. </li><li> Ex vivo görüntüleme odasına izole belkemiğine aktarın ve 36 için 1 saat boyunca perfüzyon sıcaklık artışı - 37 ° C. Görüntüleme sırasında bu sıcaklığı korumak. </li></ol> Nil Kırmızı Görüntüleme Odası ve Miyelin Etiketleme içine Ex Vivo Omurilik 4. Yerleştirme <ol><li> Dikkatle i vertebra sütun güvenliğiniUygun bir montaj dilim ile maging odası aşağı ince lycra parçacığı oluşan dikey ızgara platformu ile modifiye tutun (Şekil 3A görmek omurilik için yer sağlamak için ızgara platformu orta Konuları kaldırmak). </li><li> (DMSO içinde 5 mM&#39;lik bir stok ve süzüldü 0.22 um, 4 ° C, ya da karanlıkta -20 ° C&#39;de 6 ay, 1 ay boyunca saklanabilir) Nil kırmızısı bir kısım çözülme. Sadece görüntüleme odasına Nil Kırmızı eklemeden önce, perfüzyon pompa akışını azaltmak ve odasında sıvı daima omuriliği kapsar emin olmak için vakum hattı ayarlayın. </li><li> Kord (Şekil 3B) kaudal ucuna yakın görüntüleme odasına 5-10 ul Nil Kırmızı stok solüsyonu ekleyin. Yavaşça oda boyunca, Nil Kırmızısı karıştırmak için 1 ml pipet kullanın. Nil Kırmızı, sonra 1-2 dakika odasında kalmak geri vakum hattı koyun ve sürekli omuriliği serpmek için min başına 1.5-2 ml perfüzyon pompası ayarlamak için izin ver. </li><li> Dikkatle mikroskop sahne yükseltmeksuya daldırma hedefi odasında aCSF yüzeyinden yaklaşık 10 mm kadar ve omurilik segmentinin merkezi ve medial dorsal sütunlar üzerinde hedefi hizalayın. Hafifçe aCSF yüzeyine temas edene kadar yavaşça aşağıya hedefi getirmek için mikroskop burun parçası odak tekerleğini kullanın. Görüş alanı (Şekil 3C) içine dorsal sütunları odaklanmak bir epifluorescent ışık kaynağı kullanın. </li></ol> TPLSM ve Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Fare Omurilik 5. Ex Vivo Görüntüleme (Lisci) Not: arka damar ince yapılı fasikül elyafları gibi doku merkezi için yararlı bir marker sağladığını (sırt kök ganglion hücre gövdesinden çıkan ve T6 arasından çıkmak ve aşağıdaki omurilik orta hat boyunca), bu kan damarı paralel uzanır. kalın YFP + servikal dorsal kök projeksiyonları da lifler yükselmek gibi yararlı bir işaretleyici sağlamak ve Y yanal inmekKüçük bir çapa sahip olan AP + ince yapılı fasikül lifleri. <ol><li> Spinal kord dokusu uygun hizalanmış sonra, lazer tarama moduna geçiş artan gracile fasikül miyelinli liflerin temel görüntüleme gerçekleştirmek için. Hem YFP ve Nil Kırmızı heyecanlandırmak için, floresan emisyon izole etmek 950 nm dalga boyunda (~ bir 25X, 1.1 NA amacı çıkışında ölçülen 17 mW) ve uygun dichroics (DM) ve bant geçiren filtreler için ayarlanmış bir iki-foton lazer kaynağı kullanın fluorophores (biz sarı-turuncu, kırmızı ve genişletilmiş kanalları, sırasıyla içine YFP ve Nil Kırmızı ayırmak için, 525/50 DM560, 600/60 DM640 ve 685/70 kullanın). <ol><li> Akson fazla% 3 temel görüntüleme (30-60 dakika) sırasında aksonal sferoidler gösteriyorsa nedeniyle deneyci kaynaklı eserler hazırlık atın. </li></ol></li><li> 30.3X görüş alanını büyüterek bir Lisci indükleyin (bir ~ 20 mikron çapında ablasyon oluşturmak için). Dinle 800 nm lazer ve en ~ 110 mW için lazer gücünü artırmakÖrnek. Lifler tamamen transeksiyon sağlamak için görünüm lazer taramaları 5 tam alanını izin verin. </li><li> (Numune, 2.08X de 950 nm, 17 mW) görüntüleme ayarlarına geri lazer ayarlarını değiştirerek Lisci onaylayın ve ablasyon görselleştirmek için doku tarayın. Ablasyon çapını doğrulayın ve birincil ablasyon aksonlar tamamen transeksiyon olduğunu (Şekil 3D bakınız). Yaralanma sonrası 8-10 + saat kadar yaralanma akson ve miyelin dinamik tepkisini kaydetmek için z yakalama ile birlikte mikroskop zaman atlamalı ayarlarını kullanın. NOT: ablasyon eksik ise (yani, liflerin eksik yaralanması), şaşırmış olacak birincil ve ikincil yaralanma mekanizmalarının belirlenmesi gibi, hazırlık atın. Buna ek olarak, izole spinal kord segmentleri Lisci bağımsız doku hasarı orta sadece hafif 24 saat sonrası Lisci kadar görüntülü olabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS.">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).