この作品は、消化器/カナダヘルスリサーチ/ Crohn病協会とカナダ新奨励賞の大腸炎財団のカナダの協会によってサポートされているLMSへのクローン病とカナダの大腸炎財団から &quot;研究の援助のグラントによってサポートされていました。

1。クロドロネート含有リポソームを用いたオゾンマクロファージ<ol><li>リポソームは、4℃で保存されている注射前に2時間、彼らは室温（18℃）に順応できるように冷蔵庫からクロドロネート含有リポソーム、PBS-含有リポソーム、または滅菌PBS（インジェクションコントロール）を削除します。 </li><li> 1mlのシリンジに200μlをロードする前に均一な分布を確実にするためにリポソーム8-10倍を含むチューブを反転します。注射器の上部に26ゲージの針を取り付けます。 </li><li>左手、首筋だけで頭と手足を固定するのに十分な皮膚を持って耳を下にマウスを使用します。 </li><li>内部器官は腹部の右下の象限に位置しています注射部位から離れて移動するので、頭が地面に向かってわずかになるようにマウスを傾けてください。 </li><li>手のひらの間に注射器を転がし、6回注入に均等に前のリポソーム溶液を配布し、それを反転させる。 </li> &lt;LI&gt; 30から40度の角度で、マウスの腹部の右下側に針を挿入します。リポソーム溶液またはPBS200μlを注入します。 </li><li>誘発炎症モデルの中に、DSS誘発性大腸炎のように、新しい浸潤マクロファージを枯渇させるためのプロトコルの間に常駐マクロファージと2日毎の枯渇を確保するための実験的炎症の発症に先立って4日間のマウスを注入します。 </li><li>実験の最後に、計画された実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ枯渇を確認するために、パラホルムアルデヒドで固定します。 </li></ol> 2。骨髄穿刺液からの偏マクロファージの誘導<ol><li>生後8〜12週間の間にマウスからの骨髄は、骨髄由来マクロファージの最高収率を提供しています。マウスを安楽死させると、その後ろに置き、可能な限り、その手足を伸ばし、その足を突き止める。 </li><li>ホー滅菌での作業dは、できるだけ多くの筋肉のように離れて切断、大腿骨と脛骨を削除します。 </li><li> 10％FCSをIMDMを使用して骨からフラッシュ骨髄は26ゲージの針を備えた5mlの注射器にロードされます。 </li><li>希薄骨髄は10％FCS、75 cm 2の組織培養フラスコ内の場所のセル、および37℃、5％4時間CO 2をIMDM 40 mlに吸引する。このステップでは、造血前駆細胞から接着性の間葉系細胞や成熟したマクロファージを削除します。 </li><li> 1200 rpmで5分間に50 mlのコニカルFalconチューブと遠心分離機に非接着性の前駆細胞を含む転送培養上清。 </li><li> 5ミリリットルIMDM、10％FCSに再懸濁し、細胞ペレットを酢酸中で20に細胞懸濁液1を希釈することにより有核細胞をカウントします。この手順では、赤血球、残りの核を含むすべての細胞は血球計算板でカウントすることができ溶解する。 </li><li> 0.5×10 6細胞/完全培地のmlで再懸濁し、IMDM、10％FCS、150μMモノチオグリセロール（MTG）、およびMCSF、GM-CSF、またはIL-3のいずれかの10 ng / mlの。 GM-CSFまたはIL-3由来のマクロファージを交互にアクティブ化されるのに対し、MCSF由来のマクロファージは、古典的なマクロファージを活性化される。 </li><li>非接着細胞をスピンダウンし、フラスコに戻し、4日目に培地を交換し、7日、廃棄、非付着細胞では。 </li><li>さらに、IFNγ（10 ng / ml）を、またはIL-4（10 ng / mlの）はそれぞれ、古典的活性化あるいは活性化表現型にスキューマクロファージに7日目にMCSF由来細胞を含むフラスコに添加することができます。さらに3日間細胞をインキュベートします。 </li><li> 10日目に、メディアを取り出し、細胞解離バッファー（GIBCO-BRL）を用いて組織培養フラスコから細胞を持ち上げます。場所5室温で5分間細胞（18℃）でのバッファのmlとし、手のひらのかかとをしっかり数回フラスコの側面を強打。細胞がフラスコの下を調べることにより、フラスコからリフトオフされていることを確認し顕微鏡。ピペットで15 mlコニカルファルコンチューブに細胞を再懸濁し、IMDM、10％FBS、追加の10mlでフラスコを洗います。プール、300×gで5分間、細胞をスピンダウンする。 </li><li>滅菌PBS pH7.4の10 7細胞/ mlの濃度で血球と再懸濁しを使用して生細胞をカウントします。