著者は、ボブ·フィッシャー（LV、DIR、NIAID、NIH）、ナレーターを務めただけでなく、オースティンAthman（RTB、DIR、NIAID、NIH）とミーガン·モーガン（DOHS、ORS、OD、NIH）のために非常に感謝していますこの原稿を伴う映画を作る際の彼らの助け。さらに、私たちは原稿の重要な読書のためのアリソンGroseth（LV、DIR、NIAID、NIH）を感謝したいと思います。この研究は、NIH、NIAIDの学内研究プログラムによってサポートされていました。

trVLPsの初期生産のためのプロデューサー細胞の1分割<ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMのL-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを備えた高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で2フラスコ（75 cm単位293細胞培養80〜90％コンフルエントからDMEM10の培地を除去）。細胞を取り除く、そして細胞は2 mlトリプシン-EDTAを加えることがないように注意しながら10mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回細胞を洗浄する。 </li><li>顕微鏡（約30秒）の下で観察すると、細胞が重要なの丸めを示すまで、室温で細胞をインキュベートする。フラスコをタップして、細胞を取り除くと、8ミリリットルDMEM10を追加します。徹底的に穏やかにピペッティングすることにより細胞を再懸濁し、ダウン顕微鏡下で見たときに、単一細胞懸濁液が観察されるまで。 </li><li>自動細胞カウンターを用いて細胞を数える。 DMEM10 1ml当たり2×10 5個の細胞に細胞を希釈する。ピペットウェルあたり6ウェルプレート（4×10へ細胞懸濁液を2mlウェル当たり5細胞）。 </li><li> 5％のCO 2、37℃で加湿した組織培養インキュベーター中で培養する。 </li></ol> trVLPsの初期生産のためのプロデューサー細胞のトランスフェクション2。 <ol><li>フィルタリングのヒントを使用して、無菌の2ミリリットルに細胞を分割した後、24時間（実験タイミングの概要については図5を参照）、ピペットプラスミドDNA 15（金額については表1を参照）クリオバイアル。 DNAにウェルあたり100μlのOptiMEMを追加します。簡単に混合物をボルテックスし、優しくフュー​​ジを使用してチューブをスピンダウン。いくつかのウェルは、同一のプラスミドでトランスフェクトされる場合、いくつかのウェルについてのマスターミックスを作製することができる。 </li><li>簡単に言えば、使用前にトランジットLT1でバイアルをボルテックス。希釈したDNAにウェルあたり7.5μlのトランジットLT1を追加します。静かにクリオバイアルの蓋に液体を収集しないように注意しながら、混合物をボルテックスし、室温で15分間インキュベートする。 </li><li>静かにトランスフェクションをミックス上下にピペッティングすることにより、複雑な。滴下各ウェルにトランスフェクション複合体を100μlを追加します。トランスフェクション複合体を分散させる左右に前方/後方および側方からプレートを揺する。これはトランスフェクション複合体の広がりが不均一原因となるため、プレートを旋回しないでください。 </li><li>インキュベーターにセルを返します。 </li><li> 24時間後、細胞から上清を除去。 5％のFBS、2mMのL-グルタミン、細胞に1×ペニシリン/ストレプトマイシン（DMEM5）で4ミリリットルDMEMを加える。この手順は、交差汚染が問題になることができる井戸が原因でこのシステムのtrVLPsの自己増幅する性質のために、そうでない（同一のサンプルを含むと仮定すると、井戸の乾燥させずに一度に最大3つのウェルのために行うことができ、このステップ）は、一度に一つの井戸を行う必要があります。 </li><li>インキュベーターにセルを返します。 </li></ol>標的細胞の調製<ol><li>ウェル当たり2ミリリットルDMEM10に4×10 5個の細胞を播種し、セクション1で説明したように293細胞を分割6ウェルプレート。 </li><li>標的細胞の分裂後24時間で、感染の24時間前に、DNAを用い項2に記載のようにトランスフェクトした標的細胞は、 表1の量、およびウェルあたり4.5μlのトランジットLT1。 </li></ol>プロデューサー細胞の標的細胞と収穫の4。感染<ol><li> 15ミリリットルチューブにプロデューサー細胞からの上清を移す。バキュームホースを使用して、任意の残りの上清を取り出し、廃棄します。細胞に250μlのグロ溶解バッファーを追加します。 </li><li>細胞破片のサンプルをクリアする800×gで、室温で5分間遠心上清。 </li><li>標的細胞の1つのウェルからの上清を取り除きます。注意深くピペット最も遅い速度を使用して、標的細胞へのクリアプロデューサー細胞上清を3mlを加える。細胞単層を破壊することを避けるために、細胞上に直接ピペッティングは避けてください。このステップは、 一度に一つのウェルを行わなければならない。 </li><li>すべてのサンプルはトランスされているときferred、trVLPsおよび標的細胞の感染の沈降を可能にするためにインキュベーターに標的細胞を返す。 </li><li>グロ溶解緩衝液中で室温でのインキュベーションの15分後、150μlに設定マイクロピペットを用いて溶解緩衝液中でプロデューサー細胞を再懸濁し、クリオバイアル2ミリリットルに試料を移す。この時点で、溶解物を-80℃で凍結するか、直接項6に記載のように測定することができる。 </li><li>感染後24時間では、標的細胞から上清を除去。細胞にウェルあたり4ミリリットルDMEM5を追加します。井戸が原因でこのシステムのtrVLPsの自己増幅特性により、交差汚染が問題になることができ、このステップがあるべき、そうでない（同一のサンプルが含まれている場合、この手順は、一度に最大3つのウェルについて行うことができます一度に一つの井戸をして）。 </li></ol>シングルサイクル感染のための標的細胞の5収穫<ol><li>単一の感染サイクルは、感染削除tの後72時間で、評価すべきである場合には彼は真空ホースを使用して、標的細胞からの上清。 </li><li>プロデューサー細胞は、セクション4で説明したように250μlのグロ溶解緩衝液中で細胞を収穫。 </li></ol> 6。標的細胞の収穫とtrVLPsの連続継代<ol><li> trVLPsが連続的に継代される場合、それらは、標的細胞（ 図5参照）の第一のセットの感染後、感染72時間の準備ができているように、セクション3で説明したように、標的細胞の新しいセットを準備する。 </li><li>セクション4で説明したように（プロデューサー細胞の代わりに、標的細胞の第一のセットを使用して）標的細胞の新しいセットを感染させる。 </li><li>これらのステップごとに72時間を繰り返します。 </li></ol>レポーター活性の7分析<ol><li>細胞溶解物を凍結した場合、室温でそれらを解凍する。サンプルは測定前に室温に達したことを確認してください。 </li><li>ウミシイタケGloアッセイバッファー（理想的に凍結され、iの必要量（サンプルあたり40μl）を解凍室温でのn個の分量）。バッファは測定前に室温に達していることを確認してください。 </li><li>ウミシイタケGlo試薬を得るために、ウミシイタケGloアッセイバッファーにウミシイタケグロ基板の100分の 1のボリュームを追加し、ボルテックスで混和する。ピペット白色96ウェルプレートにウミシイタケGlo試薬40μlの。 </li><li>ウミシイタケ-Glo試薬にサンプルを40μlを加える。その後、10分待つ1秒の積分時間を用いて、ルミノメーターでサンプルを測定する。 </li></ol>

