私たちは、NPY-mRFPとcDNAの贈り物のために博士U. Asheryに感謝。私たちは、博士に感謝。 MJ Kofron、L. Mittleman、M. Shaharbani、およびY. Zilberstein顕微鏡と画像解析との貴重な援助のために。また、この原稿の重要な読書のために博士ジョセフ·オルリーに感謝。この作品は、科学のためのイスラエルアカデミーによって設立されたイスラエル科学財団からの助成金によってサポートされていました（RS-Eに1139年から1112年。）。

RBL細胞培養メディアの作製<ol><li> （これは、約1％のPESTを行う）（これは、10％FBSを行う）ウシ胎児血清を56 mlの低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を500mlを混合し、その後ペニシリンストレプトマイシン5.5mlのを追加する。 </li><li> 4℃で0.22μmの細孔サイズや店舗で500〜1,000ミリリットルボトル·トップ·掃除機用フィルターを使用してメディアをフィルタリングします。 </li></ol> RBL細胞の2.文化<ol><li>どちらのプレートまたはフラスコ中で37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で、RBL細胞を成長させる。 10cmプレート中で増殖されたRBL細胞を、10 mlの培地を補充し、約10 7細胞/プレートのコンフルエントな単層を形成すべきである。 </li><li>細胞層がコンフルエントに近づいたとき、より低い密度で培養物をreplate。 <ol><li>真空に接続され、無菌パスツールピペットを用いてプレート/フラスコから培養液を除去します。 </li><li>あらかじめ温め（37細胞単層をすすぎ全体単層（ボリューム培養プレート/フラスコの大きさに依存するカバー℃）0.25％トリプシン/ EDTA; 10cmプレート2）を加えた。これは細胞を剥離します。 </li><li>あるいは、リンと細胞単層を食塩水（PBS）をバッファリングすすぎ、PBSを除去し、予め温めた（37℃）トリプシン/ EDTAを加える。このステップは、より高速なセルを切り離します。 </li><li> 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。 </li><li>彼らは切り離さしているかどうかをチェックするために光学顕微鏡で細胞を検査します。細胞は10分後に取り外すなかった場合は、優しくプレート/フラスコをタップします。 </li><li>細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の体積は、少なくともトリプシン溶液の体積よりも2倍であるべきである）。 </li><li> 25℃で200gで3分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li>培地中の細胞を懸濁します。 1：10によって細胞を希釈し、新しい培養皿に播種する。彼らはREACまで、48〜72時間細胞をインキュベートH約90％コンフルエンス。 </li><li>最大3ヶ月（30継代）と同じ手順（セクション2.2.1-2.2.8）を繰り返します。 </li></ol></li></ol>トランスメディアの調製。 <ol><li> K-パイプpHが7、Ca 2+のアセテートの1 mM溶液およびMg 2+アセテートの100 mM溶液の100 mM溶液を準備します。 </li><li> DMEM培地を用いて20 mMの中にK-パイプのpH7の100mM溶液を希釈し、2の最終濃度が10μMおよびMg 2+アセテートの100mM溶液の最終濃度までのCa 2+アセテートの1mM溶液を追加mMの。 </li><li>カリウムグルタミン酸を計量し、128 mMの最終濃度に溶液に添加、よく混合し、使用するまで4℃で維持。 -20℃で残りの解決方法（ すなわち 、K-パイプ、Ca 2+の酢酸塩、Mg 2+を酢酸塩）を保管してください。 </li></ol> RBL細胞の4トランスフェクション<ol><li>使用したプレート/フラスコから培地を除去真空に接続され、無菌パスツールピペット。 </li><li>全体単分子層をカバーする必要があらかじめ温め（37℃）、トリプシン/ EDTAで細胞単層をすすぐ。 37°C（せいぜい10分）でインキュベーターでプレート/フラスコを置きます。細胞は、光学顕微鏡を用いて剥離しているかどうかを確認してください。 </li><li>細胞を懸濁するための培養プレート/フラスコに培地を加える（培地の容積はトリプシン溶液の体積よりも少なくとも2より大きい以上であるべきである）。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を数えます。 </li><li> 25℃で200×gで3分間の遠心分離により1.5×10 7細胞をペレット化。