マクロファージは、マウスに注入するための準備が整いました。 </li><li>リザーブ1.0×マクロファージ表現型を評価するための10 6マクロファージ。リポ多糖を分泌する一酸化窒素の高濃度とIL-10のIL-12p70と低レベルで刺激した古典的活性化マクロファージは、代わりに活性化マクロファージと比較されます。あるいは、活性化マクロファージは、恒常的にYM1とウエスタンブロット法によって検出することができアルギナーゼI（argiは）を表現します。 </li></ol> 3。マウスへのマクロファージをTranferring <ol><li> 10 7細胞/ mlの濃度で滅菌したPBSに再懸濁し、マクロファージ。これにすることができ安全かつ快適に尾静脈によってマウスに注入することができるボリュームです。100μlの総体積で10 6マクロファージのtravenous注入。 </li><li>尾静脈を拡張するために5〜10分間加温パッドや熱ラップを使用して、暖かいマウス。温熱療法の兆候がすべての回でマウスを監視することができます。 </li><li>尾静脈へのアクセスを許可抑制デバイスにマウスを転送します。 </li><li>尾を90°回転させ静脈が上向きになるように。静脈は尾の両側の下、横方向で実行のいずれか静脈を使用することができます。 </li><li>アルコール綿棒で注射部位をきれいにし、徐々に26または28ゲージの針を1 mlのシリンジを用いて100μL（10 6マクロファージ）を注入します。上向きベベル側と静脈にほぼ平行にわずかに角度で針を挿入します。 </li><li>針が正しく挿入されている場合には抵抗を感じてはいけませんと静脈注射後に明らかになるはずです。針が含まれていない場合静脈、尾が膨らみます。この問題が発生した場合は、針を除去し、再び最後の試行またはその他の静脈に近接してみてください。テールはタフで、針が尾静脈注射時にすぐに鈍くなるように新しい針は、それぞれの注入を使用する必要があります。 </li><li>注射後、針を除去出血が止まるまで注射部位に穏やかな圧力を適用し、その出血が停止していることを確認するために追加の5分間マウスを監視することができます。 </li><li>実験手順の間に偏光マクロファージの連続的な配信を保証するために4日ごとにマクロファージの注入を繰り返します。 </li><li>実験の最後に、実験的解析とともに、興味のあるサイトからの組織を除去し、免疫組織化学的染色によりマクロファージ偏光の効果的な配信を確認するために、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンで固定します。 </li></ol> 4。代表的な結果常駐macropの数と表現型任意の組織でhagesは、検証される組織に依存しており、感染や炎症時に変更されます。同様に、組織からマクロファージを枯渇させるクロドロネート含有リポソームの能力は、管理および標的組織への効果的な配信の経路に依存します。 F4/80の減少クロドロネート含有リポソームの結果+マクロファージマーカーの免疫組織化学的染色、F4/80（ 図1A）によって明らかDSS誘発性大腸炎の間にマウスの結腸におけるマクロファージの腹腔内注射。組織染色は、組織切片中のマクロファージ数および表現型の量的違いを決定するために使用することができます。 図1Bは、マウスを注射されたとき、マクロファージの55％の平均が、マウスのコロンで検出されない枯渇に比べクロドロネート含有リポソームで枯渇していることを示していますインジェクションコントロールとしてPBS単独。各値は、F4/80とargiは染色数えることによって決定されます実験条件に盲二人の人物によって行われているカウントとマウスあたり3つのセクションの3ポイントで6匹のマウスからシリアル組織切片のED陽性細胞、。これらの結果はクロドロネートリポソームの腹腔内注射は、マウスの大腸マクロファージを枯渇させることを示している。 （GM-CSFまたはIL-3由来またはMCSF由来と古典的活性化（MCSF由来またはMCSF由来とIFNγで処理する）か、あるいは活性化される別の成長因子の利回りマクロファージの存在下で骨髄からマクロファージの誘導IL-4）で処理した。 8週齢のマウスから2大腿骨と2脛骨から骨髄をフラッシュすると、通常はマウスあたり6×10 7個の有核細胞と収量8×10 6 MCSF由来マクロファージ、10×10 6、GM-CSF由来のマクロファージ、または12を生成する× 10 6、IL-3由来のマクロファージ。図2Aは、マクロファージの亜硝酸塩とIL-12p70/IL-10比SUPのを示していますernatantsは24時間リポ多糖で処理され、図2Bは MCSFから0.5×10 6マクロファージの典型的なウェスタンブロット分析を示す+ / -は。