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	<li>Kuhn, J. 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著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

この原稿に記載されtetracistronic trVLPアッセイは、いくつかの感染サイクルにわたってエボラウイルスのライフサイクルのモデル化を可能にする。重要なのは、このシステムで生産さtrVLPsは一緒にエボラウイルスゲノムのほぼ60％を構成し、ウイルスの複製に必須であるヌクレオカプシドタンパク質NP、VP35、VP30、およびL、遺伝情報が含まれていません。むしろ、これらのタンパク質は、発現プラスミドからトランスでの標的細胞に設ける必要はなく、これらのタンパク質のすべての4を発現する細胞の任意の感染は不稔である。重要なことは、フィロウイルスのための遺伝子組換えの証拠はない、とtetracistronicミニゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミドの間で共有なかっ相同領域はありません。したがって、任意の実用的な証拠も潜在的に原因となり、全長エボラウイルスゲノムを生成する可能性を提供する可能性のある理論的根拠もないとされている感染エボラウイルスの産生、BSL2条件下での使用のためにこのシステムを安全にすること。 つの重要なtrVLPsの産生、すなわち 、実験条件によって影響を受けるtetracistronic trVLPアッセイの手順、およびこれらのtrVLPsによる標的細胞の感染がある。 trVLPsの生産は、今度は、高いトランスフェクション効率に依存する、ミニゲノム複製および転写の高いレベルに依存している。トランスフェクション効率を容易L発現プラスミドは、eGFPをコードする発現プラスミドのために交換される-Lコントロールを含めることによって評価することができる。これらの条件下でトランスフェクション率は、トランスフェクションの24時間ポスト蛍光顕微鏡で検査することによって50％を超えている必要があります。私たちの経験ではマイコプラズマ汚染が劇的ミニゲノム複製および転写（未発表データ）を損なうので、細胞は、マイコプラズマがないことがあります。その高いトランスフェクション能力293 CEへLLSはtrVLPアッセイのために選択される細胞株である。しかしながら、これらの細胞は、エボラウイルス16感染に（完全に屈折しないが）比較的乏しい感受性である。そのようなTIM-1などの接着因子の発現は、約100倍trVLPsで293細胞の感染を高め、数継代にわたってこのシステムの成功のために不可欠である。 tetracistronic trVLPsが自分自身で自己複製ではありませんが、彼らはヌクレオキャプシドタンパク質を発現する細胞内で自己複製します。そのため、予防措置は（ミニゲノム中の異なる変異を有するなど ）が異なるtrVLPsを含むウェル間のクロスコンタミネーションを回避するために行う必要があります。より技術的な観点から、原因は、このアッセイで正と負の信号間の差が大きい（約4ログ）に、サンプル間のクロストークルシフェラーゼ活性を測定する場合には問題となることがあります。しかし、これは簡単には、各試料間の1つの空のウェルを残すことによって回避することができるルシフェラーゼ活性を測定するために使用される96ウェルプレート。 tetracistronic trVLPsの可能な多数のアプリケーションがあります。感染trVLPs、感染フィロ14の典型的な糸状構造であり、フィロウイルス粒子と同じウイルス成分が含まれているため、明らかに、それらは、フィロウイルス粒子の侵入を研究によく適している。偽型ウイルス粒子またはレトロウイルスGP 1,2を有する粒子、またはそのようなGP 1,2を発現する組換え水疱性口内炎ウイルスなどの組換えウイルスのようなウイルス様粒子を使用するときの場合のように重要なのは、それらは、他のウイルスの成分を含まない。付着因子の要件この系における標的細胞、293細胞を用いて、画面に活用し、このような結合因子の役割を研究することができる一方、そのようなゲノムの複製と転写に関与するものなどの他の細胞因子の役割、ならびに形態形成および芽鼎は、RNAi技術を使用して調べることができる。一つはVP40、GP 1,2、およびVP24がウイルス転写後に発現している間、他のウイルスタンパク質の発現は、式から達成されていることを心に留めておく必要がありますが、ウイルスのライフサイクル上のウイルスタンパク質における変異の効果も、研究することができるプラスミドを、これらのタンパク質の過剰発現に起因する影響を考慮しなければならないようにする。また、ケアはレポーター活性を直接ミニゲノム長さ15の影響を受けるため、ミニゲノムの変異が大きく、ミニゲノムの長さを変えないように注意すべきである。 tetracistronicミニゲノムは、ウイルス遺伝子を運ぶウイルスゲノムの類似体であり、ウイルスポリメラーゼ複合体により複製されるので、最後に、それはまた、BSL2条件下での突然変異に応じて、これらの遺伝子の進化を研究することが可能であるべきである。さらなる研究はまだこの方向に必要とされるつつ、それが可能であるべきであり、例えば、準最適導入するミニゲノム内の遺伝子に突然変異した後、通路trVLPs無料の変異が現れるまで。 留意しなければならないtetracistronic trVLPアッセイの1つの制限は、モデルウイルスのライフサイクルのほとんどをしながら、標的細胞は、トランスにおけるヌクレオキャプシドタンパク質を発現する必要があるため、標的細胞の一次転写が、このシステムによってモデル化されていないという事実であるtrVLPsが複製するためには。一次転写を評価する必要がある場合には、ナイーブ標的細胞10を使用することが可能である。ただし、この場合には、ゲノムの複製は、標的細胞内で行われず、これ以上の感染trVLPs、感染を中止し、生産されていません。これは事実上の感染性組換えエボラウイルスに変えるだろうミニゲノムへのヌクレオカプシド蛋白質の遺伝子を含むことによって、完全に自己複製をtrVLPsをレンダリングせずに克服することができない主要な問題である。実際には、Ebolルシフェラーゼまたは他のレポーターが生成されたと評価し、ゲノムの複製および転写17,18を研究するために利用することができる発現するウイルス;しかしながら、それらの使用はBSL4研究所に制限される。また、VP40、GP 1,2、およびVP24がウイルスゲノムアナログから発現している間、ミニゲノム内の位置（ 第2、第3、および第 4の転写ユニット）と同一ではないことに留意する必要がある互いに対してそれらの絶対的な発現レベル、ならびにそれらの相対的な発現レベルに影響を与える可能性があり、ウイルスゲノム内の位置（3 番目 、4 番目 、および6 番目の転写単位）。 全体的に、tetracistronic trVLPアッセイは、これまでの利用可能なエボラウイルスのための最も包括的なライフサイクルモデリングシステムを表し、添付ファイルと専用だけでなく、ゲノムの複製および転写、粒子形態形成および出芽のモデリングを可能にする複数の感染サイクルにわたって標的細胞にしてみてください。このように、BSL2条件下でエボラウイルスの生物学を調査に使用するための多大な可能性を秘めている。

