著者は、博士の研究室で過去と現在のメンバーに感謝したいと思います。 NDVの開発のためのピーターPaleseとアドルフォ·ガルシア·サストレは遺伝学技術を逆にし、技術支援のために。 AG-Sの実験室でのニューカッスル病ウイルスの研究は、部分的に学位授与機構によって資金を供給されるR01AI088770を付与し、新興·人獣共通動物の疾患（CEEZAD、受賞番号2010-ST-061-AG001）のための優秀省国土安全保障省科学技術センターの。 LM-Sの実験室での研究は、NIHの助成金RO1 AI077719、R21NS075611-01、R03AI099681-01A1、インフルエンザ研究サーベイランス（HHSN266200700008C）、および生物兵器防衛免疫モデリングロチェスター大学センター（HHSN272201000055C）のための優秀NIAIDセンターによって資金を供給される。

1。哺乳動物細胞の作製（図4A、1日目） スプリットのHEp-2またはA549細胞を6ウェルプレート中のトランスフェクションの前日。細胞の密度は、翌日80〜90％のコンフルエンスに到達する必要があります。通常、コンフルエント100mmの皿（ウェル当たり1×10 6個程度）8ウェルに分割することができる。各ウイルスを救出するためには、2〜4の異なるウェルが含まれなければならないだけでなく、それぞれトランスフェクションおよびMVA-T7感染効率を監視することを目的としたコントロールのpCAGGS-GFPおよびのpCITE-GFP 18用の2余分な井戸、、。 2。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ（MVA-T7）を発現する組換え改変ワクシニアアンカラウイルスに哺乳動物細胞の感染（図4A、2日目） <ol><li> 37℃のPBS 1x/BA/PSやメディアを温める</li><li> PBS 1x/BA/PS 1mlで、二回、細胞を洗浄。 </li><li>感染多重度（MVA-T7におけるウイルスの培養哺乳類細胞に感染多重度）を室温で1時間、PBS / BA / PS内の最終容量200μl中1 PFU /細胞の。 </li><li> 3に記載したように、ウイルス感染のインキュベーション中に、トランスフェクションミックスを調製する。 </li></ol> 3。哺乳動物細胞のトランスフェクション（図4A、2日目） <ol><li>リポフェクタミンの調製は：救助の試みごとのOptiMEM250μlでLPF2000の1〜2μgのを混合し、室温で5分間インキュベートする。 </li><li> DNAの調製：のOptiMEM50μlの各救助のためのプラスミドのカクテルを作る。 0.4 PTM1-NPμgの、PTM1-P0.2μgの、チューブごとPTM1-L0.2μgのを追加します。各チューブに救出されるNDVの完全長cDNAクローンの1μgのを追加します。また、二つの制御性トランスフェクション、のpCITE-GFP（MVA-T7によるT7ポリメラーゼ駆動発現を確認するために）2μgののpCAGGS-GFP（トランスフェクション効率をチェックするため）の2μgの1、その他を準備します。 </li><li> LPF2000-OptiMEM中溶液を5分間（ステップ3.1）プレインキュベートされた後、追加250DNAチューブに溶液の液（3.2ステップ）を加え、室温で20〜30分間インキュベートする。 </li><li> MVA-T7とのインキュベーション後、吸引によってウイルス接種を除去し、DNA-LPF2000トランスフェクションミックス（ステップ3.3）と交換してください。 </li><li>各皿に、DMEM、10％FBS / PSの1ミリリットルを追加します。 </li><li> 37℃、5％CO 2で6-8時間（または一晩）感染/トランスフェクションされた細胞をインキュベートした後、新鮮なDMEM、10％FBS / PSの1.5ミリリットルをトランスフェクション培地を交換してください。 </li><li> 24時間トランスフェクション後に、対照ウェルは、トランスフェクション効率（のpCAGGS-GFP）およびT7ポリメラーゼ活性（のpCITE-GFP）（図5A）を評価するために、蛍光顕微鏡下で観察することができる。後述のように鳥の線維芽細胞に感染/トランスフェクト細胞の共培養を進める。 </li></ol> 4。鳥類細胞と哺乳動物細胞の共培養（図4A、3日目） 通常、ニワトリのコンフルエント100mmの組織培養皿（のCEF）ORダック（DEFS）胚線維芽細胞2にトランスフェ井戸ごとに使用されている。すべての救助の試みごとの鳥類細胞の十分な100mmの組織培養皿、事前に準備してください。ウイルスの効率的な救済のために、DMEM、10％FBS / PS媒体は尿膜腔液から30mMのMgCl 2を5％添加される。この時点で、24時間π、哺乳動物細胞は、MVA-T7感染、 図5Aのasevidentに細胞変性効果（CPE）を示す開始してもよい。 <ol><li> 37℃になるようにPBS 1Xとメディアをウォームアップ</li><li> PBS 1Xの1ミリリットルで、2倍、哺乳動物細胞を洗浄します。 </li><li>それらは切り離されるまで、EDTA-トリプシン0.2mlを哺乳動物細胞をトリプシン処理する。 DMEM、10％FBS / PS 1mlに細胞を再懸濁し、5％尿膜腔液を、30 mMのMgCl 2および100mmの組織培養皿に移す。