上清を破棄し、トランスフェクション培地の280μlを添加する。 4ミリメートルのキュベットに反応ミックスを転送します。 </li><li> NPY-mRFPとプラスミド20μgのを追加し、いずれかコントロール空のプラスミドまたはテストプラスミド30μgの。反応ミックスの最終容量は300μlのである必要があります。 </li><li>すぐに氷上で10分間置きます。残留水とpからキュベットを拭き9ミリ、300 Vでエレクトロポレーションにroceed。 </li><li>エキソサイトーシスの測定のために、300μlの培地を含む24ウェル組織培養皿に直ちに細胞をreplate。各ウェルに反応ミックスの8μL（4×10 5細胞）を追加します。制御のための追加のウェルに4×10 5の非トランスフェクトされた細胞を追加します。すべてのトランスフェクションのためにそれぞれの治療のために、少なくとも二連のウェルを持ってするのに十分な井戸を準備します。 </li><li>タイムラプス顕微鏡検査のために、80μlの培地を含む8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラスシステムですぐに細胞をreplate。各チャンバーに反応ミックスの1.5μL（7.5×10 4細胞）を追加します。 （カバーガラスの中央にチャンバーは画像に簡単である、カバーガラスの端にチャンバーを使用しないようにしてください）​​。 注：重要なことは、すべてのセルがトリガに応じていないと時折タイムラプス顕微鏡検査が原因8ウェルチャンバーborosiの焦点の喪失とドリフトに廃止されているlicateカバーガラスシステム。そのため、各トランスフェクションのために、各治療のために、少なくとも8室を用意。 </li><li> FcεRIを媒介活性化のための細胞を感作のために、メディア（少なくとも2時間のIgEで細胞を培養する）に、マウスのDNP特異的モノクローナルIgEの1μg/ mlのを追加します。 </li><li> 18〜24時間後の細胞は、プラスミドを発現することを確認するために、蛍光顕微鏡を使用しています。 mRFPと蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx584、およびλem607 nmの。 NPY-MRFPがSGSに対応して小胞構造に表示されます。関心のある第二の遺伝子は、蛍光タグに融合されている場合は、同じ細胞に両方のプラスミドの同時発現を確認するために蛍光顕微鏡を使用する。テストされた遺伝子は、GFPに融合される場合、GFP蛍光の励起および発光波長は、以下のとおりです。λEx488、およびλem507 nmの。 GFPタグ付けされたタンパク質は、NPY-mRFPとを表明同じ細胞で表示されます。 </li><li>エキソサイトーシスの測定のためのTを進めるOステップ5とタイムラプス顕微鏡検査のためには、ステップ6に進みます。 </li></ol> 5. NPY-mRFPとエキソサイトーシスを測定<ol><li>タイロード緩衝液の調製： <ol><li> 54のKCl、20のMgCl 2、2.74 M NaClおよびDDWさ8mmのNaH 2 PO 4の溶液を調製する。十分に混合し、4℃で保存する。このステップでは、20倍のタイロードバッファーの調製のためである。 </li><li> 20mMのHepesの溶液のpH 7、1.8のCaCl 2、1mg / mlのBSA、5.6 mMのグルコースとDDWでタイロード20Xの1から20までの希釈を準備し、よく混ぜる。このステップは、1×タイロードバッファーの調製のためである。 </li><li> -20℃で1×タイロードバッファとストアを分注し。繰り返し凍結融解は避けてください。 </li></ol></li><li> 24ウェルプレートから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄する。対照ウェルに200μlのタイロード緩衝液を添加することによって刺激されていない細胞を準備します。 </li><li> 10μL/ウェルの20Xは、試薬[（ 例えば千/ mlのDNP-BSAまたはDNPをアクティブに濃縮準備-HSA（Ag）を、200μMのCa 2+イオノフォア（例えば A23187）、および20μMのCa 2+イオノフォアと1000nmの12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（TPA）]の組み合わせ。試薬はDMSOに格納されている場合、1％DMSOを含有するタイロード緩衝液中で20倍濃度に試薬を希釈する。 30分間37℃でインキュベートする。 </li><li> 、96ウェルプレートにも慎重にそれぞれの上清を削除し、氷上に置き、光から避ける。 （上清を細胞から放出されたキメラペプチドNPY-mRFPとが含まれている）。 </li><li>各ウェルに、0.5％トリトンX-100を含有する200μlのタイロード緩衝液を添加し、10分間37℃でインキュベートする。 （このステップは、細胞から放出されていなかったNPY-MRFPの残りが含まれている細胞溶解物の準備のために重要である）。細胞溶解物を収集し、96ウェルプレートに移し、氷上に置き、光から避ける。 </li><li> fluorescを用いて、細胞上清および細胞溶解物の蛍光を測定するレンスプレートリーダー、590-、20nmのバンド幅の励起フィルター及び635-、35nmの帯域幅発光フィルターを使用して。 </li><li>リリースNPY-MRFPの割合を計算します。 注：蛍光リーダー対策任意の蛍光単位（AFU）。 AFUの値は、マシンとその感度とトランスフェクション効率に依存します。 <ol><li>ブランクとしてトランスフェクトRBL細胞の自家蛍光を設定します。全蛍光（上清のAFU +対応する溶解物のAFU）に各上清のAFUを分割し、100を掛け。 </li></ol></li></ol>エキソサイトーシスの6タイムラプス顕微鏡<ol><li> 8ウェルチャンバーホウケイ酸カバーガラス系でトランスフェクションされた細胞/チャンバーの種子7.5×10 4。 18~24時間後、チャンバーから培地を除去し、タイロード緩衝液で3回洗浄</li><li>各チャンバーにタイロードバッファーの72を添加する。 10倍の濃度にタイロードバッファ内の活性化試薬を希釈する。 </li> &lt;LI&gt;加熱室（37℃）とCO 2コントローラ（4.8％）、および40Xまたは63X目的を搭載した共焦点蛍光顕微鏡を使用してください。顕微鏡システムをオンにする：水銀ランプ、コンピュータ、およびレーザーを。加熱されたチャンバは、実験を開始する前に、右の温度であることを確認します。 </li><li>加熱されたチャンバー内に室を置き、チャンバーが正しく、安定したインストールされていることを確認してください。 </li><li>関連するフォアに係る蛍光ライトをオンにして、トランスフェクトされた細胞を可視化する。目的の細胞は、漂白及び細胞毒性を最小限にするために、フィールドに入ると蛍光をオフにします。これは、このフィールドは約2-3トランスフェクトされた細胞が含まれることが重要である。トランスフェクトされた細胞は、よく伸びるが、互いに接触しないべきである。 </li><li>ノイズや過飽和ならびに毒性を最小限にする（顕微鏡に応じて）レーザーパワーを調整し、ゲインを設定し、信号対雑音比を変更するためのオフセット。で高速スキャンまたはデルは、レーザー博覧会（平均値2）の持続時間を最小にする。 </li><li>最大ピンホールのサイズを調整し、これはレーザパワーを減少可能になり、長時間の焦点画像を維持する。所望であれば、信号対雑音比に最良の信号を与え、二次元共焦点光学スライスの順次走査を獲得1エアリー単位（AU）にピンホールのサイズを調整し、3次元画像を再構成するためにZスタックのパラメータを設定する≤0.7程度の光学スライスを持つZ -axes。 </li><li> 15分に15〜30秒にそれぞれ取得及び総取得の期間の間隔の時間を設定し、画像の取得を開始。買収の5分後時系列を一時停止する。 10倍のトリガーの8μlを添加し、すぐに取得を継続する。 </li><li> 、写真を保存するデコンボリューションソフトウェアを使用してデコンボリューションを行い、三次元画像およびIMARISソフトウェアを使用してムービーにスタックを再構成する。 </li></ol><ol><li> IMARISソフトウェアに共焦点蛍光顕微鏡によって得られたデコンボリューションされた時系列画像からデータをインポートする。このソフトウェアは、40以上の顕微鏡のファイルを読み込みます。ソフトウェアは、ファイルを読むことができない場合。 TIFファイルとインポートにファイルを変換する。 </li><li>オープンデータセットプレス編集の最後に時間点を追加するには - &gt;時間ポイントを追加し、新しいデータ·セットをインポートします。 </li><li>表面ウィザードオプションを使用してmRFPとチャネルの表面を作成します。デフォルトのアルゴリズムを選択してください。 NPY-MRFPのチャンネルを選択してください。ノイズを低減する平滑化オプションをマークします。細部の損失を回避するために0.05μmのエリア詳細レベルを下げる。 </li><li>強度閾値を設定します。新しいグレーの表面が表示されます。 「設定」に移動し、「中心点」から「面」からスタイルを切り替えます。 </li><li> 、選択したオブジェクトのプロパティの[統計]タブに移動し、詳細タブと特定の値SUCを選択蛍光強度などの時間、音量等</li><li>データを確認し、値が画像と互換性があることを確認します。例えば、二つ以上の隣接する顆粒は、大きな1つの顆粒として測定されることがあります。平均顆粒サイズを定量化するための顆粒の実際の数にマージされた顆粒の大きさに分割。 </li><li> Excelファイルに所望のデータセットをエクスポートし、データを分析する。 </li></ol> F