エボラウイルスは、人間の集団発生1で最大90％の致死率を持つヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱の原因物質である。 （2,3にレビュー）、ワクチンだけでなく、具体的な治療法の開発に近年では大きな進展があったが、これらは、ヒトへの使用が承認されていない。エボラウイルス粒子は、約1μmの長さが特徴的な糸のような外観と96から98 nmの4の直径を有する。ヌクレオカプシド形ウイルス粒子のコア及び1からなる）7エボラウイルス遺伝子をコードする非セグメント化一本鎖ネガティブセンスRNAゲノム（ 図1）、ゲノムをキャプシド2）核タンパク質NP、3 ）ポリメラーゼLとその補因子VP35からなるウイルスポリメラーゼ複合体、及び4）転写アクチベーターVP30。また、最近では、タンパク質VP24はまた、ヌクレオキャプシドと関連していることが示されている秒4。ヌクレオカプシドは、ビリオンの形態形成および出芽に関与するマトリックスタンパク質VP40は、配置されるマトリクス空間に囲まれている。ウイルス粒子は、さらに、エンベロープ、およびそのエンベロープに埋め込 ​​まれているビリオンの付着およびエントリに関与する唯一の表面タンパク質GP 1,2、である。 感染エボラウイルスでの仕事は、世界中のいくつかの施設にこの仕事を制限するバイオセーフティレベル（BSL）4条件下最大封じ込め実験室で行われなければならない。これらのウイルスの生物学を研究するため、またはBSL2条件下での新規治療薬を開発するために、研究者は、エボラウイルスタンパク質の組換えの過剰発現に、または感染性エボラウイルスの非存在下で加工することができるどちらもライフサイクルモデリングシステム、のいずれかに依存している。エボラウイルスタンパク質の組換え発現のいずれかの発現プラスミドまたはウイルスベクターから達成される。この戦略の特殊なケースである組換え的に研究することができるシュードタイピング粒子の生成につながる、GP 1,2表現の存在下で、ビリオンまたはエボラウイルス以外のウイルスに基づくウイルス様粒子の生成（最も一般的に口内炎ウイルス、レトロウイルスまたは水疱）侵入阻害剤5用のフィロウイルス、画面の入力プロセス。あるいは、独自の糖タンパク質の代わりに、エボラウイルスGP 1,2をコードする組換えウイルス（ 例えば 、水疱性口内炎ウイルス）が生成され、バイオセーフティーレベル2の条件6の下のウイルス侵入を研究するために使用することができる。 ライフサイクルモデリングシステムは、最初にcDNAから産生され、その後複製さトランスで提供エボラウイルスタンパク質によって転写される短縮型エボラウイルスゲノム類似体（ミニゲノム）の使用を特徴とする逆遺伝学系の形態である。エボラウイルスの最初のミニゲノムシステムは15年以上前に開発された7、および以降エボラウイルスゲノムの複製および転写（8,9に概説）を研究するために使用されている。このシステムでは、エボラウイルスゲノムの末端非コード領域に隣接し、単一のレポーター遺伝子から成るモノシストロンミニゲノムは、（T7のRNAポリメラーゼを用いて、通常の転写によって）哺乳動物細胞中で発現される（ 図1）（リーダーおよびトレーラーと呼ばれる）一緒にウイルスタンパクL、VP35、VP30およびNPと。ミニゲノムは、NPによってキャプシド化した後、複製され、ウイルスのライフサイクル（ 図2）、これらの二つの側面を反映しているレポーター活性につながる、リーダーおよびトレーラーに局在シス作用シグナルを使用して他のヌクレオカプシドタンパク質によって転写される。 ウイルスライフサイクルの追加の手順をモデル化するためには、転写および複製能力のあるウイルス様粒子（trVLP）システムは、古典的なミニゲノムシステムに基づいている、開発したが、Aを備えていてきた発現プラスミド10,11から他のウイルスタンパク質VP24、VP40およびGP 1,2のdditional式。 VP40の存在は、それらの表面上にGP 1,2を負担trVLPsの形成をもたらし、内側のミニゲノムを含むヌクレオカプシドを運ぶ。これらtrVLPs、 すなわち （trVLPs 11内の標的細胞に持ち込まミニゲノムの複製および転写を容易にするために、いずれかのL、VP35、VP30およびNPのための発現プラスミドでpretransfectedされた標的細胞を感染させるために使用される、またはナイーブ標的細胞であることができるエボラウイルスタンパク質のプラスミド-駆動発現なし）10。これは、trVLPsのプロデューサー細胞、形態形成および出芽においてミニゲノムの複製を反映して、標的細胞におけるレポーター活性をもたらす標的細胞への侵入、および1）pretransfected標的細胞の場合には、複製および二次転写（ゲノムウイルスタンパク質のprodによるすなわち転写uced）標的細胞内、標的細胞内、または2）また、ナイーブ標的細胞trVLPs内の標的細胞に持ち込まウイルスタンパク質）（ 図3）による一次転写（ すなわち 、転写の場合。これらのタンパク質は、ゲノム複製の強力な負の調節因子であることが示されているので、重要なことに、これらのシステムは、単一の感染サイクルをモデル化し、VP24およびVP40の場合に特に問題となる全てのウイルスタンパク質の過剰発現に依存することに使用されているプラスミド12,13から過剰発現し転写。さらに、これらのシステムで生成さtrVLP調製物は、感染trVLPs 14の生化学的解析のための課題を提起、非感染性粒子の割合が高いが含まれています。 これらの問題を克服するために、本 ​​発明者らは最近、レポーター遺伝子に加えて、VP40、GP 1,2とをコードする遺伝子が含まれ、tetracistronicミニゲノムシステムを開発したVP24（ 図1）。古典的なモノシストロニックミニゲノムシステムと同様に、このシステムは、（ 図4）15標的細胞に感染することができるtrVLPsの産生をもたらす。しかし、古典的なミニゲノムシステムとは対照的に、VP40、GP 1,2、およびVP24ではなくプラスミドから過剰発現されるよりも、ウイルスゲノムの転写後に生成される。その結果、これらのタンパク質の動態および発現レベルは、はるかに密接にウイルスライフサイクル中に見られるものを模倣し、したがって非感染性trVLPsへの感染の割合は、このシステム15において約500倍増加している。さらに、このシステムを使用して、連続的継代tetracistronicミニゲノム含有trVLPsを、複数の感染サイクルをモデル化することが可能であった。このように、tetracistronic trVLPsは現在、BSL2条件でエボラウイルスの生物学を研究するために利用できる最も包括的なライフサイクルモデリングシステムである。ここでは、使用O上の詳細な情報を提供するこのシステムFだけでなく、期待される結果について。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