同じメディアの3ミリリットルを追加します。 </li><li> PBS 1X 4mlで、二回、鳥類細胞を洗浄します。 </li><li> 1 EDTA-トリプシンmlの細胞が剥離するまで、37℃で1〜2分間インキュベートしてトリプシン処理鳥類細胞。再懸濁番目電子細胞を、DMEM、10％FBS / PS、5％尿膜腔液を8ml、30のMgCl 2を添加し8の総容積のために共培養した100mmの組織培養皿での哺乳動物細胞をトリプシン処理した細胞を4mlを加えるML（4ミリリットル哺乳類、4ミリリットル鳥類細胞）。 </li><li>穏やかに均一な分布を有し、次いで3〜4日間37℃のインキュベーター内にそれらを配置するために手で100mmの皿中で共培養された細胞を振る。 3または4日間、哺乳類や鳥類細胞の共培養後に卵を感染させるための基準は、どの程度の細胞変性効果に依存します（ などの細胞丸め、死、表面から剥離、。）MVA-T7ウイルス感染で観察される。 </li></ol> 5。鶏孵化卵の感染症（図4A、日数6-7） <ol><li>哺乳動物および鳥類細胞の共培養の3〜4日後、組織培養上清を1mlを除去し、エッペンドルフチュー​​ブに入れる。 </li><li>ベンチ遠心分離機で12,000 rpmで1分間組織培養上清細胞破片を除去するために、トップ遠心機。 </li><li>気嚢と尿膜腔との間のインタフェースを表示するには、光検卵ボックスを使用して卵をキャンドル。血管局在を回避インターフェイスの境界線上のマークを作る。無菌状態を確立するために、卵をかけて70％エタノールを噴霧。そっとマークされたその場で卵の殻に穴を作り、尿膜腔に垂直に直接針を目指して、インスリン（1ミリリットル）注射器を用いて上清500μlを接種します（図4B）。 </li><li>溶けたワックスやパラフィンで卵殻にニックをシールする。 </li><li> 37℃で2〜3日間卵をインキュベート</li></ol> 6。感染した鶏の孵化卵（図4A、日8月10日）からの尿膜液の収穫<ol><li>ニワトリ胚を殺し、血液を凝固させるために、4℃で2〜4時間、または一晩感染した卵をインキュベートする。 </li><li> （無菌状態を維持するために）70％エタノールで卵をスプレーします。 </li><li>スプーンで、エアキャビティ上に、卵の先端部分を丁寧にをタップします。卵殻が割れていると、鉗子で断片を除去し、完全に尿膜を公開します。 </li><li>血管や卵黄へのダメージを回避し、ピンセットやハサミで尿膜を切除することにより、尿膜腔を公開します。 </li><li>慎重にへらで胚を押し下げて10ミリリットルピペットで上方に流れる尿膜液（卵あたり8〜12ミリリットル）を収集。卵黄膜の損傷を防ぐ。氷上で15ミリリットル遠心管に尿膜液を移す（卵ごとに1つのチューブを使用してください）​​。 </li><li> 1,500 rpmで5分間遠心分離することにより、尿膜液を明確にする。ペレットを乱すことなく、上清を新しいチューブに移します。 </li><li>血球凝集アッセイにより、NDVの存在のためにそれらをチェックするまで、1週間まで4℃で保存サンプル、。 </li></ol> 7。赤血球凝集（HA）アッセイ allant中のウイルスの存在感染した卵からのオイッ流体はシチメンチョウ赤血球（RBC）を凝集する能力によって巨視的に決定することができる。 NDVの場合には、ml当たり単位（pfu）を形成する約10 6プラークをHAアッセイにおいて陽性シグナルを与えるために必要とされる。 HAアッセイはV底96ウェルプレート中で行われる。負（PBS 1X、非感染尿膜液）だけでなく、正の（任意のNDVウイルスから尿膜液）コントロールサンプルは、常にそれを検証するために任意のHAアッセイに含まれるべきである。 HAアッセイを実行するには： <ol><li>ピペットV底96ウェルプレート中のウェルあたりのPBS 1X50μlの。 </li><li>ピペットプレートの1列目のウェルに尿膜液のサンプル50μlを。プレートの残りの部分を2倍連続希釈を行い、最後の列のウェルから最後の、余分な50μLを捨てる。 </li><li>ウェルあたりのPBS 1Xの0.5％七面鳥赤血球50μlを分注する。優しくタップして、プレートを振る。 </li><li> 4℃（または氷）fでプレートをインキュベートまたは30〜45分間又はクリアペレットを陰性対照ウェルに形成されるまで。 </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product+review.+New+mammalian+expression+vectors.">Product review. New mammalian expression vectors.</a> Nature. 348, 91-92 (1990).</li><li>Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+of+mononegavirales.">Reverse genetics of mononegavirales.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 283, 1-41 (2004).</li></ol>