</li><li>Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+regulating+axon+regeneration:+an+integrin+perspective.">Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective.</a> Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).</li><li>McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+factors+in+combinatorial+approaches+for+spinal+cord+regeneration.">Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration.</a> Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).</li><li>Pernet, V., Schwab, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Nogo-A+in+axonal+plasticity,+regrowth+and+repair.">The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).</li><li>Bradbury, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chondroitinase+ABC+promotes+functional+recovery+after+spinal+cord+injury.">Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury.</a> Nature. 416, 636-640 (2002).</li><li>Cregg, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+beyond+the+glial+scar.">Functional regeneration beyond the glial scar.</a> Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).</li><li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN/mTOR+pathway.">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+wld(s),+and+nmnat.">Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Sulaiman, W., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+peripheral+nerve+injury,+regeneration,+and+functional+recovery:+from+bench+top+research+to+bedside+application.">Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application.</a> Ochsner J. 13, 100-108 (2013).</li><li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy:+the+precursor+to+axon+regeneration.">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).</li><li>Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganized+microtubules+underlie+the+formation+of+retraction+bulbs+and+the+failure+of+axonal+regeneration.">Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration.</a> J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).</li><li>Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+axonal+degeneration+'dieback'+in+the+corticospinal+tract+after+transection+injury+of+the+rat+spinal+cord:+a+confocal+microscopy+study.">Retrograde axonal degeneration 'dieback' in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study.</a> J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).</li><li>Fishman, P. S., Mattu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+severed+cortical+projection+axons.">Fate of severed cortical projection axons.</a> J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).</li><li>McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+activated+phagocytes+and+myelin+degeneration+to+axonal+retraction/dieback+following+spinal+cord+injury.">The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury.</a> Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+treatment+reduces+delayed+oligodendrocyte+death,+attenuates+axonal+dieback,+and+improves+functional+outcome+after+spinal+cord+injury.">Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+laser-scanning+microscopy+of+Ca2++dynamics+in+visual+motion-sensitive+neurons.">In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).</li><li>Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+of+cortical+astrocytic+networks+in+vivo.">Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo.</a> PLoS Biol. 2, 96 (2004).</li><li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-+and+short-term+intravital+imaging+reveals+differential+spatiotemporal+recruitment+and+function+of+myelomonocytic+cells+after+spinal+cord+injury.">Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury.</a> J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).</li><li>Canty, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+single+neuron+axotomy+triggers+axon+regeneration+to+restore+synaptic+density+in+specific+cortical+circuits.">In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits.</a> Nat Commun. 4, 2038 (2013).