IL-4誘導条件は、argiは、代わりに活性化マクロファージのマーカーに対する抗体とYM1をプローブとして、またはGAPDHとコントロールをロードする。これらのデータは、骨髄由来マクロファージを誘導中に、偏光の表現型に偏りが発生する場合がありますことを実証している。 ex vivoで派生した偏光マクロファージの組織への効果的な転送は、管理および組織へのアクセスの経路に依存しています。 DSS誘発性大腸炎の間に、マクロファージが静脈内炎症部位 ​​に移動し、代わりに活性化マクロファージは、疾患の重症度を軽減する注入した。 図3Aは、マクロファージや偏光を注入したマウス由来の組織切片でカウントargiは+（あるいは活性化）マクロファージの数の合計数を示しています。骨髄由来マクロファージ。 DSS誘発性大腸炎の間に大腸に偏マクロファージの移動の影響は、疾患活動性指数、体重減少、直腸出血、減少して便の硬さ（ 図3B）に基づいて、添加剤のスコアで示されています。これらの結果は、ex vivoで、派生ことを示している、養子転送マクロファージがコロンと衝撃誘発炎症へのトラフィックをすることができます。 M2マクロファージが有意に疾患活動性指数を減らす一方、M1マクロファージは、炎症に影響を与えません。 <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。クロドロネート含有リポソームは、実質的にin vivoでのマウスのコロンでF4/80 +およびF480 + argiは+細胞を枯渇させる。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代前DSS処理をPBS（対照）またはクロドロネート含有リポソーム（クロドロネート）4日とIP 7日間の5％DSSを与えられ、注入したと0日、2、4、6のDSS治療中。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー、argiはのための免疫組織化学によって染色された。 F4/80 +とargiは+マクロファージ（B）の定量。積極的に染色した細胞は、3つのセクション/マウスから6匹のマウス/群から6つのフィールドでは40倍の倍率での実験条件に盲検2個人によってカウントした。 * P &lt;0.01。 <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。MCSF由来のマクロファージは、古典的活性化表現型を発現し、IL-4で処置したMCSF由来のマクロファージは、代わりに活性化マクロファージの表現型を表現しています。 （）古典的活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、リポ多糖に応答して、一酸化窒素の高いレベルを生成し、その下流の代謝物、亜硝酸塩を検出したグリースアッセイによって測定することができる。彼らはALSELISAにより測定することができ、より高いIL-12p70/IL-10比を生成O。 * n = 3のためのP &lt;0.01。 （B）あるいは活性化表現型と一致して、MCSF由来のマクロファージは、免疫ブロット法ウェスタンによって検出することができ、IL-4構成的に明示YM1とargiは、処理した。データは、同様の結果3つの独立した実験の代表的なものである。 <img src="/files/ftp_upload/4105/4105fig3.jpg" alt="図3"/> 図3静脈内注入し、ex vivoで由来の代わりにコロンにマクロファージのトラフィックを活性化し、腸の炎症を軽減します。混合C57BL / 6×129Sv背景の上に野生型マウスのF2世代は、6日間の彼らの飲料水の5％DSSを与えられた。 M1とM2マクロファージはDSS処理中に0日目と4日に静脈注射した。 （A）コロンは、削除され固定され、セクションは、成熟したマクロファージ（F4/80）とM2マクロファージマーカー（argiは）の免疫組織化学によって染色したしました。コントロールPBSを注射したマウスのためにマクロファージの定量（C）、M1マクロファージ（+ M1）とM2マクロファージ（+ M2）を注射したマウスに注射したマウスは、3つのセクション/マウスからの6つのフィールドでは40倍の倍率で積極的に染色された細胞を数えることによって行った。 6匹/群から。カウントは、実験条件に盲二人の個人によって行われた。 （B）疾患の活動が監視され、治療期間中、毎日記録し、体重減少、直腸出血に基づく添加物のスコアであり、便の硬さを減少した。 * P nの&lt;0.05 2つの独立した実験で= 6マウス。