アドルフォ·ガルシア·サストレはシナイ医学部アイカーン学校が所有している組換えニューカッスル病ウイルスに関する特許の発明者である。

いくつかの要因がNDVを救済しつつ、良好な結果を達成するために考慮されるべきである。最初に、使用する完全長cDNA構築物は、NDVゲノムへの新たな導入遺伝子/修飾の機能的組み込みを可能にするように設計される必要がある。上述したように、これは、手段、必要な場合は、（i）適切な遺伝子終結（GE）は、遺伝子間（IG）および遺伝子開始（GS）配列が追加されると、（ii）は、推定上のGE...

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は、Avulavirus属 1に属する鳥類のパラミクソウイルスは、深刻な世界中の養鶏に影響を与える可能性があり、経済的に関係するので、広く研究さsurveilled人獣共通感染剤である。ていないヒトの病原体が、NDVも徹底的モデルパラミクソウイルスとして、その高度に興味深い、天然の腫瘍溶解特性6に両方の獣医分野を超えて研究されている。 NDVの研究は大幅に最初コンツェルマンおよびcoleagues 2によって狂犬病ウイルスについて記載された一本鎖の非セグメント化されたマイナスセンスRNAウイルスのための逆遺伝学技術の発展の恩恵を受けた。それらの野生型ゲノムの外来遺伝子又は改変を担持する遺伝的に改変されNDVsの様々な以来広く研究されている。これらの組換えウイルスとの連携がNDVのでなく、他の関連するHUMAだけでなく様々な病原性因子を特徴づけることが重要でしたN、インフルエンザウイルスなどの病原体7 -または緊急ニパウイルス8。さらに、異なる多くの研究は、主にウイルスの免疫刺激特性を増強することにより、NDV 6,9,10の生得的な抗腫瘍活性を改善するためのこれらの技術の使用を検討されている。組換えNDVs研究の他の関連する領域には、インフルエンザ5,11,12、HIV 13、麻疹14、SARSの15のような他のウイルス性疾患に対するワクチン候補の生成されたか、それは呼吸sincytialウイルス（RSV）16によって引き起こされる。 NDVが提供する様々な注目すべき利点はヒト集団における既存の免疫の欠如である中で、外来遺伝子の挿入、recombinatory活性の欠如と全体的な前述の自然免疫刺激特性17と組み合わせて、高い安全性プロファイルの安定性。また、Pにおける組換え価のワクチンの使用の可能性は注目すべきだNDVと高病原性鳥インフルエンザウイルス11,12の両方に対して防御oultry、。これは、このようにも人間に恐ろしい鳥インフルエンザの可能性間の特定のジャンプを防ぐために貢献し、家畜、野生から広がる、後者の可能性を減少させるための優れた方法があります。最後に、レポーターを発現するNDVは、先天性免疫応答の評価、ならびに複数のウイルスによってコードされるインターフェロン18-27アンタゴニストの同定のために使用されてきた。 組換えのレスキュープロセスは、非分節、マイナス鎖RNAウイルスは基本的に人為的リボ核タンパク質又はRNPとして知られている最小の感染性分子機構（図2）をコードするcDNAをトランスフェクトすることによって産生細胞におけるウイルス複製サイクルを強制的に構成されている。 RNPは、ウイルスポリメラーゼ（PおよびLタンパク質）、核タンパク質（NP）およびウイルスの完全長ゲノムRNAで構成されています。このRNAは+アンチは番目ですまた、ウイルスRNPのタンパク質の他の部分と関連する、相補的なRNA-ゲノムの生成に必要なEテンプレートは、自然のウイルスは感染時の細胞の細胞質（図2Aにリリースするのと同じ感染複雑を再現）。以降、このステップからは、ウイルスサイクルが変更されたゲノムをキャプシド、自然と組換えビリオンを進めることができ、（図2B）が生成されます。驚くべきことに、代わりにゲノムcDNAのゲノムcDNAのトランスフェクションが大幅に損なわれるか、完全にレスキュー効率2,28-30を廃止。ゲノムcDNAをトランスフェクトした場合であっても、トランスフェクトされた細胞内のRNPへの組換えRNAのキャプシド形成の効率は、おそらく非常に低い。このため、NDVのための救助プロトコルは、しばしば、許容細胞で、及び/又は、それらを共培養することにより、もともとトランスフェクトされた細胞から放出されたいくつかのウイルス粒子の増幅のための異なるステップを含む孵化鶏卵感染。 救助する前に、cDNAは、所望の改変を生成するために、標準的なクローニング手順により操作することができる。異なる遺伝子産物およびウイルスの調節配列の特異的変異が、率直にこの方法を実現することができるが、組換えNDVを含む公開された研究の多くは、NDVゲノムに新しい転写単位の添加を必要としてきた。パラミクソウイルス科の他のメンバーと同様に、NDVゲノムを差動ウイルスのライフサイクル1のための重要な減少勾配での3 &#39;末端に、その場所を尊重に応じて発現している6転写単位に、8つの異なるタンパク質をコードしている。このため、ゲノム内の新たな転写単位の位置を慎重にウイルス複製の導入遺伝子および障害の発現との間のバランスを達成するために選択されな​​ければならない。 PとM遺伝子との間の挿入はほとんど、tは使用されているハフ他のサイトにも13,31をテストされています。 （I）NDVゲノムに含まれるべき、新たな遺伝子はウイルスRNA依存性RNAのための適切な信号の制御下にある必要があります：何であれ、挿入、NDV cDNAへのクローニングはrescuable構築物を作製するためにいくつかのルールに従う必要があるポリメラーゼ。これらの配列は、新たなオープンリーディングフレーム（ORF）の上流に添加されなければならないので、ポリメラーゼが単一のヌクレオチド配列の遺伝子間（IG）だけ離間し、前の遺伝子（GE）及び新たな導入遺伝子（GS）の先頭の端部を認識することができる。