</li><li>Dibaj, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NO+mediates+microglial+response+to+acute+spinal+cord+injury+under+ATP+control+in+vivo.">NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo.</a> Glia. 58, 1133-1144 (2010).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Nimmerjahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microglia+in+the+mouse+cortex+in+vivo.">Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).</li><li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo.">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen-induced+perivascular+microglial+clustering+is+required+for+the+development+of+axonal+damage+in+neuroinflammation.">Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation.</a> Nat Commun. 3, 1227 (2012).</li><li>Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+maintenance+of+molecular+domains+in+myelinated+axons.">Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons.</a> J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).</li><li>Stirling, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+2-mediated+alternative+activation+of+microglia+is+protective+after+spinal+cord+injury.">Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury.</a> Brain. 137, 707-723 (2014).</li><li>Greenspan, P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrofluorometric+studies+of+the+lipid+probe,+nile+red.">Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red.</a> J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).</li><li>Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nile+red:+a+selective+fluorescent+stain+for+intracellular+lipid+droplets.">Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets.</a> J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).</li><li>Tajima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+hemodynamic+response+to+acute+hyperoxia+in+awake+mice.">Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice.</a> Brain Res. 1557, 155-163 (2014).</li><li>Andermann, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+white+matter+in+central+nervous+system+pathophysiologies.">Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies.</a> ASN Neuro. 4, (2012).</li><li>Matute, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dyshomeostasis+in+white+matter+pathology.">Calcium dyshomeostasis in white matter pathology.</a> Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).</li><li>Stys, P. K., Lipton, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+matter+NMDA+receptors:+an+unexpected+new+therapeutic+target.">White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target.</a> Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).</li><li>Baltan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+anoxia:+a+tale+of+two+white+matter+tracts.">Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts.</a> Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).</li><li>Stirling, D. P., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yüzey görüntüleme ex vivo olarak omurilik miyelinli aksonlar (yani, ince yapılı fasikül) zaman içinde hem birincil hem de ikincil miyelinli aksonal dejenerasyon dinamik ilerlemesini incelemek için bir lazer kaynaklı, omurilik yaralanması ile birleştirildi. Ex vivo görüntüleme için bir yöntem tarif Omurilik gibi hareket eserler ve uzun süreli görüntüleme oturumları sırasında deneyci kaynaklı hipoksi potansiyeli olarak in vivo görüntüleme ile ilişkili komplikasyonların çoğu üstesinden gelir. Bu protokol oksijenli guruplarına düşük Ca içeren 2+ ve örten aksonal liflerin hasar, dorsal sütun veya ventral beyaz cevher şerit hazırlıkları sırasında sık karşılaşılan gerileme önler kullanarak omuriliğin tüm servikal segmenti ayırır. Ayrıca önce veya Ca örneğin, modifikasyonu (omurilik yaralanması aşağıdaki izole spinal kablonun mikroçevresinin işlemek için araştırmacı sağlar 2+konsantrasyon ve / veya farmasötik reaktiflerin eklenmesi). Transeksiyon, kontüzyon veya akson geniş bir alanı etkileyebilir SCI modelleri ezmek aksine, Lisci son derece odaklı doğası birincil yaralanma (transected akson) ve daha sonra meydana gelen ikincil akson hasarı