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The authors have no financial conflicts of interest.

我々は、エキソサイトーシスのためのレポーター遺伝子を用いて、生細胞中でのSGの時間経過の三次元撮像によりMCのエキソサイトーシス及び4の（x、y、zは、t）は、次元定量化の定量化を組み合わせた、革新的な戦略を記載している。この技術は、それらの成熟、エキソサイトーシスの能力と脱顆粒の買収を通じて、早けれゴルジからの出口として開始のSGの監視などのMC機能への影響のため...

マスト細胞（MC）は、最高の、関節炎、喘息、好酸球性食道炎、慢性皮膚炎、およびアナフィラキシーショック1,2-ならびに冠動脈疾患3,5を含む他の病態などのアレルギー及び炎症反応への関与のために知られている免疫細胞であり癌3,4。また、MCは、同種移植片寛容5,6を誘導例えば、細菌および寄生虫に対する宿主防御および免疫応答の抑制の両方によって、先天性および適応免疫において重要な役割を果たしている。 MCは、CD34 + / CD117 +多能性前駆細胞から7を開発し 、骨髄に由来する。コミット骨髄のMC前駆細胞は血流中に放出し、結合組織と上皮表面8内の主にローカライズする末梢組織中に移行されます。成熟と最終分化は、最終的には影響Oの下で達成されている周囲の環境8,9内のFサイトカイン。 MCがその遭遇イムノグロブリンE（IgE）の生成をもたらした抗体を入力アレルゲン（抗原、Ag）などによって活性化することができる。同じAgに対する再曝露の際のIgE細胞結合の架橋に続いてMCのFcεRIの受容体、このようなIgEの結合、FcεRIの凝集および細胞の脱顆粒で最高潮に達しシグナル伝達カスケードの開始の結果は[10,11に総説] 。 MCはまた、活性化された独立してIgEの、神経ペプチド5,12、13、毒素、細菌抗原およびウイルス抗原14,15によって、正に荷電したペプチドの数は、集合的に、基本的な分泌、免疫細胞およびサイトカイン5,13,12,16と称される、17。 MCがさらに炎症反応を増幅する独自のリリースメディエーターの多くによって活性化される。 MCが免疫を含ま分泌顆粒（SGS）が充てんされていそのようなキマーゼおよびトリプターゼ、血管内皮増殖因子およびいくつかのサイトカインおよびケモカイン8,9などのヒスタミン及び（げっ歯類における）セロトニン血管作用性アミン、プロテオグリカン、プロテアーゼ、を含む調節メディエーター。これらのメディエーターは、「行く準備ができて」いるとMCSが適切な刺激によって活性化されると、これらのメディエーターは、分18,19秒のうちに規制エキソサイトーシス（脱顆粒）によって細胞から放出される。この最初のイベントは、アラキドン酸代謝物、複数のサイトカインおよびケモカイン20,21,22を含む生物学的に強力な物質の大きな配列のデノボ合成および放出が続く。新たに合成された製品のリリースは、独立して、SGの放出が原因で発生します。まとめると、これらのメディエーターは、初期および後期相炎症やアレルギー反応を開始する。したがって、MCの活性化と脱顆粒を占めるのメカニズムを理解することは、理論と臨床IMPの両方があるortance。 遺伝的にプライマリおよび培養されたのMCを操作する難しさが不十分な解決のままのMC脱顆粒のメカニズムを解明しようとする試みを、妨げている。我々は、目的の遺伝子と粘膜マスト細胞株、ラット好塩基球性白血病（RBL）-2H3（本明細書でRBLと呼ばれる）、または骨髄由来のMC（BMMCに）30とを共トランスフェクトすることにより、レポーターベースのアッセイを開発し、この問題を克服するために、及びニューロペプチドY（NPY）は、SGのレポーターとして、単量体のRFP（mRFPと）に融合した。 NPYは、以前に、他のシステムにおける内因性SGマーカーの挙動を再現することが示された。 mRFPと蛍光は、pH非感受性であるため、また、NPY-mRFPとの表現は、酸性のSGの可視化を可能にするだけでなく、定量的な96ウェルプレートを用いて、エキソサイトーシスの評価および蛍光プレートリーダー。我々は、NPY-mRFPとはRBL細胞およびBMMCを酸性のSGに送達されることが示されており、細胞から放出される内因性のSG貨物（ すなわち 、βヘキソサミニおよびセロトニン）30、32と並んで、規制の方法で。このプロトコルは、彼らの表現型およびRBL細胞32内のSGの特性や脱顆粒上の機能への影響のために、目的の遺伝子をスクリーニングすることができ、高分解能イメージングベースの方法論を提供しています。具体的には、このプロトコルは、リアルタイムMCのSGのトラッキングとそのエリアまたはボリュームのサイズ、その数、組立体の動力学、細胞骨格に沿ったそれらの動きと異なる条件下で、原形質膜との最終的な融合の定量化を可能にする。例えば、DNP特異的IgEで細胞を感作し、異なる摂動の下で多価のAg（DNP共役血清アルブミン）を用いて細胞を誘発する（ すなわち 、重量または変異遺伝子の過剰発現は、目的の遺伝子のノックダウン、または薬理学的操作）と対照細胞と比較する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