真核生物のリボソーム翻訳を改善するための有効なコザック（K）配列の付加も良く外来タンパク質発現の32をお勧めします。NDVの（II）、効率的な複製、 パラミクソウイルス科のほとんどのメンバーについては、ゲノムの長さで、複数に依存している6 33しますので、NDVに任意の挿入は、この「6のルール」に従う必要があります。必要に応じて、REQ追加のヌクレオチドは新規ORFの下流に添加することができるuired、および（iii）導入遺伝子の配列は、レスキュー効率を損なう可能性配列、導入遺伝子発現および/またはウイルスのような生存可能なGEとGSを見つけるためにチェックされるべきである。存在する場合、これらの配列は、サイレント変異誘発により除去されなければならない。上記のルールに従う組換え完全長cDNAの生成が効率的に、ここで詳述したように、遺伝子組み換えNDVを生成するための最初のステップです。 システム内のすべてのDNA構築物は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター（ 図3）の制御下にある。この細胞質ポリメラーゼは、組換え改変ワクシニアアンカラウイルス（MVA-T7）34との同時感染によってトランスで提供されている。 図3（a）は、完全長ゲノムcDNA 5をコードしている pNDV-B1プラスミドを示す。 図3Bは PTM1プラスミドは、NPをコードを示し、 PとLのORF。 、Uをコードしているプラ​​スミドのpCITE-GFP、T7プロモーター、緑色蛍光タンパク質（GFP）、およびニワトリβアクチンプロモーター35の下で同じORFをコードするGFPのpCAGGS 18のnDer、対照として使用する。このプロトコルでは、レントジェニックNDV株のヒッチナーB1の5のcDNA（ 図4）から組換えNDVを救出する手順を示しています。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 (LPF2000)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35% Bovine Albumin (BA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>232-936-2</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS) 100x</td>
			<td>CORNING Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.03</td>
			<td>Any supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			Cell lines 
			A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 &#176;C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. 
			Embryonated chicken eggs 
			Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 &#176;C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. 
			Turkey red blood cells (RBC) 
			Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 &#176;C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 &#176;C for several days. 
			Plasmids 
			Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer&#39;s instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 &#956;g/&#956;l and stored at -20 &#176;C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. 
			Viruses 
			The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. 
			Tissue culture media and solutions: 
			DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 &#176;C. 
			10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
			1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
			100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2&#8226;6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 
			1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4&#176;C.
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rescue of recombinant newcastle disease virus from cdna