aynı anda çalışma sağlar. tarif edilen ex vivo görüntüleme ve LISCI protokol demiyelinizasyon, mikroglia dahil olmak üzere merkezi sinir sistemi bulunan bağışıklık hücreleri tarafından uyarılan nöro ve anoksik / iskemik hasar mekanizmaları da dahil olmak üzere beyaz madde yaralanma diğer bileşenleri araştırmak için kullanılabilir. Diğer yüzeysel bulunan spinal beyaz cevher yolları görüntüye yapılabilir geçerli protokol veya değişiklikler gibi bu çalışmalar da dorsal kolon akson odaklanmak olabilir. Ayrıca, diğer transjenik veya çift transgenik fare suşları, aynı zamanda merkezi sinir sistemi bulunan hücrelerin aktivasyonu / aktivitelerini incelemek için bu protokol ile kullanılabilir. Pek çok kritik con vardırex vivo omurilik, bir murin başarılı izolasyonu ve görüntüleme için uzaklaştırmıştır. Birincisi, aCSF tamponlar hipoksi önlemek için oksijenli tuttu gerekir. Spinal kord sırasında ve izolasyondan sonra oksijenli aCSF batık edilerek nemli tutulmalıdır. Diseksiyon sırasında, bu tür omurga segmenti altında doku temizlerken omuriliği bükme / çok sıkıca örten doku geri çekerek ve germe gelen aşırı basınç gibi omurilik mekanik stres en aza indirmek için en iyisidir. Üstelik / dokunmatik omurilik dorsal sütunları sıkıştırmak asla önemlidir. Bir hipertermik ortamda omurilik dokusu stres olabilir çünkü görüntüleme odasının optimum aCSF perfüzyon sıcaklığı bakımı da önemlidir. Aksonlar tamamen Lisci sırasında nakledilmiş olduğundan emin olmak için, bu lazer ablat sırasında potansiyel doku hareketini en aza indirmek için ex vivo odasında doku segmenti hareketsiz önemlidiriyonu temsil etmektedir. Ayrıca istenilen ablasyon yerinde doku (objektif lens dik) görüntüleme odasında düz durmalıdır. Lisci seviyesi değil sonraki görüntü analizi komplike ve genel görüntü netliğini azaltır eğik ablasyon neden doku üzerinde gerçekleştirdi. Son olarak, lazer ablasyon doku derinliği Lisci sonuçlarını etkileyebilir. Biz ablasyon civarında 12-15 mikron pia mater altında olması için odak noktası ayarlamanızı öneririz. Akson ve miyelin yaralanma mekanizmaları incelemek için bu ex vivo görüntüleme yöntemi kullanılarak önemli bir sınırlama Lisci aşağıdaki periferik kanından alınan hücrelerin etkileri tespit edilemez olduğunu. Bu bir terminal modelidir Dahası, yaralanma aşağıdaki davranışsal ve rejenerasyon sonuçları değerlendirildi edilemez. In vivo görüntüleme ile paylaşılan bu ex vivo Lisci görüntüleme modeli bir kısıtlama nedeniyle güçlü ışık sc karar olma yeteneğine sahip derinliğiOmurilik beyaz maddenin özelliklerini içeriğinde değişikler yapmak. Böylece, bu ex vivo omurilik görüntüleme modeli, öncelikle omurilik dorsal yüzeyi boyunca yer beri görselleştirmek için en erişilebilir lifler dorsal kök ganglion duyusal nöronlar artan merkez projeksiyonlar üzerinde duruluyor. Böyle bu protokol belgelenen artan duyusal akson kıyasla yaralanma sonrası farklı tepki verebilir, motor aksonlar azalan gibi diğer miyelinli akson yolları. In vivo ve bizim ex vivo görüntüleme protokolü ile hem görüntüleme için başka bir ortak sınırlama görüntüleme süresi. Bu ex vivo yöntem akut yaralanma mekanizmaları okuyan mükemmel bir araç iken, aynı ex vivo doku segmentinde görüntüleme uzun vadeli boyuna aksonal değişiklikler olanaksız olabilir. Biz normalde görüntü herhangi bir kayda değer Lisci bağımsız doku hasarı olmadan Lisci sonra 6-10 saat izole omurilik dokusu; Ancak, biz bir omurilik segmenti görüntülü varkaynaklı yaralanma ilgisiz sadece orta doku bozulması ile 24 saat sonrası Lisci kadar. Spinal kord segmenti uzun süre için görüntülendi Ancak, kaçınılmaz lazer ablasyon bağımsız olan bazı doku dökümü olacaktır. Bizim teklif ex vivo omurilik Lisci modelinde bu sınırlamalara rağmen, yeni yeteneği etkinliğini değerlendirmek için gerçek zamanlı olarak birincil ve ikincil yaralanma yaralanma ayırt -kalkış bu ex vivo omurilik görüntüleme ve Lisci modeli elde edilebilecek bilgi İlaç reaktifler ve çevresel manipülasyonlar yaralanmas yaralanma aşağıdaki dinamik akson mekanizmaları ve miyelin yanıtları içine değerli fikir verebilir sonra.

