非常に厳格なプロトコルは、同じ動物、またはそれらを取り囲む脂肪の有無または内皮の有無において異なる動物または動脈からの準備を有効に比較できるように必要です。この実験手法の主な利点は、同一の動脈の環を等角条件下で比較し、調査する実験因子の影響について有効に結論を出すことができる点である。このプロトコルは、異なる遺伝子組み換え動物の血管内脂肪組織による血管応答性の変調に関する洞察を提供する。
脂肪組織機能不全は、高血圧および関連する心血管合併症の独立した危険因子を表す。当社のミオグラフには、特に取り付け時に船舶に損傷を与えることを避け、容器が様々な刺激に適切に反応することを確実にするために、各ポイントで細心の注意が必要な複数の複雑なステップが含まれます。テキストプロトコルに記載されているように、腸間膜動脈リングの準備と解剖でこの手順を開始します。
コンピュータの電源を入れ、データ記録ソフトウェアを開きます。実験を新しい名前でラボ グラフ データ ファイルとして保存し、元の設定ファイルが上書きされないようにします。正規化設定ウィンドウを開き、K 係数を 1 に設定します。
IP キャリブレーション、目標圧力、オンライン平均時間、遅延時間のデフォルト値を受け入れます。[問題] をクリックして設定を保存します。目的のチャンネルを選択し、ワイヤ径、組織エンドポイント、および初期マイクロメータの測定値を正規化ウィンドウに入力します。
正規化手順を開始するには、マイクロメーターのネジを反時計回りに回して、血管に最初の受動的ストレッチを適用します。容器が安定するまで3分待った後、新しいマイクロメーターの測定値を正規化ウィンドウに入力します。壁張力は自動的に計算され、グラフ上のポイントとして表示されます。
各パッシブストレッチの後、コントロールクレブスバッファーを150ミリモル塩化カリウムを含む等浸透性高カリウムクレブに交換します。収縮が約3分で高原に達したら、活性化力のカリウムから各ストレッチで受動力を差し引いて活動力を記録する。壁張力と内部円周値を計算します。
高カリウムバッファーを新鮮なクレブバッファーに置き換えることによって、高カリウム条件を除去します。5分間に3回洗濯を繰り返します。アクティブな張力が減少し始めるまで、受動ストレッチを誘発し、その後、交互にアクティブな収縮を誘発することによって正規化ステップを繰り返します。
高カリウムクレブバッファーを十分に洗い流し、さらに30〜45分間の準備を平衡化します。基底のテンションをゼロにリセットして、その後の実験中にアクティブな収縮応答のみが記録されるようにします。各動脈の隣接するセクションからのテキストプロトコルに記載されているように、対の動脈リングを準備し、取り付ける。
PVATをそのままにして1つの動脈リングを準備し、もう一方の動脈リングをPVATを取り外します。正常化後、クレブを含むチャンバーに115ミリモルの塩化カリウム溶液を添加することにより、高カリウムクレブスバッファーで動脈セグメントを事前に委託します。高原期に収縮した後、高カリウムを洗い流し、新鮮な通気クレブスバッファーにバッファーを交換します。
5分間に3回洗濯を繰り返します。塩化カリウム刺激と洗浄を3回繰り返し、塩化カリウム刺激による張力からベースライン張力を差し引いて塩化カリウムに対する最大の収縮応答を記録します。最後の収縮と洗浄の後、温かい、気泡状のクレブスバッファーでチャンバーを補充し、動脈が次のタスクを実行する前に約30分間回復することを許可します。
各チャンバに、フェニレフリンの累積量を加えて、静止製剤の濃度依存性の増加と等角張りを誘導する。アゴニストの最後の用量を追加した後、徹底的に薬物を洗い流し、新鮮なクレブバッファーでチャンバーを補充します。濃度依存応答を、塩化カリウム誘導最大収縮の割合の増加としてプロットします。
一酸化窒素の寄与を評価するために、フェニレフリンを添加する前に30分間、一酸化窒素合成酵素阻害剤L-NAMEで調製物をインキュベートする。第2濃度応答曲線を順次に行う場合は、チャンバーを完全に繰り返し洗浄し、トーンのさらなる変化が見られないまで以前のアゴニストのすべてを除去する。長さと緊張関係の正常化は、標準的なチャウまたは高脂肪食を与えられたマウスモデルから分離された腸間膜動脈に対して行われた。
100ミリメートルの水銀経壁圧(IC100)に対応する内部円周が得られるまで、動脈セグメントの増分延伸によって受動的な長さ-張力関係が確立された。各ストレッチの後、115ミリモルの塩化カリウムを適用して収縮を刺激した。アクティブな長さの張力曲線は、アクティブな力データからY軸にプロットし、計算されたIC値をX軸上のマイクロメートルデータからプロットした。
ピーク高原内にあるIC値はIC1です。正規化係数Kは、IC1とIC100の比として計算し、その後の実験で同じ容器タイプのサンプルに適用することができる。ここに示されているのは、PVATを取り巻く有無にかかわらず、腸間膜動脈におけるフェニレフリンに対する血管収縮剤応答の出力記録である。
フェニレフリンの累積濃度は、16週齢のアディポセット1匹のマウスから採取された腸間膜動脈の収縮を刺激するために適用された。収縮応答を記録し、150ミリモルの塩化カリウム誘導最大収縮の割合として計算した。収縮曲線の下の領域は、比較のためにプロットされました。
なお、1匹のマウスがアディポセットからPVATはフェニレフリンに対する応答に対する抗収縮作用を引き出した。KCLによる収縮を得るとき、応答は安定し、安定している必要があります。KCLの3回の段階的投与後も応答が増加している場合、KCL刺激が必要となる可能性がある。
緊張の最適な条件を達成するために、正常化ステップは、これが血管を開く力を決定するように、非常に重要である。それが正しく行われていない場合、それは全体の実験に影響を与えます。このプロトコルは、フェニレフリン誘発収縮または弛緩に加えて、他の設定に適用することができる。
例えば、血管内脂肪組織の有無、自律神経、または内皮の存在下で。このプロトコルを使用すると、研究者は肥満、糖尿病、心血管疾患などの異なる病態生理学的状態下で病気の動物モデルから小さな血管を調べることができます。