ニューカッスル病ウイルス（NDV）、 パラミクソウイルス科 1のAvulavirus属のプロトタイプのメンバーは、非分節型マイナスセンス、一本鎖、ワクチン接種のためのベクターとしての潜在的な用途でRNAウイルス（図1）エンベロープとなるヒトの疾患の治療。これらのアプリケーションの詳細な調査は、cDNAを2-5としての完全なゲノムをコードするプラスミドから組換えウイルスを救出する逆遺伝学技術の確立後に可能となった。ウイルスcDNAは、好都合には、ウイルスの遺伝子型を改変するおよび/ ​​または新たな転写単位を含むように、標準的なクローニング手順を用いて、in vitroで修飾することができる。このような遺伝的に修飾されたウイルスの救出は、感染の複数の段階に影響を与える要因を理解するための貴重なツールを提供だけでなく、抗原の発現および送達のためのベクターの開発と改善が可能に予防接種や治療のために。ここでは、組換えNDVsの救助のためのプロトコルを記述します。

NDVのレスキューは、日常的に、ウイルスの完全なcDNAへのアクセス権を持っている研究室で行われ、十分に確立された手順です。しかし、この方法の固有の確率論的な性質は、それが困難な100％の救済効率を達成することができる。プロセスの初期段階、特別にトランスフェクション効率およびMVA-T7の感染を監視し、潜在的な問題を特定するのに役立ちます。 図5（a）は成功した...

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Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。

cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

rescue-of-recombinant-newcastle-disease-virus-from-cdna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.2K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. ニューカッスル病ウイルス（NDV）は広く、とりわけ、ワクチン接種および治療のための新たなベクターを開発するために、ここ数年で研究されてきた。これらの研究は、そのような私たちがここで説明しているようなcDNAから組換えウイルスを救出するための技術、することが可能となっている。 

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

新世界Zikaウイルス感染クローンからの組換えウイルスの救出とキャラクタリゼーション

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

迅速・安全・簡易マニュアル ベッドサイド核酸抽出の全血試料中のウイルス検出

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

ジカ ウイルス特異 Immunoprivileged 臓器感染 Ifnar1-/-マウスの T 細胞応答の評価

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...