Akson Dejenerasyon nörotravma, inme, otoimmün ve nörodejeneratif hastalıklar dahil olmak üzere birçok nörolojik koşulları kapsayan morbidite önemli bir nedenidir. Periferik sinir sistemi (PNS), santral sinir sistemi aksine (MSS) aksonlar kez nedeniyle iç ve dış engelleri (yani, miyelin dejenerasyonu sırasında skar oluşumu sırasında üretilen ve serbest aksonal büyüme inhibitör molekülleri) 1 hem yaralı yenilemek için sınırlı bir kapasiteye sahip -7. Bu engellerin çeşitli yaygın araştırdı olmasına rağmen, tedavi amaçlı müdahaleler, MSS akson dejenerasyonu önlemek sağlam aksonal rejenerasyonu teşvik ve fonksiyonel connectively geri, sınırlı kalmaktadır. Bir kez soma ayrılmış aksonlar akson şişlik, sfero oluşumu ve (8 gözden) nihai parçalanma ile karakterizedir Wallerian dejenerasyon olarak bilinen dejenerasyonun bir basmakalıp sürecine tabi. Içindekontrast, nakledilen periferik akson soma ile süreklilik kalır proksimal güdük, sonraki aksonal rejenerasyon için hayati bir ön koşul gerekli, bir ucunda şişlik oluşturan geri Ranvier yakın düğüme ölür, ve sonra büyüme konisinin oluşumunu başlatabilir 9-11. Buna karşılık, birçok aksonlarda proksimal akson uçlarının, karakteristik &quot;endbulbs&quot; veya retraksiyon ampuller oluşturan büyüme konileri oluşturur, ve bunun yerine uzak onlar yaralanma 12-15 sonraki ay kalır yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. Primer aksonal hasara ek olarak, ek akson hasarı / kaybı da büyük ölçüde ilk yaralanma bağışladı akson oluşabilir. Başlangıçta bağışladı akson Bu gecikmiş akson kaybı gibi ikincil aksonal dejenerasyon denir. Yaralanma MSS akson Bu doğal tepki fonksiyonel aksonal rejenerasyon beyin ve omurilikte ulaşmak için daha da zor hale golü. Ha ne kadaraksonal yaralanma (örneğin, sfero oluşumu, retraksiyon ampuller) ve llmarks iyi ölüm sonrası doku ve aksonal dejenerasyon deneysel modellerden karakterize edilmiştir, bu dinamik süreçleri altında yatan moleküler mekanizmaların aydınlatılması sınırlı olmuştur. Bu çalışmaların çoğu doğal zamanla bireysel akson yanıtları yakalamak için başarısız statik uç nokta gözlemlere dayanıyordu. Gerçi dışsal olarak aksonal izleyiciler statik bölümlerden ve canlı görüntüleme sırasında aksonal yanıtları aydınlatmak için yararlı olmuştur uygulanan genetik olarak kodlanmış aksonal belirteçlerin kullanılabilirliği floresan mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı olarak aksonlar görselleştirmek için yeteneğimizi oldukça geliştirdi. Nitekim, Kerschensteiner ve meslektaşları bir seminal rapor ilk spinal dorsal sütunları kendi projeksiyonlarını göndermek nöronların alt kümelerinin yeşil floresan proteinini kodlayan Thy1 GFP-S fareleri kullanarak in vivo aksonal dejenerasyon ve rejenerasyon doğrudan kanıt sağladıkord 16. Canlı görüntüleme iki foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM) kullanarak yaklaşımları ve ilgi hücrelerin genetik floresan protein etiketleme gibi aksonal dejenerasyon, Ca 2 + sinyalizasyon, aksonal rejenerasyon, astrosit fizyolojisi gibi birçok farklı dinamik süreçlere doğrudan kanıt ve mekanik anlayış vermeye devam mikrogliyal fizyolojisi ve yaralanma 17-25 yanıt. Akson aksine, çok az gerçek zamanlı olarak yaralanma miyelin tepkilerinin bilinmektedir. Miyelin PNS CNS ve Schwann hücrelerinde oligodendrositler tarafından üretilen ve tutulan beyaz cevherin önemli bir bileşenidir. Miyelin akson yüzeyinin% 99 yalıtım ve böyle yaparak son zamanlarda Buttermore ark. 26 tarafından gözden hızlı ve verimli saltatory darbe yayılımını destekleyen bir yüksek direnç, düşük-kapasite koruyucu kaplama sağlar. Biz solvatokromik, lipofilik kullanmak yaralanma miyelin dinamik tepkisini yakalamak içinFloresan boya Nil kırmızısı 27. Bu hayati leke solvatokromik özellikleri fiziko-kimyasal ortamına 28,29 bağlıdır emisyon spektrumunun spektral vardiya izin verir. Bu özellikler axomyelinic yaralanma mekanizmaları anlamak için yararlıdır ve uygun seçilmiş dichroics ve emisyon filtreleri kullanılarak görüntülendi veya spektral mikroskopi kullanılarak 27 çözülebilir. Örneğin, Nil Kırmızısı emisyon spektrumu mavi-kaydırılmış örneğin adipositler ve normal bir merkezi sinir sistemi miyelin (tepe emisyon ~ 580-590 