エボラウイルスは、90％と高い致死率で、ヒトおよび非ヒト霊長類において重篤な出血熱を引き起こす。があり、これらのウイルスに起因する疾患のための認可されたワクチンまたは特定の治療法はなく、感染性エボラウイルスでの作業が大幅にこれらのウイルスの研究を制限し、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。ライフサイクルモデリングシステムモデルバイオセーフティーレベル2の条件下で、ウイルスのライフサイクル;しかしながら、最近まで、そのようなシステムは、ウイルスのライフサイクルの各局面、または単一の感染サイクルのいずれかに限られていた。形態形成に関与Tetracistronicエボラウイルス非コード領域、レポーター遺伝子から成るミニゲノム、三エボラウイルス遺伝子、出芽、エントリ（VP40、GP 1,2、およびVP24）は、複製および転写を製造することができるこれらのミニゲノムを含む-competentウイルス様粒子（trVLPs）。これらtrVLPsは継続的にエボラを発現する細胞に感染することができます私たちは安全にバイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することができ、ゲノム複製および転写を担うウイルスタンパク質、。重要なことは、このシステムのウイルス成分は、単独で（例えば、偽型ウイルスを使用するシステムの場合のように）、エボラウイルス由来ではなく、他のウイルスから誘導され、VP40、VP24およびGP 1,2は、このシステムにおいて過剰発現されていないこのようなゲノム複製および転写などのウイルスのライフサイクルの他の側面もこのシステムをモデル化することができますが、形態形成、出芽し、エントリを研究するために理想的に適して作る。したがって、tetracistronic trVLPアッセイはエボラウイルスの最も包括的なライフサイクルモデリングシステムであり、将来的にはエボラウイルスの生態を調査に使用するための非常に大きな可能性を秘めています。ここでは、このシステムの使用上だけでなく、期待される結果に関する詳細な情報を提供します。

