このプロトコルは、標的遺伝子送達がB-1a細胞の局在および機能に与える影響を評価することができ、生体内の遺伝子治療の可能性を調べるための有用な概念実証アプローチとなり得る。この方法は、一次B-1a細胞への安定かつ比較的効率的な遺伝子送達を提供し、ドナー細胞表現型および機能後の導入後の移動の同定を可能にする。この方法は、細胞生存、増殖、および機能を含む生体内の多様なドナーおよび宿主細胞プロセスを調べるために使用することができ、他の養子移動システムに適用することができる。
腹膜流体の収穫は難しい場合があります。回復を最大化し、腹膜細胞集団を汚染する可能性のある腸を穿刺しないように、細胞を徹底的に離脱してください。腹膜B-1細胞コレクションの場合は、ストレート手術ハサミを使用して、12〜14週齢の男性、CD45.1+アポリポプロテインEノックアウトマウスの腹部を表面的に切断し、湾曲したはさみを使用して皮膚を剥がして腹壁を露出させます。
25ゲージ針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、腹腔を37°CRPMI-1640培地の10ミリリットルで洗い流します。そして、尾のベースをつかんで、マウスを左右に15~20秒間十分に振るようにします。振盪後、注射器を使用して、股関節のレベルのすぐ上、腸の近くの腹膜の右下側から液体を吸引し、上皮脂肪脱離器および基礎臓器を破壊しないように注意する。
6~7ミリリットルの洗浄液を採取した後、液体を氷上の50ミリリットルの円錐管に分配する。鉗子を使用してダイヤフラムの上の腹壁をつかみ、残りの流体が腹腔の底に残るように動物の垂直標高を可能にします。外科的はさみを使用して、肝臓自体を切断することなく、肝臓の上の腹膜壁に小さな切り傷を作ります。
そして、ガラスのピペットと電球を使用して、残りの腹膜液を収集します。すべての流体が採取されると、すべてのマウスから腹膜洗浄細胞をアリコートし、氷上の50ミリリットルチューブにチューブ濃度あたり10〜8番目の細胞を10倍から1回加算します。遠心分離により細胞を沈下する。
各ペレットを1ミリリットルの抗CD16/CD32抗体で1ミリリットルずつ再懸濁し、アッセイバッファーで1~50%の比率で希釈し、摂氏4度で10分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、各チューブに同量のビオチン化抗体マスターミックスを加え、摂氏4度で20分間インキュベーションし、チューブあたり5ミリリットルのアッセイバッファーで洗浄します。細胞濃度と製造業者の推奨に従って、適切な量の抗ビオチンマイクロビーズと適切なインキュベーション持続時間でペレットを再懸濁し、チューブあたり5ミリリットルアッセイバッファー洗浄を行います。
各ペレットを500マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁し、適切な数の磁気選択カラムに、カラムあたり3ミリリットルのアッセイバッファーを備えます。濃縮されたB-1細胞を含む溶出物を氷上の15ミリリットルの円錐チューブに集めたプライミングカラムに細胞を移す。次に、全体の回収体積が10ミリリットルになるまで追加のアッセイバッファーで各磁気選択カラムを洗浄し、B細胞培養培地中のミリリットル濃度当たり10〜6番目の細胞に対して、精製後の細胞画分を1回10倍に再懸濁させた。
腹膜B-1細胞を刺激するために、非伝達制御のために7番目の細胞に少なくとも10回10を確保し、残りの細胞をトランスダクションのために2つの等しい体積に分割した。培地濃度の150マイクロリットル当たり5番目の細胞に細胞を1.5倍に希釈し、1つの96ウェルラウンドボトムプレートのウェルに150マイクロリットルの細胞を加えて、トランスダクション条件を行います。その後、各ウェルにTLR9アゴニストの100ナノモルを加え、16〜18時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れます。
腹膜B細胞のレトロウイルス伝達については、氷上のリン酸トランスフェクションのレトロウイルス粒子ストックを解凍し、ポリブレンおよび新鮮なβ-メルカプトエタノールの1ミリリットル当たり8マイクログラムの存在下で20〜1の適切なプレートおよび感染の多重性の各ウェルに制御およびケモカイン受容体レトロウイルス上清を直ちに加える。すべてのウイルスが加えられたら、遠心分離によって細胞をスプウイルス化し、細胞培養インキュベーターにプレートを3時間置く。インキュベーションの終了時に、新鮮なB細胞培地および一晩のインキュベーションで再めっきするための細胞を収穫する。
他の腹膜細胞タイプの磁気枯渇後、除菌後の分率中の生きたシングル細胞は、F4/80+マクロファージに比べてCD19+B細胞の割合が高く、CD5hi CD19-T細胞が不足しており、プレプレダダクション画分と比較してCD19+CD5培地B-1a細胞の頻度が増加した。そして正常に導入されたGFP+B-2、B-1、B-1a、およびB-1b細胞サブセットの頻度の増加は、ウイルス感染の多重度の増加と直接相関している。そして、24ウェルまたは6ウェルプレートの使用と比較して、96ウェルラウンドボトムプレートを使用して、トランスダクション効率をさらに高めることができます。
CXCR4-GFPレトロウイルスのトランスダクションは、B細胞の生存率に大きな影響を与えることなく、CXCL12に対するB-1細胞CXCR4過剰発現およびインビトロ移行の増加を誘発する可能性があります。さらに、養子に転写されたCD45.1+ドナー細胞は、細胞移動後17週目のCD45.2レシピエントマウスの骨髄および脾臓からの回復後、CXCR4過剰発現を持続した。注意すべきは、CXCR4発現とドナー細胞の骨髄への局在化との間の肯定的な関連が決定されたが、脾臓ではない。
骨髄中のドナー細胞数と抗MDA-低密度リポタンパク質IgMの血漿量との間で観察された正の関連付けを有する。多くの追加技術は、標的遺伝子導入が疾患の発症に及ぼす影響や、宿主生理学に影響を与える分泌因子を導き出すドナーなどの質問に答えるために利用することができる。
