タンパク質の機能を見つけるための一般的な方法は、タンパク質を削除して何が起こるかを確認することです。しかし、あなたは必須タンパク質ではそれを行うことはできません。それは不可欠です、細胞は死ぬ。
だから、そのタンパク質を除去し、細胞死の直前に何が起こるかを垣間見る方法が必要です。タンパク質の枯渇は速くあるべきです, あなたは二次的な効果を得ることはありません.それは特定のものでなければならないので、そのタンパク質だけが除去され、必要なときに枯渇するだけです。
そして、それはそのタンパク質を除去する以外の方法で細胞に影響を与えるべきではありません.菌株を調製した後、一晩培養して、必要な希釈液を決定します。この情報を使用して、OD600 で 0.1 ~ 0.2 の十分な新しいカルチャを設定し、摂氏 30 度で成長させます。
ヒュームフードに、目的のサンプル量の30〜50%に相当するメタノールを15ミリリットルチューブに加えます。チューブをしっかりと閉じ、ラベルを付け、ドライアイスの上に置いて冷やします。次に、サンプルの長期保存用に1.5ミリリットルのチューブをラベルし、氷の上に置いて冷却します。
氷の上のサンプルあたり少なくとも1ミリリットルの水を冷却します。プレインキュベーションの開始のための目標光学密度に達したら、冷たいメタノールを含む予め準備されたチューブにサンプルを移す。チューブを少し反転し、ドライアイスの上に戻します。
これは、誘導不能制御サンプルです。すぐに、最終濃度が10マイクロモルになるようなβ-エストラジオールを加える。混ぜるために激しく渦巻く。
テキストプロトコルで概説されているように最適な時間のためにベータエストラジオールでインキュベート、以前のように文化を成長させ続けます。β-エストラジオールインキュベーション時間は最も重要なステップであり、すべてのタンパク質に最適化する必要があります。短すぎると、枯渇が不完全で遅いです。
あまりにも長く、タンパク質レベルは、あなたがオーキシンを追加する前に落ちるでしょう.ピペットは、後で追加する培養のミリリットル当たりIAAの0.5マイクロリットルをアップ。先に説明したように、非枯渇カルチャからサンプルを収集します。
すぐにIAAを750マイクロモルの最終濃度に加え、激しく旋回して混合します。混合後、できるだけ早くタイマーを開始します。実験計画に従ってサンプルを集める。
次に、サンプルを氷の上に置きます。いずれのサンプルも凍結されていないことを確認します。もしも、もしあるら、絶えず逆にしながら手でそっと温めます。
すべてのサンプルが収集され、凍結されていない場合は、3、500倍G、摂氏4度で2分間遠心分離します。メタノールとミディアムミックスを注ぎ、サンプルを氷の上に戻します。その後、細胞ペレットを1ミリリットルの水で再懸濁し、この懸濁液を氷上の標識チューブに移します。
遠心分離機は、細胞を反発させるGの15,000倍以上の速度で短時間。この後、チューブを氷の上に戻し、液体を吸引します。本研究では、分解は、酵母細胞の代謝に影響を与えることなく、特異的かつ効率的なタンパク質枯渇を達成するように調整される。
低存在性のスプライセソームPrp2およびPrp22タンパク質は、β-エストラジオールで20分間のインキュベーションの後、20%未満に枯渇し、次いでオーキシンで15分枯渇する。プレインキュベーション時間が長いと、より速い枯渇が生じるが、オーキシン添加前に望ましくないタンパク質枯渇を示す。それに比べて、より豊富なDcp1は、同じ処理で約30%までしか枯渇しなくなっています。
しかし、60分の前培養時間は、補助剤が添加される前に枯渇を犠牲にして同じオーキシン処理で13%に枯渇する結果となる。事前インキュベーション時間を最適化し、あなたのタイムポイントの間に時間を失わないでください。次に何をするかは、あなたの質問によって異なります。
10ミルの培養サンプルは、タンパク質、DNA、またはRNA分析に十分であることがわかりました。サンプリング手順もChIPに容易に適応可能です。今、タンパク質を枯渇させるために迅速かつ具体的な方法があります。
したがって、必須タンパク質の機能も見つけることができます。プロトコルはかなり安全です。メタノールは唯一の危険な化学物質です。
調剤しながら気を付けろ。メタノールはほとんどのニトリル手袋を通過することができるので、ヒュームフードでそれを行い、手袋の2ペアを着用してください。