エボラウイルスヌクレオタンパク質NP、VP35、VP30、およびL、ミニゲノムの複製と転写および72時間で容易に検出可能であるレポーター活性のtetracistronicミニゲノムおよびアクセサリT7ポリメラーゼ結果（ 図6をコードする発現プラスミドで293プロデューサー細胞のトランスフェクション）。重要なことは、観察されたレポーター活性（10 5.6相対発光単位（RLU））をコードする発現プラスミドLは2つ以上のログによりトランスフェクション（10 3 RLU）から省略されたネガティブコントロールのことを超えている。偶数Lの非存在下で観察される活性の低レベルに起因ミニゲノムプラスミド中の潜在性プロモーターによる可能性が最も高い。プロデューサー細胞と比較した場合、プロデューサー細胞の上清からtrVLPsに感染した標的細胞は、実際には幾分レポーター活性のレベルの増加を示し、その値は、通路に応じて、10 6、10 7 RLUとの間に達する。対照的に、ワット-L制御プロデューサー細胞の上清を、標的細胞上で継代される編（L含め、すべてのヌクレオカプシドタンパク質を発現する）を、レポーター活性をルミノメーター（約10 2 RLU）のバックグラウンドノイズを超えない。 tetracistronic trVLPアッセイは、エボラウイルスのライフサイクルを研究するために使用することができる。例えば、trVLPs 293細胞の感染は、これらの細胞にトランスで提供する必要があるなどのTim-1 16などの付着因子の存在に依存する。したがって、tetracistronic trVLPアッセイにおいて約100倍の標的細胞におけるレポーター活性の低下のTim-1（ 図7A）の非存在下で観察される。ウイルスのライフサイクルにおける特定の（ウイルスまたは細胞）のタンパク質の役割はまた、このアプローチと共にRNAi技術を用いて評価することができる。一例として、Lでの中心的役割を反映し、ダウンレギュレーション約100倍のレポーター活性の低下でL結果のRNAiを媒介複製と転写（ 図7B）7。また、直接ウイルスのライフサイクルにおける変異の効果を評価するためのミニゲノムを操作することが可能である。ミニゲノムからVP24発現を開始コドンのすぐ下流の3停止コドンを導入することによって廃止された場合、一例として、プロデューサー細胞におけるレポーター活性が劇的に変化しない。しかしながら、標的細胞におけるレポーター活性は、感染trVLPs（ 図7C）15の製造におけるVP24の役割を示すつの通路と、2つの継代後に400倍から約20倍減少する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：エボラウイルスゲノムの構造だけでなく、モノシストロニックとtetracistronicミニゲノム。エボラウイルスタンパク質コード領域を赤（NPとして示されているVP35、VP30、およびL）、イエロー（VP40とVP24）または青（GP 1,2）のボックス。非コード領域（NCRの）が示されたリーダーおよびトレーラー領域と、緑色で示されている。添字は、ウイルスNCRはコード領域を接合するために使用されたかを示す。レポーター（担当者）のためのコード領域は紫色で示されている。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> 図2モノシストロンミニゲノムアッセイ細胞を、エボラウイルスヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミド（NP、VP35、VP30、L）、モノシストロンミニゲノム（mg）およびT7ポリメラーゼを用いてトランスフェクトされる。ミニゲノムは、最初に、次いでNP（b）で包膜されているウイルスゲノム（vRNAの）と同じ向きにunencapsidatedミニゲノムRNAへのT7ポリメラーゼ（a）で転写される。これはvRNAの相補ミニゲノムRNA（cRNAを）済の中間経由複製されるキャプシド化ediate（c）は、その後、レポータータンパク質（E）に換算されているレポーターのmRNAの（d）に転写。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> モノシストロニックミニゲノムを持つ図3 trVLPアッセイ。細胞は、ミニゲノムアッセイ成分のための発現プラスミドでトランスフェクトする（エボラウイルスヌクレオタンパク質NP、VP35、VP30、L、モノシストロンミニゲノムおよびT7ポリメラーゼ）だけでなく、VP40、GP 1 、2、VP24。これは、ミニゲノム含有ヌクレオカプシド（F）を組み込むtrVLPsの形成をもたらす。いずれのレポーター発現（e）に、またはナイーブにつながる複製および二次転写（d）で得られた、NP、VP35、VP30、およびL（上部）のための発現プラスミドでpretransfectedされ、次いで標的細胞に感染することができ、これらのtrVLPs（g）に分の一次転写をもたらす標的細胞（下部）igenomes（h）は、また、レポーター発現の（e）に至る。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> 図tetracistronicミニゲノムで4 trVLPアッセイ：細胞を、エボラウイルスヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミド（NP、VP35、VP30、L）、tetracistronicミニゲノム（mg）およびT7ポリメラーゼを用いてトランスフェクトされる。