nm) 27 bulunan bu gibi daha az polar lipid bakımından zengin ortamda bulunmaktadır. Buna karşılık, ~ 625 nm akson olarak oluşturulmuş endbulbs içinde bu hayati boyanın emisyon spektrumu zirveleri aksonal tepe kurumalarına 27 uğrarlar. Normal miyelin karşı endbulbs içinde özellikle bu spektral vardiya altında yatan kesin mekanizmalar belirsiz kalmasına rağmen, bu tür spektral değişiklikler, protein birikimi veya dağınıklığı yol altında yatan değişiklikler gösterebilirhidrofobik bağlama bölgelerinin 27 maruz kalma. In vivo görüntüleme kendi doğal ortamında omurilik aksonal yaralanma dinamiklerini gözlemlemek için nihai metrik iken, bu teknik açıdan zor ve önemli bir cerrahi uzmanlık gerektirir, ve sık sık (örneğin, inflamasyon ve yara deneysel eserler tanıtmak olabilir dorsal sütun açığa ameliyatları tekrar formasyonu). Buna ek olarak, pahalı ekipman genellikle mikroskop objektif mercek altında sağlam bir hayvanın süspansiyon ve konumlandırma izin vermek için gereklidir. hayvanlar dikkatle sıvılar doldurulan sağlamak için, nedeniyle uzamış anestezi görüntüleme oturumlara hipoksi hiçbir işaret olmadığından emin olmak için, sıcak kalmasını sağlamak için de izlenmesi gerekir. akson ve miyelin kesinlikle canlı kalması için sürekli perfüzyon ve yeterli oksijen seviyelerini gerektiren ikinci derece önemlidir. Ancak, bu genellikle bildirilen veya in vivo çalışmalar çoğu izlenmeztarihi. Buna ek olarak, kalp hızı ve solunum için hareket eserler (izofluran yetişkin fare anestezi: ~ dakika başına 300-450 atım (BPM)% 97-98 oksijen doygunluğunu (Normal oranı ~ 632 BPM) ve korumak için en uygunudur ~ 55-65 nefes dakika başına kaçınılmaz bu hareketin tabidir sırasıyla)) 30 bile hızlı lazer taramaları zorlu yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında karşılaşılan (Normal oranı ~ 163 dk başına nefes olduğunu) eserler. Uyanık hayvanlarda kemirgen omurilik görüntüleme izin verebilir bir implante sert vertebra çerçeveli pencere ile kombine ultra hızlı rezonans tarayıcıları gelişmeler, ancak daha hızlı tarama kez kaçınılmaz gürültü oranı aşağılayıcı görüntü kalitesi sinyali azaltır. Şu anda beyin görüntüleme için kullanılan spinal kord görüntüleme tekniklerindeki gelişmeler daha fazla bu engellerin birçoğu üstesinden gelmek ve ina tarafından tanıtıldı potansiyel boşa sınırlayabilirdequate doku perfüzyon, örneğin, 31-33. Beyaz cevher fizyolojisi ve beyaz cevher hasarı mekanizmaları hakkında bildiklerimizin çoğu vitro veya optik sinir, periferik sinir ve omurilik beyaz madde 34-41 şeritler beyaz madde ex vivo hazırlıklarında kullanılarak tespit edilmiştir. Çevresel faktörler değişiklikleri, canlı doku uyuşturucu ve reaktiflerin kontrollü uygulama, elektrofizyoloji kullanarak fonksiyonel değerlendirmeler ve akson doğrudan floresan mikroskop gözlemleri ve miyelin kontrollü izin gibi bu hazırlıklar beyaz cevher hasarı mekanizmaları bilgimizi ilerletmek için devam ediyor. Ancak, daha önceki bazı yaklaşımlar kaçınılmaz yakından karşı akson yanıtı etkileyebilir çıkarma aşamasında yüzey aksonları zarar omurilik dorsal kolon şerit veya ventral beyaz cevher şeritler aksonlar gözlemlemek için. Yukarıdaki deneysel manipülasyonlar yararlanmak ve A.Ş. zarar görmemesi içinomuriliğin dorsal doğrudan temasını engeller soruşturması kapsamında ry lifler, biz bir ex vivo servikal spinal kord modeli kullanın. Böylece, pia mater ve komşu yüzeysel dorsal kolon akson mimarisi izolasyonu sırasında canlı ve soğukkanlı kalır. Yaralanma sonrası 10+ saat - İşte onlar dinamik 8 gerçek zamanlı bir odak yaralanma cevap olarak, merkezi miyelinli akson doğrudan görselleştirme sağlar nispeten basit bir yaklaşım açıklar. Lazer kaynaklı omurilik yaralanması (Lisci) modeli mekansal zamanla kısıtlı kalır primer lezyon (ablasyon sitesi) gibi birincil ve ikincil aksonal yaralanma mekanizmaları arasındaki farklılaşmayı izin verir. açık banyo görüntüleme odası terapötik müdahale, reaktif teslimat ve çevre manipülasyonlara erişilebilir. Putatif axomyelinic koruyucu maddeler hızla doku sürecini kapsayan uzun ve masraflı deneyler karşı doğrudan gözlemlerle gerçek zamanlı olarak değerlendirilebiliring, bu nedenle, immün, görüntü yakalama ve analiz kesit ve canlı hayvanlarda deneysel maddeleri test etmeden önce akut yanıtları ve koruyucu manipülasyonlar değerlendirmek için yararlı bir vekil model sunar.