マスト細胞（MC）は、予め形成され、新たに合成され、アレルギー性​​炎症性および免疫メディエーターを放出することによって、それらの生理学的および病理学的機能を達成する免疫系の分泌細胞である。 MCは「メディエーターは、アレルギーおよび免疫応答で最高潮に達する複数の組織や臓器に影響を与える。 MCメディエーターの合成、貯蔵と放出は、高度に規制されています。予め形成されたメディエーターは、原形質膜と融合し、調節性エキソサイトーシスによってそれらの内容物を放出する細胞の分泌顆粒（SG）にパ​​ックされている。我々は、のSGに対して標的化された内因性SGメディエーターと一緒に調整された様式で放出されるレポーター遺伝子と目的遺伝子の同時発現に基づくプロトコルを提示する。プロトコルは、4次元の共焦点がMCのSGの解析高分解能を可能にし、トリガエキソサイトーシスに生物発生から自分のタイムラインを監視する。したがって、相互の遺伝子をスクリーニングするためのこのプロトコルを使用して彼らの表現型および機能的な影響のためのESTは、MCのSGの生合成とエキソサイトーシスを支配する分子メカニズムを解読すると、関係規制当局を特定することができます。これにより、健康と病気におけるMCの機能を占める細胞メカニズムへのさらなる洞察が提供されるべきである。

そのためMCの低いトランスフェクション効率のため、遺伝子操作は、内因性のSGメディエーターで測定した平均分泌の読み出しに影響を残すことはほとんどありません。それにもかかわらず、レポーター遺伝子のNPY-mRFPと、同じ細胞において同時トランスフェクトされたプラスミドの完全な同時発現を確立することにより、NPY-mRFPとのモニタリングは、排他的に、目的の遺伝子を発現する細胞?...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K ビュー.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University. 本プロトコルの目的は、マスト細胞の分泌の機能的ゲノム解析を可能にする方法を開発することであった。プロトコルは、目的の遺伝子とcotrasfected蛍光レポーター遺伝子の放出を定量的に評価し、実時間に基づいて分泌顆粒の形態の分析。 

ビデオ: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

の臨床応用<em&gt;眠れる森の美女</em遺伝的に末梢及び臍帯血由来のT細胞を変更する&gt;と人工抗原提示細胞

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

免疫・感染学

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

の非溶解性エキソサイトーシスの可視化<em&gt;クリプトコッカス·ネオフォルマンス</em&gt;デジタル光学顕微鏡を使用したマクロファージから

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

ヒトの過剰発現と精製<em&gt;シス</em&gt; - プレニルトランスフェラーゼ<em&gt;大腸菌</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

同種の抗体を用いた二重標識免疫蛍光による宿主と病原体の相互作用の研究

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.