プロトコルの重要性は、核シグナル伝達に膜に依存し、誘導多能性幹細胞の場合のように、ゲノムに直接影響を与えません。血液由来多能性幹細胞の非催奇形性は、この技術の主な利点であり、再生医療の様々な分野における安全な臨床応用に適しています。この手順のデモンストレーションは、プロジェクトリーダーのアン=キャスリン・ショット博士と、私の研究室のラボアシスタントであるオクサナ・グリーンエーカーです。
PBMNCを分離するには、PBSで希釈した1対1の血液25ミリリットルを10ミリリットルの密度勾配培地に加え、300倍Gで混合物を30分間遠心分離する。プラズマと密度勾配媒体の間のインターフェース層をピペット処理で分離します。10分間、無菌PBSと遠心分離機を5ミリリットルで300倍Gで洗浄します。
手順を2回繰り返した後、計数チャンバーを使用して細胞の数を数える。6個目の単核細胞に6×10を加えて15ミリリットルチューブに加え、ヒトGPI結合膜タンパク質特異的抗体をPBS内の細胞に1%BSAで添加し、摂氏37度で30分間インキュベートすることにより、抗体架橋を行う。架橋後、インキュベーション培地をイコーブの修正ダルベッコの培地に10%FBSを補充して交換してください。
細胞を摂氏37度のインキュベーターに入れ、8~10日間、揺れることなく8~10日間培養器に入れて、細胞を15ミリリットルのポリスチレンチューブで成長させます。5日目には、15ミリリットルのチューブに10%FBSを加えたアイスコベス培地を1~2ミリリットル追加します。培養した細胞を計数チャンバーで数えます。
次いで、細胞懸濁液を約5x10から6番目の細胞を300倍Gで10分間遠心し、滅菌パスツールピペットで得られた上清を吸引する。0.5%BSAおよび2ミリモルEDTAでpH 7.2の予冷却されたPBSの90マイクロリットルの細胞ペレットを再懸濁する。その後、80マイクロリットルのCD-45正のナノサイズの磁気ビーズを細胞懸濁液に加え、氷上で15分間インキュベートします。
細胞を洗浄するには、PBSバッファーと遠心分離機を2ミリリットルGに10分間加えます。細胞を500マイクロリットルのPBSバッファーに再懸濁させる。500マイクロリットルのPBSバッファーでカラムを洗浄し、磁場に入れます。
細胞懸濁液をカラムに置き、500マイクロリットルのPBSバッファーで2回洗浄します。1%BSAを補充したIscoveの培地内の細胞を収集し、計数チャンバー内の細胞を数えます。ガラスカバーリップを4ウェルプレートに入れ、1~5個の希釈ポリL-オルニチンと二重蒸留水でコーティングします。
37°Cで1時間のカバーリップをインキュベートした後、二重蒸留水でそれらを洗います。ラミニン1ミリリットル当たり0.5~2ミリグラムゆっくりと解凍し、カバースリップの上部に加えます。摂氏37度で2時間インキュベートし、ピペット処理で余分なラミニンを取り除き、培養皿に神経培地N2を加えます。
ラミニンオルニチンコーティングガラスカバーリップ上のN2培地のBD由来CD-45陰性細胞を37°Cで5%の二酸化炭素を有するインキュベーターで2日間培養し、新たにBD生成細胞の神経細胞分化を開始する。次に、神経細胞分化培地中の培養細胞を、16日間摂氏37度、5%の二酸化炭素をインキュベーターに入れる。75ミリリットルの無菌水と4グラムのパラホルムアルデヒドで固定剤を調製します。
溶液がクリアになるまで攪拌しながら、必要に応じて10個の通常の水酸化ナトリウムを加えます。溶液にスクロース混合物を加え、6つの通常の塩酸でpH 7.4に合わせてそれを評価します。滅菌水で100ミリリットルにボリュームを持参してください。
細胞培養液から培地を取り出した後、15分間前温固定液でインキュベートし、その後、固定液を捨て、それぞれ5分間3回細胞を洗浄する。すぐに作りたての0.3%Triton-X溶液を加え、5分間細胞を透過させます。PBSで3回洗浄し、PBSと5%BSAのブロッキング溶液を追加します。
ロッカープレートの室温で細胞を1時間ブロックします。1%BSA PBSで適切な抗体希釈を調製し、細胞をロッカープレート上の抗体と共に室温で1.5時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄し、1回5分間洗浄します。
DAPIで細胞をインキュベートし、顕微鏡で視覚化するための取り付け媒体とカバーリップを取り付けます。BDの変種学的側面を1日目、5日目、10日目に研究し、非活性化細胞の徐々に消失し、活性化培養中の細胞の新しい集団が着実に増加する傾向を示した。BDの分化細胞は小さく、ESCに類似した凝縮クロマチンを有する小オルガネラおよび大きな核を有する未熟な顆粒細胞の特徴を示した。
細胞は、30日間ラミニンコーティングされた培養皿で培養した後の神経再分化について研究した。早ければ4日間、長い分岐構造を持つ最初の神経細胞が検出された。ほとんどの小球形細胞は、より大きな細長い形を持つ分岐細胞に発達し、神経系統への分化に向けた活発なプロセスを暗示している。
細胞の細胞体およびプロセスは、未分化細胞よりも高い複雑さを示し、大まかな小胞体およびアクチンフィラメントの束の高密度を示した。分化培地で増殖する細胞は、細胞体を含む細胞間接触を頻繁に確立し、他の細胞プロセスは神経突起のような方法で細胞プロセスを伴った。特定の抗体を用いて行われた免疫化学分析により、BDの分化細胞はGFAPアストロサイトを含む様々な神経系統に対して再分化が可能であることを確認した。
この技術により、3つの胚芽層の細胞に再分化できる自己非催奇形細胞を作り出し、再生医療研究の新たな機会を創出できる。
