インフルエンザウイルスPPを産生し、その感染性を決定するこの技術は、BSL-2都市におけるインフルエンザウイルスの研究を簡素化することができる。PPSのqRT-PCRデータに基づいて、感染のPPSを正規化した。2つの糖タンパク質発現プラスミドがコード化され、ウイルス再分類に関する研究を簡素化することができます。
細胞の播種の翌日、逆光顕微鏡で細胞の形態と密度を確認します。理想的には、細胞はトランスフェクションで約85%コンフルエントでなければなりません。培地をウェルあたり1ミリリットルの無血清DMEMに置き換え、プレートをインキュベーターに戻します。
トランスフェクションされる細胞のウェルごとに、トランスフェクション試薬の8マイクロリットルを、血清培地を減らして150マイクロリットルの体積に希釈する。溶液をやさしく混ぜ、室温で5分間座らせます。一方、プラスミドDNAの2.5マイクログラムを158マイクロリットルの減らされた血清培地に希釈する。
5分間のインキュベーションの後、希釈したDNAと希釈トランスフェクション試薬を組み合わせ、溶液を軽く混合し、室温で15分間放置します。DNA脂質複合体を、無血清培地中の細胞と対応するウェルに添加する。その後、前後に揺らすことでプレートを穏やかに混ぜます。
プレートを摂氏37度、炭酸ガス5%を4~6時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、1ウェルあたり2ミリリットルのDMEMに交換します。その後、さらに36〜48時間インキュベートします。
各タイプの感受性細胞をウェルあたり10,000個の細胞と96ウェルプレートでシードします。その後、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターで一晩プレートを残します。トランスフェクション後3日目に、ピンクやオレンジを薄くする必要がある培地の色を確認し、440〜460ナノメートルの波長の下で反転したフローレス生物顕微鏡で細胞を調べます。
トランスフェクション後38~48時間で、0.45マイクロメートルのポリビニリデンフッ化膜フィルターを通過して細胞の破片を除去し、少量のアリコートに分けてマイナス80°Cで保存することで、pseuotyped型粒子またはPPSを収穫します。PPSを定量化するには、精製されたウイルス粒子の30マイクロリットルを1.5マイクロリットルのRNase-フリーチューブに移し、ベンゾナーゼヌクレアーゼを1マイクロリットル加えます。DNAおよびRNA汚染を除去するために、チューブを摂氏37度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、サンプルをマイナス70°Cに凍結してヌクレアーゼを活性させ、2マイクロリットルのプロテイナーゼK.Incubateを30分間添加してエンベロープタンパク質を消化し、CMV-GFP RNAを放出します。その後、3分間摂氏100度でプロテアーゼKを非活性にします。テキスト原稿で指定されたプライマーおよびプローブでユニバーサルプローブワンステップRT-qPCRキットを使用して、定量的な逆転写RTPCRでPPSを定量化します。
PPSを1ミリリットル当たり10~5回目のRNAコピーの4倍に正規化します。その後、H7N9ヘマグルチニンを収容するPPSに1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度にTPCK-トリプシンを加えます。PPSを摂氏37度で1時間インキュベートし、機能サブユニットHA1とHA2を形成します。
正規化したPPSとDMEM培地を1対1の比率で混合し、感受性のある細胞を含むプレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。上清を吸引し、100マイクロリットルの予め温めたPBSで細胞を1回洗浄します。各ウェルに100マイクロリットルのPPS-DMEM混合物を加え、各タイプのPPSの感染性試験を1つの感受性細胞株に3トリクロミケートする。
37°Cと5%の二酸化炭素で4〜6時間プレートをインキュベートします。その後、上清を吸引し、感染検出前にさらに24〜36時間プレートをインキュベートするDCMの100マイクロリットルに置き換えます。私たちの結果は、PPSは現在、人々に感染していると考えられています。
従って必要な安全なガードのプロシージャは、マスクを着用し、バイオセーフティキャビネットで感染アッセイを行うなどの取ることを推奨します。このプロトコルは、2つのグループ化されたヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼ属の胞口炎ウイルスG糖タンパク質またはエンベロープ糖タンパク質を有する10種類の擬似型粒子またはPPSを生成するために生成した。PPSを透過型電子顕微鏡で画像化し、その感染率をA549とMDCKの2つの細胞株で評価した。
H5を収容するPPS群では、H5N1、H5プラスN9およびH5の感染率は、それぞれ約90%18%、細胞株A549と40%5%および5%であった。H7を収容するPPS群では、H7N9、H7プラスN1およびH7の感染率は、それぞれ約10%7%、細胞株A549、8%4%および1%であった。血液胞性口内炎ウイルスG糖タンパク質PPの感染率は、A549で約21%、MDCK細胞で16%であった。
デルタエンベロープ糖タンパク質PPは感染性を示さなかった。PPプロデューサーHEK-293T/17細胞は、この手順の基礎を構成することを覚えておくことが重要です。したがって、最適な成長は私たちにHEK-293T / 17細胞を教えてくれるのが最も重要です。
この手順に従うか、またはL2受容のような他の試験に従って、境界アッセイを行うことができる。このアッセイは、受容体好みの生物学的特異性をほとんど取り除き、パターンはPPSのトロピズムを明らかにすることができる。彼らはインフルエンザウイルスから糖タンパク質を取ったので、2プラスマックスにクローン化されます。
HAとNAタンパク質は別々に研究することができるので、それらの間で再分類を行います。変異体および成熟した効果を探索することができる。