初期転写（a）は、キャプシド（b）は、ゲノム複製（c）および転写の（d）と同様に変換（e）は、モノシストロニックミニゲノムアッセイにおけるように起こる。しかし、レポーターmRNAに加えて、VP40、VP24およびGP 1,2ためのmRNAはまたtrVLPs（f）のの形成をもたらす、tetracistronicミニゲノムから転写される。これらtrVLPsはヌクレオキャプシドタンパク質NP、VP35、VP30とLのための発現プラスミドでpretransfectedされた標的細胞だけでなく、携帯エボラウイルスに感染する接着因子のTim-1、新鮮な標的細胞を感染させるために使用することができるtrVLPsのゲノムの複製および転写および生産をもたらす。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> 3つの連続継代tetracistronic trVLPアッセイの図5のタイミング。日間、細胞（単数または複数）を播種細胞（t）をトランスフェクト細胞は、（i）、培地交換（c）に感染した細胞とtrVLPsの収穫（h）のためである3つの連続継代のために示されている（矢印）。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> tetracistronic trVLPアッセイで観察されたレポーター活性の図6典型的なレベル。tetracistronic trVLPアッセイはprotoc以下の5継代にわたって実施されたオール本稿で概説。陰性対照として発現プラスミドをコードするLは、p0はプロデューサー細胞のトランスフェクションから（-L）を省略した。 p5は継代P1内の標的細胞を、ルミノメーターのバックグラウンドノイズが破線として示されているL.含むすべてのヌクレオカプシドタンパク質のための発現プラスミドでトランスフェクトした。手段と、3つの独立した実験から4の生物学的反復の標準偏差が示されている。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> tetracistronic trVLPsを用いてウイルスのライフサイクル上のさまざまなウイルスおよび細胞因子の影響を評価する図7。接着因子として（A）のTim-1ヌクレオカプシドタンパク質および（15に記載）のTim-1をコードするプラスミドを含むまたは含まないコードする発現プラスミドを用いてpretransfectedされた標的細胞を、tetオペレーターに感染させたracistronic trVLPs。 p1は、標的細胞における72時間後の感染レポーター活性を測定した。手段および4の生物学的反復の標準偏差4の独立した実験から示されている。 ゲノム複製と転写にLのRNAiのノックダウン（B）の効果。に対して向けヌクレオカプシドコンポーネント、TIM-1とのmiRNAのための発現プラスミドでpretransfectedた標的細胞L（抗L）または（15参照）無関係のタンパク質（抗GFP）をtetracistronic trVLPsで感染させた。 p1は、標的細胞における72時間後の感染レポーター活性を測定した。平均および2つの独立した実験からの5生物学的反復の標準偏差が示されている。（C）の影響変異のtrVLPの感染性に対するミニゲノム中。tetracistronic trVLPアッセイは、野生型ミニゲノム（4cis-WT）またはミニゲノム中のいずれかを用いて行った3終止コドンを発現Oを廃止、VP24の開始コドンの直後に導入されたfはこのタンパク質が、P0、P1とP2での長さ、核酸組成、二次構造レポーター活性に関してにおけるミニゲノムへの唯一の最小限の変更を導入するトランスフェクション/感染後72時間に測定した。手段と、3つの独立した実験からの3生物学的複製の標準偏差が示されている。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> プロデューサー細胞（P0） </td><td style="width:180px;"> 標的細胞（p1およびそれ以降） </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td heiGHT = &quot;19&quot;スタイル= &quot;高さ：19px;&quot;&gt;のpCAGGS-L </td><td>千</td><td>千</td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNAを、たRLuc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;">のpCAGGS-TIM1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> 表1 DNAをトランスフェクションに達する。プロデューサーと標的細胞のトランスフェクションのために必要な各プラスミドの量は、6ウェルプレートのウェルあたりのngのに示されている。全てのプラスミドは、ワットら 15に記載されている。

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Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

感染エボラウイルスでの作業は、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。粒子（trVLPs）のようなTetracistronicミニゲノム含有複製と転写可能ウイルスは、私たちが安全にエボラウイルスのコンポーネントのみに頼って、バイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することを可能にするライフサイクルモデリングシステムを表している。

Tetracistronicミニゲノムを含むウイルス様粒子とバイオセーフティレベル2の条件の下ではエボラウイルスのライフサイクルのモデル化

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K ビュー.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. 感染エボラウイルスでの作業は、バイオセーフティーレベル4の研究室に限定されています。粒子（trVLPs）のようなTetracistronicミニゲノム含有複製と転写可能ウイルスは、私たちが安全にエボラウイルスのコンポーネントのみに頼って、バイオセーフティーレベル2の条件で複数の感染サイクルをモデル化することを可能にするライフサイクルモデリングシ?...

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Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

フィールドメソッド、バイオセーフティ、および交通の問題解決：FTAカードによる鳥インフルエンザのサーベイランス

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

免疫・感染学

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

上のシステイン残基の溶媒アクセシビリティの分析<em&gt;トウモロコシrayadoフィノウイルス</emで生産&gt;ウイルス様粒子<em&gt; Nicotiana benthamianaの</emVLPは、ペプチドの&gt;植物と架橋

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

1.バイオセーフティレベル4戦士研究所スイートの入り口と出口の手順：（A）BSL-4実験室での安全上のご注意と操作手順

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

インフルエンザAウイルス核を持つマウスMx1のタンパク質の共免疫沈降

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

マウス子牛に対する一貫したマッサージ様摂動の適用と、結果として生じる筋肉内圧変化のモニタリング

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

狂犬病ワクチンの効力を評価するインビトロELISA試験

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...