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利害の衝突が宣言されません。

マクロファージは、免疫システムにおいて重要な役割を果たしている貪食細胞である。彼らは、自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導する責任があります。一般的に、古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPSによって活性化され、病原体を排除し、炎症反応1をマウントするための責任がありますされています。逆に、代わりに活性化マクロファージはIL-4あるいはIL-13?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>クロドロネート含有リポソーム</td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td> PBS-含有リポソーム</td><td> <a href="http://Clodronateliposomes.org" target="_blank">Clodronateliposomes.org</a> </td><td></td></tr><tr><td>滅菌したPBS pH7.4の</td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12440 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FCS） </td><td>インビトロジェン</td><td> 12483 </td></tr><tr><td>酢酸</td><td> BDH Aristar </td><td> BDH3092-500MLP </td></tr><tr><td>モノチオグリセロール（MTG） </td><td>シグマ</td><td> 96から275 </td></tr><tr><td> RecombinantマウスMCSF </td><td> Stemcellテクノロジーズ</td><td> 02951 </td></tr><tr><td>組換えマウスGM-CSF </td><td> Stemcellテクノロジーズ</td><td> 02935 </td></tr><tr><td>組換えマウスIL-3 </td><td> Stemcellテクノロジーズ</td><td> 02903 </td></tr><tr><td>組換えマウスIFNγ </td><td> Stemcellテクノロジーズ</td><td> 02746 </td></tr><tr><td>組換えマウスIL-4 </td><td> Stemcellテクノロジーズ</td><td> 02714 </td></tr><tr><td>細胞解離バッファー</td><td>インビトロジェン</td><td> 13150-016 </td></tr><tr><td>ラットanti-F4/80抗体</td><td> ABD Serotec </td><td> MCA497GA </td></tr><tr><td>マウス抗argiは抗体</td><td> BD伝達研究所</td><td> 610708 </td></tr></tbody></table> 表1は、このプロトコルで使用される特定の試薬 ​​が含まれています。

depletion and reconstitution of macrophages in mice

マクロファージは自然免疫応答を開始し、後天性免疫応答を誘導、伝染性の課題やけがに対する自然免疫応答において重要なプレーヤーである。マクロファージ機能障害は、適切な免疫応答をマウントすることができないにつながることができ、そのように、炎症性腸疾患を含む多くの病気のプロセスに関与されています。マクロファージは、次の2つのカテゴリに大別されている偏光の表現型を表示します。古典的活性化マクロファージは、IFNγまたはLPS刺激によって活性化され、解像度で交互に活性化マクロファージのに対し、IL-4あるいはIL-13によって活性化され、掃気破片や組織リモデリングに参加し、関与している細菌のチャレンジへの応答に重要な役割を果たす炎症の段階。 in vivoでの炎症反応時には、マクロファージが免疫細胞の浸潤の複雑な混合物の中で発見されており、悪化またはresolvinで参加することができますgの炎症。全体の動物モデルにおけるin situでのマクロファージの役割を定義するためには、複雑な環境からマクロファージを枯渇の影響を検討する必要がある。 in situでマクロファージ表現型の役割についての質問をし、表現型が定義された偏光マクロファージは骨髄穿刺液から、ex vivoで誘導することができるとマクロファージの事前の枯渇であるかどうかにかかわらず、マウスに戻って追加しました。プロトコルでクロドロネート含有リポソームここで紹介するのに対し、PBS注入されたコントロールは、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発マウスにおける大腸炎の間に大腸マクロファージを枯渇させるために使用された。さらに、偏光マクロファージはex vivoで誘導され、静脈内注射によりマウスに転送されます。このアプローチには注意点がクロドロネート含有リポソームは枯渇によって観測された効果はマクロファージ特異的、再Oであることを確認するため、樹状細胞やマクロファージの両方を含むすべてのプロの食を枯渇させることです。マクロファージの移入によってfの表現型が必要です。マウスの全身のマクロファージの枯渇は、優れた補完的なアプローチであるCD11bを-DTR背景に戻し交配マウスによって達成することができる。クロドロネート含有リポソーム媒介枯渇の利点は、戻し交配マウスに必要な時間と費用を必要とせず、それは関係なく、マウス（C57BL / 6、BALB / c、または混合背景の背景のマウスで使用することができることです。 。）

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Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します<emin vivoでの&gt;</em&gt;、骨髄穿刺液から偏マクロファージを導出し、養子マウスにマクロファージを転送する。これらの技術は偏光マクロファージは、健康と疾患に果たす役割を決定することができます。

マウスのマクロファージの枯渇と再構成

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

39.4K ビュー.  University of British Columbia. マクロファージは、多くの組織の恒常性と病理学の中心的な役割を果たしています。ここで紹介するプロトコルは、マクロファージを枯渇させるための方法について説明します、骨髄穿刺液から偏マクロファージを導出し、養子マウスにマクロファージを転送する。これらの技術は偏光マクロファージは、健康と疾患に果たす役割を?...

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Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

免疫・感染学

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

ライブマクロファージにおけるファゴリソソーム生合成の研究

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em&gt;体外</em&gt;ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em&gt;クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

特定および効率的なタンパク質枯渇を達成するための分解性の調整

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...