<table><tbody><tr><td>Large bath chamber with slice supports</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Standard Slice Supports</td><td>Warner Instruments</td><td>SS-3</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-27LP/10</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-1L</td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>Solution In-line heater/cooler</td><td>Warner Instruments</td><td>SC-20</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Instruments</td><td>CL-100</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Liquid Cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Cable assembly for heater controllers</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td><td>Warner Instruments</td><td>TS-70B</td><td>To regulate perfusate temperature during imaging</td></tr><tr><td>Magnetic holder with suction tubing</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH-S</td><td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Adjustable holder</td><td>Bioscience Tools</td><td>MTH</td><td>To hold the temperature probe</td></tr><tr><td>clear silicone sealant</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>superglue</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>thin plexiglass strips</td><td></td><td></td><td>For ex vivo imaging chamber</td></tr><tr><td>nile red</td><td>Life Technologies</td><td>N-1142</td><td>For labeling myelin</td></tr></tbody></table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Yaralı MSS aksonlar rejenere ve genellikle uzak yaralanma sitesinden geri çekmek için başarısız. İlk yaralanma kurtulmuş aksonlar sonra ikincil aksonal dejenerasyonu uğrayabilir. Spinal kord içindeki büyüme konisinin oluşumu, rejenerasyon ve ek miyelinli akson projeksiyonlar kaybı olmaması büyük ölçüde yaralanma sonrası nörolojik iyileşme sınırlar. Omuriliğin miyelinli aksonları yaralanma nasıl tepki merkezi değerlendirmek için, biz kaderi belgelemek için sarı floresan akson protein ve fokal ve yüksek tekrarlanabilir lazer kaynaklı omurilik yaralanması ifade transgenik fareler kullanan omurilik modeli yaşayan bir ex vivo geliştirdi İki foton uyarma time-lapse mikroskopi kullanılarak akson ve zamanla miyelin (lipofilik floresan boya Nil Kırmızı). Akut aksonal yaralanma, akson retraksiyon ve miyelin dejenerasyonu gibi dinamik süreçler en iyi gerçek zamanlı olarak incelenmiştir. Ancak, çürük temelli yaralanmalar ve hareket eserler olmayan odak doğa karşılaştıyüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak zorlu birincil ve ikincil aksonal yaralanma yanıtları ayırt in vivo omurilik görüntüleme make sırasında. Burada anlatılan ex vivo omurilik modeli aksonal şişme, sfero oluşumu, akson Transeksiyon, ve gerçek-zamanlı olarak bu dinamik süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlayan şişme peri-akson olmak üzere klinik olarak anlamlı kontuzyon / sıkıştırma kaynaklı aksonal patolojilerin çeşitli yönlerini taklit eder. Bu modelin önemli avantajları doğrudan akson ve ikincil yaralanma mekanizmaları yaralandı birincil hakaret arasındaki farklılaşmayı sayesinde mükemmel bir uzaysal çözünürlüğü vardır; doğrudan Perfüzat banyo kablosunu reaktif kontrollü infüzyon; Çevre ortamın kesin değişiklikler (örneğin kalsiyum, sodyum iyonları, aksonal yaralanma, ama imkansız yakın bilinen katkıda in vivo işlemek için); onlar görselleştirmek için bir fırsat olarak ve kemirgen modeller de bir avantaj sunuyoruz vegenetik belirlenen hücre popülasyonları ve hücre içi yapıları manipüle. Burada, biz izole etmek ve görüntü farelerin yaşayan omurilik akut aksonal yaralanma dinamiklerini yakalamak için nasıl açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time at JoVE.com

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Görüntüleme.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Video: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Nörobilim

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rizotomi sonra Dorsal Kök Aksonlar Canlı Görüntüleme

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.

Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.

Farelerde Omurilik Yaralanma Modeli Olarak Odak iskemisi Fototromboz kaynaklı

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Tıp

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its incidence is still considerably high and therefore, influences patient outcome. Microcirculation plays a key role in tissue perfusion and oxygen supply and is often dissociated from macrohemodynamics. Thus, direct evaluation of spinal cord microcirculation is essential for the development of microcirculation-targeted therapies and the evaluation of existing approaches in regard to spinal cord microcirculation. However, most of the methods do not provide real-time assessment of spinal cord microcirculation. The aim of this study is to describe a standardized protocol for real-time spinal cord microcirculatory evaluation using laser-Doppler needle probes directly inserted in the spinal cord. We used a porcine model of ischemia/reperfusion to induce deterioration of the spinal cord microcirculation. In addition, a fluorescent microsphere injection technique was used. Initially, animals were anesthetized and mechanically ventilated. Thereafter, laser-Doppler needle probe insertion was performed, followed by the placement of cerebrospinal fluid drainage. A median sternotomy was performed for exposure of the descending aorta to perform aortic cross-clamping. Ischemia/reperfusion was induced by supra-celiac aortic cross-clamping for a total of 48 min, followed by reperfusion and hemodynamic stabilization. Laser-Doppler Flux was performed in parallel with macrohemodynamic evaluation. In addition, automated cerebrospinal fluid drainage was used to maintain a stable cerebrospinal pressure. After completion of the protocol, animals were sacrificed, and the spinal cord was harvested for histopathological and microsphere analysis. The protocol reveals the feasibility of spinal cord microperfusion measurements using laser-Doppler probes and shows a marked decrease during ischemia as well as recovery after reperfusion. Results showed comparable behavior to fluorescent microsphere evaluation. In conclusion, this new protocol might provide a useful large animal model for future studies using real-time spinal cord microperfusion assessment in ischemia/reperfusion conditions.

Spinal cord microcirculation plays a pivotal role in spinal cord injury. Most methods do not allow real-time assessment of spinal cord microcirculation, which is essential for the development of microcirculation-targeted therapies. Here, we propose a protocol using Laser-Doppler-Flow Needle probes in a large animal model of ischemia/reperfusion.

İskemi/Reperfüzyon Porsin Modelinde Omurilik Mikroperfüzyonunun Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes this animal model very useful for studying spinal cord injury and regeneration. The standard protocol for inducing such lesions is to transect the dorsal part of the trunk manually. However, this technique requires extensive training and damages additional tissues. A protocol was developed for laser-induced lesions to circumvent these limitations, allowing for high reproducibility and completeness of spinal cord transection over many animals and between different sessions, even for an untrained operator. Furthermore, tissue damage is mainly limited to the spinal cord itself, reducing confounding effects from injuring different tissues, e.g., skin, muscle, and CNS. Moreover, hemi-lesions of the spinal cord are possible. Improved preservation of tissue integrity after laser injury facilitates further dissections needed for additional analyses, such as electrophysiology. Hence, this method offers precise control of the injury extent that is unachievable manually. This allows for new experimental paradigms in this powerful model in the future.

The present protocol describes a method to induce tissue-specific and highly reproducible injuries in zebrafish larvae using a laser lesion system combined with an automated microfluidic platform for larvae handling.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Bir

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler