Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

注：すべての手順は、ロイヤルビクトリア朝の瞳と耳病院アニマルリサーチ＆倫理委員会によって承認された（RVEEH AEC;＃10-199AB）。被験者は、国民健康と（2013）と「動物虐待防止法」医学研究審議会の「ケアと科学的な目的のための動物の使用のための実践のオーストラリアの規範」に従って処理した（;および修正1986）。全ての外科的、臨床的評価および電気生理学的手順は、全身麻酔下で実施し、全ての努力が苦痛を最小限にするために行われた。 1.除核および固定注：存在する場合、デバイスのケーブルまたは硝子体切除ポートの周りに余分な世話をして、コンパニオン原稿16で詳細に説明し摘出し、固定手順に従ってください。簡単に言えば、これは含む： <ol><li>経心冷たい中立ブフェ続い温かい生理食塩水で件名を灌流赤ホルマリン。 </li><li>目印として機能するように眼球に縫合糸を結ぶ。 </li><li>デバイスのケーブルとすべての添付ファイルのパッチ/タブを維持し、目16を脱核。 </li><li> 36時間 - 18ダビッドソンのソリューションに目をポスト修正。 </li><li> 8時間 - 6、50％エタノールに移します。 </li><li>解剖まで、70％エタノールと冷蔵（4℃）に移します。 </li></ol> 2.電極の取り外しおよび解剖。 注：すべての網膜上のインプラントは、同一のフォームファクタを有することになるが、一般的に電極アレイと、柔軟で適合性担体材料のいくつかの形態が存在する。網膜に仮止めされたデバイスは、金属タックが一緒にこれらを維持し、配列と目のバックを貫通タック穴を備えています。 <ol><li>インプラントとは、網膜に固定されている点をの視覚化。 <ol><li> 15度のブレードを使用すると、周トランス角膜切開を行い、EXPに角膜のキャップを外す根底にある虹彩とレンズOSE。 </li><li> 15度のブレードを用いて、網膜上インプラントと、その場で金属タックと房が露出、レンズの小帯線維をdisinsertとTOTOにレンズを取り外してください。 </li></ol></li><li>インプラントと研究が行われているに応じて、さらに解剖の前に余分な成分を取り除く。 注：この例では、評価されて網膜上の配列はコンフォーマルシリコーンキャリア内に収容されたプロトタイプの気密性 ​​ダイヤモンド電極と電子回路パッケージから成る（社内で製造し、20を参照）。 <ol><li>ここでは、慎重にメスで細かい切開によってダイヤモンド電極パッケージを抽出します。網膜のタックと白金配線の残党（ 図2）と一緒に、インプラントのシリコーン体のままにしておきます。エンベデッドアレイ/ハウジングは、調査中のデバイス設計の一部ではない場合は、この手順（2.2）を省略する。 </li></ol></li><li>慎重に所望の配向で粘着性および周囲組織を含むサンプルを分析。強膜、脈絡膜と網膜を含む眼の奥から、全層ストリップをカットする細かい解剖ハサミを使用してください。タックに隣接するすべての網膜層を示す、タックの長手方向の断面を与えるサンプルを取る（ 図2） 注：サンプルのための所望の向きは、所望の特定の結果に応じて異なる場合があります。一つは光学ディスクにタック損傷の近接性を調べることを望む場合は、その後、光学ディスクは、サンプル内に含まれるべきである。 </li></ol> 3.脱水、埋め込み、取り付け、研削、染色、およびイメージング<ol><li>プログレッシブエタノール段階での3日間のサンプルを脱水： <ol><li>回2時間、70％エタノール中でサンプルを脱水する。 </li><li> O / Nを2回2時間、80％エタノール中でサンプルを脱水し。 </li><li> 2時間、90％エタノールで試料を脱水TWICE。 </li><li> O / Nを2回2時間、100％エタノール中でサンプルを脱水し。 </li></ol></li><li>回2時間で100％アセトンでサンプルを脱水。 <ol><li>アセトンからサンプルを取り出し、室温でそれ空気が乾燥するように光学顕微鏡下でそれを観察する。エポキシにサンプルを移し、それが/崩壊をカールを開始する直前に（3.4ステップを参照してください）​​。 注：崩壊した細胞収縮で軟組織の結果から液体を除去する。組織カーリング/崩壊が発生したときの感謝を経験して開発されている。 </li></ol></li><li>製造者の指示に従って医療グレードのエポキシ樹脂を準備します。樹脂を硬化させ、室温で1時間または24時間のいずれか、55℃を用いる。気泡の除去のために約50ミリバール〜5分間の真空チャンバ内の場所。沸騰するエポキシ混合物が発生します過度の真空として手動で真空を調節し、脱ガスを効果的に発生しません 注：ステップ3.2と同時にステップ3.3を実行します。 </li><li> SAMPを埋め込むル明確なエポキシ樹脂中。適切な密閉可能な容器内に脱気したエポキシで眼組織を浸し、硬化させるために、室温でO / Nを残す。 </li><li>サイズ変更や硬化エポキシブロックを再埋め込 ​​むことによって所望の向き（ 図2）でサンプルを埋め込 ​​むように注意してください。 （ - 図3A黄色カップ）タックの長軸は、金型の底部に平行に配向されるように、眼組織を含むリサイズブロック-埋め込 ​​む再。 </li><li>シリコンカーバイド紙（; 図3C及び3E 800グリッドで始まる）を使用して- （手動研削、上の水と250回転230）研削試料ホルダーに樹脂をマウントし、サンプルを挽く。 </li><li>染色のために、3のためにトルイジンブルー染色で地面を浸し- 5分、または汚れが発達するまで（ 図3F）。 </li><li>水道水（ 図3G）で洗い流してください。 </li><li>の細胞層を可視化するハイパワー解剖スコープを持つ画像標本の地面網膜（ 図3H）。エアエポキシ界面での回折を滑らかに試料上記エポキシの上面に蒸留水の液滴を適用する。サンプルを照らすために光ファイバ「グースネック」光源を使用してください。 </li><li> （試料ホルダーの最小正確で再現研削増分は20μmである）ほど試料の予め設定された厚さを研削、毎回3.9 - 繰り返し3.6ステップ。 </li></ol>

<ol>
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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

標準的な組織学的技術は、金属、ガラス、さらにはダイヤモンドブレードでこれらのオブジェクトを切削制限によるその場で硬い金属インプラントを処理することができません。我々の仲間紙16には、修正された全眼固定技術の使用は、人為的な網膜剥離を減少させることができることを示した。現在の原稿では、 その場で人工内耳の21-23を可視化するための確立された研削·研磨技術は、網膜人工器官用に変更した。網膜に電極アレイを固定するために使用されるチタンタックは、epiretinally、周囲の眼組織と共にエポキシに包埋した。この樹脂ブロックは、次に、適切に配向され、次第に地面/金属タックにすぐ隣接する組織形態を明らかにするために研磨した。様々な深さでのブロックの研磨面の画像は、強力な解剖顕微鏡で撮影した。可視化とつの評価：このテクニックはするのに便利です網膜上インプラントに隣接する組織応答をる。移植片の移植に関連した外科的外傷を評価する。硬質の金属成分に対する生物学的反応を決定する。インプラントと網膜表面との間の距離を測定する。 この技術は、眼における網膜タックまたは他の硬質（ 例えば、金属製）のオブジェクトに隣接する領域のインサイチュ可視化のための将来の安全性試験に有用であろう。これはepiretinally網膜にタックプロテーゼの前臨床安全性を評価する直接的な適用を有する。また、網膜下の場所に位置してインプラントと接触している網膜の領域における組織の損傷を評価するために有用であり得る。 技術が正しく行われたことを確認するためにいくつかの方法がある。各段階で、網膜は、眼の外側の層に付着したまま必要があります。総人工網膜剥離がある場合、これはインド語あり固定に問題があることを食べた。サンプルが埋め込まれ、最終的な樹脂中に再配向される場合には網膜がブロックの研削面と直交に近くなるはずブロックする。これは、斜めのカットを最小限に抑えることができます。これは、（例えば網膜タックなど）オブジェクトを横断するのに必要な（既知のステップサイズの）増分研削ステップの数は、オブジェクトの寸法に応じて相関していることを確認することが有用である。 技術は、いくつかの方法で最適化することができる。研削プロセスに関連付けられたエポキシブロックの表面に傷が次第に細かいグレードの研磨を低減することができる。本研究のために、我々は、800 1000、1200、2400、4000グレードのシリコンカーバイド紙を使用した。ダイヤモンドペーストは、表面仕上げを改善するために使用することができる。微細な表面仕上げを高品質な画像が得られるが、追加の研磨時間を犠牲に。この技術の成果を改善するための別の重要な検討事項は、OPTIの選択と品質ですcsの、照明、画像キャプチャのために使用した。他の基本的な組織学的染色 - 特にニッスル染色は、トルイジンブルーの代わりに使用することができるが、さらなる最適化を必要とする場合がある。シミは、樹脂だけでなく、組織（ 例えば 、エオシン）、したがって、浅いポリッシュが背景変色を除去するための染色後に必要になることがありますを染色する。専門汚れ、蛍光色素および免疫組織化学的染色は行われませんでしたが、非常に特定の結果が望まれない限り、各研削レベルでこれらの汚れを実行するためにかなりの時間が必要である可能性が高い。しかし、埋め込 ​​みステップ（ステップ3.4）24の前に、全体として組織を染色することが可能である。 この技術の主な制限は、したがって、それは、研削、研磨の各段階での倍率の多様で多くの（おそらく冗長）の画像をキャプチャすることが賢明である、関心領域が離れて粉砕された後、それを取得することができないことである。それはあるまた、それぞれの研削深さ調整のために小さな増分を使用することが重要。この技術の他の制限は、組織をスライドガラス上にマウントし、標準（透過）光学顕微鏡で観察と比較して光学倍率および解像度のものである。プロトタイピングおよび新規なインプラント装置の安全性を評価する目的のために、肉眼的病理評価が主要な関心である。この技術は、網膜のタックに関連付けられ、臨床的に関連する損傷を観察するための効率的な方法を提供する。練習では、グラインドを収集するために必要な時間は、与えられた試料（一度埋め込まれた）ポリッシュと写真、それはセクションにパラフィンブロックまたは凍結切片を取ると時間に匹敵する。 網膜インプラントの範囲外の用途に拡張することが、本技術の可能性もあります。この技術は、インプラント抽出feasibないハード·インプラントに隣接する組織を評価するのに適しているルまたはインタフェースを損傷する。例えば、この技術は、いくつかの深部脳または末梢神経電極、薬物送達のためのカニューレ、血管ステントのような従来の組織学的技術を用いて切断することができない金属（ 例えば 、白金、ニチノールなど ）から作られたインプラントを評価するために拡張することができるまたは整形外科人工器官。

網膜色素変性症（RP）は、神経活動に、光子の形態では、光伝達を担う網膜の最外層中の細胞である光受容体の広範な喪失を引き起こす遺伝性疾患である。重要なことは、RP​​の患者は、一般的にはまだ機能している彼らの網膜の他の層の残留ニューロンを持っている。網膜補綴は、視経路1,2を活性化するために電気刺激をこれらの生き残ったニューロンを標的とすることによって、これらの患者にいくつかの制限された視力を回復することが可能である。臨床試験の知覚の結果は初期の結果を約束して示されており、最近になって一部のデバイスは、商業的使用のために承認されている。 epiretinally 3,4、網膜下に5,6とsuprachoroidally 7,8：現在、臨床網膜補綴物が配置されている中で、3つの主要な解剖学的位置があります。異なるデバイスは、異なる材料を利用し、そのフォームがカスタマイズされています彼らが移植されている場所へ。しかし、それらはすべて、電気パルスで網膜の残留ニューロンを活性化することによって、視覚的な知覚を作成します。 初期配置または後続の継続的な力の機械的効果に起因する周囲の組織損傷への医療用補綴物のための可能性がある。網膜補綴移植可能な刺激器の場合には、電気的パラメータが安全な範囲内であるべきである追加の考慮事項がある。デバイスは、厳密に臨床設定9-15に進む前に、前臨床試験で試験されなければならないので、患者の安全性は、最も重要である。私たちのコンパニオンの記事では、脈絡膜上腔16内に配置インプラント周囲の目のローカライズされた組織病 ​​理を評価するための方法を説明した。本論文では、我々は、前臨床（feの中で、epiretinally網膜にタック電極アレイの周囲の眼組織を視覚化するための技術を説明ライン）モデル（ 図1）。 網膜上の位置は、視覚的な人工器官の位置を特定するための最も一般的に利用される位置である。ここに位置する電極アレイは、一般的に、目17-20のすべての層を貫通する金属タックと網膜に固定されている。本論文に記載された技術の前に、正確にすぐにタックを取り囲む網膜および他の組織を評価することは困難であった。中性緩衝ホルマリンを使用して、標準的な眼の固定は、タックの固定点に対する網膜と強膜の差動移動による人為網膜損傷が生じた。したがってタックと網膜上の配列によって生じた実際の損害を正確に観察することができませんでした。金属物が容易に伝統的な組織学的装置で切断することができないように加えて、眼組織を区画すると、 その場での網膜のタックを用いて行うことができませんでした。組織学的処理の前にタックを除去することでもあったこれはまた、人為的な網膜損傷につながったとして望ましくない。 本研究の目的は二重であった：タック及び網膜上インプラントアレイによる損傷を確実に評価することができるように、1）網膜剥離アーチファクトを削減する。 2）それを除去せずにタックに隣接する網膜のアーキテクチャを可視化した。人為的な網膜剥離を減少させる、（関連記事16に記載されているように）目的1を達成するために、新たな固定技術を利用した。目的2を達成するために、我々は本来人工内耳電極21〜23 のその場観察にために開発され、研削、および研磨技術、埋め込 ​​みを修正した。人工網膜の損傷を最小限にし、したがって、タックと網膜上の配列によって生じる潜在的な被害の正確な評価を可能にしながら、この原稿に記載された方法は、その場でタックへの周囲の網膜の視覚化と隣接することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

固定プロトコールは、実質的に網膜16の人工剥離および層間剥離を減少させた。エポキシブロック内の試料の配向は、記載される二段階埋め込みプロセスを使用して一貫して達成した。増分研削手順は、最適な結果を達成するために、手先の器用さの適度なレベルを必要としますが、増分の分解能を細かく制御を提供し、調整可能試料ホルダーによって助けられた。全ての場合において、（n = 5）の粘着性が配置され、地面/望ましいと一貫性のある結果で研磨。鋲に隣接した網膜は解決可能であったし、適切に染色された。グレードP＃800の炭化ケイ素紙エポキシ樹脂ブロックの表面を研磨すると、埋め込まれた組織の細胞マクロ画像に十分であった。より高いグレードの紙、またはダイヤモンドスラリーは、必要に応じて、さらに、任意の所与の深さの表面を研磨するために使用することができる。解剖顕微鏡および光ファイバ「グースネック」ガーゼトンのソースは、接地ブロック及び包埋組織試料の表面を撮像するのに適していることが分かった。光源の位置は、顕微鏡で最高の照明およびコントラストを与えた位置と角度を見つけるために試行錯誤によって変化させた。ブロックの表面に蒸留水の液滴を加えてサンプルの上に、エポキシ空気界面での光路回折および/ ​​または滑らかな歪みを減少させるのに有用であった。 図4をチタン網膜に直接隣接して可視化網膜組織の画像例を示しているこの技術を用いてタック。非人工網膜剥離と折りたたみは、シリコーン（ 図4A）の両側に見ることができます。タックシャフトがシリコーンに埋め込まれて表示される。タックの頭は、網膜と強膜に浸透した。シリコン（ 図4C）の未染色網膜両側における非人為的な網膜剥離があります。技術はTHER、この例では、次のことを示しているeは、斜め挿入角度による片側網膜のタックおよび圧縮に隣接する網膜組織崩壊である。提示される画像は、単に技術の成功のイラストは、一般的には粘着性の損傷組織病理のではない代表的なものであることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> 網膜上電極アレイの図1の配置。後部強膜、脈絡膜と網膜の縮退拡大断面を示す、眼の（A）の模式図（光受容体を欠いている）。電極アレイは、網膜上電極アレイの青、epiretinally貼付。（B）コンピュータ支援、図面に描かれている。 、集積回路（「チップ」）および電極パッケージ。 B、​​チタン網膜タック。 cを医療グレードのシリコーンハウジングとD、リード出口点。パネルAは、オリジナルのillustratiから変更バイオニックビジョンオーストラリアの提供礼儀上、著作権ベスクローチェ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> 図2.電極の除去と、目の解剖。 その場での網膜上のタックと除核ネコの目の高ダイナミックレンジマクロ写真。（A）デビッドソンの固定液とポストの固定は、網膜アーキテクチャ16維持するために、除核の目を解剖した。電極アレイパッケージが、シリコーンキャリアから除去された残りのインプラントのタック（矢印）およびシリコーン本体と（破線の正方形の輪郭は、電極アレイの元の場所を示す）。（B）眼に隣接した長手方向断面を解剖しタック（破線）。タックは、強膜によって主に安定化されたアイカップ（矢印）の後壁に埋め込まれたままである。除去された電極アレイの下の網膜を含むセクションは、標準的な組織学的処理16（左セグメント）のために調製したがタックを含む組織切片は、樹脂包埋研削（右セグメント）のために調製した。 0.5ミリメートル刻みで定規は各パネルの下端に表示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> 図3.エポキシ埋め込 ​​みタック及び網膜組織の研削 、 エポキシ埋め込 ​​みと整列した組織サンプルの写真を、研削、染色および粘着性および網膜組織のイメージング（A）のtac<html> k個のサンプルは、エポキシ樹脂ブロックに包埋した。金型を用いて、試料を長手方向の平面は、型の底部と平行になるように配向させた。研削（B）はタックサンプルを含む硬化エポキシブロック（C）エポキシブロック粉砕試料ホルダーに装着し、準備（D）試料を基本組織のように撮像されたセクションは、網膜細胞層とタックの長手方向軸を含む配向した。（E）試料をロータリーグラインダー上にシリコンカーバイド紙を用いて粉砕した。（F）の地面ブロックは、網膜層を識別するためにトルイジンブルーで染色した。（G）ブロックを、過剰染色を除去し、水道水でリンスした。（H）トルイジンブルーは網膜層を染色し、粘着性が高出力解剖スコープを使用して画像化した。 広告/ 52348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; 図4.ハイとタックと網膜の低消費電力の画像。さまざまな点で研削加工画像中には、タックの縦断面を示す、解剖スコープで撮影した（アスタリスク）の目を貫通し、強膜を終了（ &#39;S&#39; ）、シリコーン（ハッシュ）、トルイジンブルー染色し、染色されていない網膜（R &#39;&#39;）を隣接する。これらは単に本可視化技術を実証する例の画像であり、すべての網膜上インプラントまたはタック挿入組織学の結果の代表ではないことに注意してください。プラチナ配線のグランド残党（ &#39;W&#39;）パネルADに表示されている。（A）低消費電力、網膜と強膜を貫通タックの非染色画像。網膜剥離の（B）ハイパワー画像と隣接する未染色網膜に折りたたみタックシャフトの中央の画像A.（C）低電力画像シリコーンキャリア。 <strオング&gt;（D）は、別々のサンプルで、画像C.（E）中のタックの中央の高パワー画像、無シリコーンキャリアと、タック柄の下のトルイジンブルー染色した網膜の高倍率画像は直前に示されている。タックシャフト（F）ノーマルトルイジンブルー染色した網膜のアーキテクチャを研削（GCL：網膜神経節細胞層、INL：内顆粒層、ONL：外顆粒層と、PR：光受容体; T：ネコタペート芝）は、同じ研削技術を用いて視覚化。各パネルのスケールバーは、以下のとおりです。AとC = 2ミリメートル。 BとD =500μmの。 E = 200程度。 F =100μmである。

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K ビュー.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

ビデオ: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植処理アイズのための技術

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

医学

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

網膜疾患の評価のための定量的眼底自己蛍光

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

治療のために血液網膜関門の違反と潜在的な薬を評価するための急性網膜モデル

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

インプラント用金属に対する関節軟骨滑走の生物化学検査と分析

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

げっ歯類における虚血性網膜症の酸素誘導網膜症モデル

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...