N.G.はフランスの「フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカルFRMを注ぐ」とフィリップ財団からのフェローシップの受領者です。R.S.は、ルシル・パッカード小児健康財団とスタンフォードNIH/NCRR CTSA賞番号UL1 RR025744によってサポートされています。P.S.はマックスケイド財団のマックスケイドフェローシップとオーストリア科学アカデミー、オーストリア科学基金(FWF):J3399-B21のシュレーディングフェローシップによってサポートされています。S.J.G.は、国立衛生研究所の助成金U19 AI104209、NS 080062、およびカリフォルニア大学のタバコ関連疾患研究プログラムからの支援を認めています。L.L.R.は、関節炎国立研究財団(ANRF)と国立衛生研究所助成金K99AI110645からの支援を認めています。

すべての動物のケアと実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、スタンフォード大学の制度的動物ケアと使用委員会の具体的な承認を得て行われました。
1. 骨髄由来培養マスト細胞(BMC)の生成と特性評価
注:ドナーBMCCsは、レシピエントMC欠損マウスと同じ遺伝的背景の骨髄細胞から生成されるべきである。男性由来ドナーBMCは、雌マウスの生着には適していない。女性由来ドナーBMCは、男性と女性の両方のレシピエントに正常に生着します。
<ol><li>骨髄抽出.<ol>
<li>滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を6ウェル培養プレート(1回1個)に注ぎ、氷の上に置きます。</li>
		<li>解剖器を70%エタノールに浸して殺菌する。</li>
		<li>二酸化炭素(CO2)吸入によってドナーマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、その後、操作部位に70%エタノールをマウスに噴霧する。</li>
		<li>骨の骨の骨を切断せずに大腿骨、脛骨および脛骨を抽出するために無菌解剖器を使用してください。</li>
		<li>鉗子で骨を固定しながら、滅菌はさみ(またはメスの刃)を使用して骨からすべての組織を削り取る(そしてフィブラを捨てる)。すべての骨が収集されるまで氷の上にPBSに骨を置きます。</li>
		<li>滅菌組織培養フード内の残りのステップをすべて実行します。滅菌器具を使用して、鉗子で骨を固定し、髄腔を露出させるために両方の骨を切断する。</li>
		<li>3 ml注射器および30G針を使用し、冷たい紅潮媒体(Dulbecco修正イーグルミディアム[DMEM]10%胎児子牛血清[FCS、熱不活性化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗ミコティック溶液、50μM β-メルカプトエタノール)を使用して、赤骨髄をペトリ皿に洗い流す。</li>
		<li>穏やかな吸引と放出を繰り返すことによって、フラッシュされた骨髄細胞クラスターを解負するために同じシリンジを使用してください。</li>
		<li>各マウスから15ml遠心分離管に大腿骨および脛骨骨髄をプールする。4°Cで5分間、骨髄細胞と遠心分離機を400xgで洗浄するために冷たい紅潮媒体でチューブを充填します。</li>
	</ol></li>
	<li>BMC文化。<ol>
<li>上清を除去し、10mlの培養培地でペレット化された骨髄細胞を回収する(DMEMは10%の胎児の子牛血清を補充した[FCS、 [熱不活化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗抗酸溶液、50 μM β-メルカプトエタノールおよび20%WEHI-3細胞調整培地[IL-3の供給源として;代わりに10 ng/mlで組み換えマウスIL-3を使用]。</li>
		<li>適切なサイズの組織培養フラスコに細胞を入れる(例えば、1匹のマウスのT25、2匹のマウスの場合はT75など)。</li>
		<li>めっき後1~2日後、培地および懸濁細胞(フラスコの底に付着した破片や付着細胞を残す)を新しいフラスコに移し、新鮮な培養培地(10ml/マウス)を加える。</li>
		<li>次の週の間に、3〜4日毎に細胞を供給する(1つのマウスにつき10mlの培地を加える)。2.5 x 105-1 x 106 細胞/mlの間で細胞密度を維持します。培養フラスコに付着細胞が存在しなくなるまで、非接着性細胞を週に1回新しいフラスコに移す。 インビトロ アッセイまたはMC欠損マウスへの生着に使用する前に細胞の成熟度(下記参照)をテストする。 注: BMC の完全な差別化には 4~6 週間かかります。</li>
	</ol></li>
	<li>BMCMCの成熟度の評価。<ol>
<li>
フローサイトメトリーを使用する。
		<ol>
<li>5 ml ポリスチレンラウンドボトムチューブで、氷冷 FACS バッファー (PBS、 0.5% FCS) でセル(5 x 104-5 x 10 5 セル/条件) を洗浄します。4°Cで5分間400×gで遠心分離機。 吸気上清。</li>
			<li>FACSバッファーに薄い抗マウスCD16/32(クローン93または2.4G2)モノクローナル抗体1:200(2.5 μg/ml)を希釈。各ペレットに10μlを加え、短いボルテックスで再中断します。氷上で5分間インキュベートし、Fc結合をブロックします。 注: 残りのすべてのステップで、直接光からサンプルを保護します。</li>
			<li>希薄なフィコエリスリン(PE)共役抗マウスFc εRI α(クローンMAR-1)1:200(1 μg/ml)およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役抗マウスキット(CD117; クローン2B8)1:200(2.5μg/ml)(「染色溶液」)、またはFACSバッファ内のそれぞれの標識アイソタイプ対照抗体(「アイソタイプ制御溶液」)</li>
			<li>ブロックされた細胞の半分をステップ1.3.1.2)から追加のポリスチレン丸底管に分割し、1つのチューブに20 μlの「染色液」を、もう一方のチューブに「アイソタイプ制御溶液」を20 μl加えます。氷の上で30分インキュベート。</li>
			<li>400 x g で 3 ml の氷冷 FACS バッファーと遠心分離機を 5 °C で 5 分間追加します。 上清を捨て、ヨウ化プロピジウム1μg/ml(PI、死細胞の同定用)を含む300μl FACSバッファー内のペレットを再懸濁します。フローサイトメトリー解析に進みます( 図2Aを参照)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>トルイジンブルー染色を用いた。<ol>
<li>1 x 105 細胞をPBSで1回、400 x gで400 x gで遠心分離して室温で5分間洗浄し、PBS 200 μlで細胞を吸引して再懸濁します。</li>
			<li>細胞懸濁液を顕微鏡スライドに取り付けた準備された細胞漏斗に移し、細胞遠心分離機(40xg)を用いて細胞遠心分離を進める。</li>
			<li>空気乾燥スライドは10分間、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。細胞を覆うために0.1%トルイジンブルー溶液を追加します。1分間インキュベートします。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。</li>
			<li>取り付け媒体を使用したカバースリップセル。軽顕微鏡分析に進みます( 図2Bを参照)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 肥満細胞欠損マウスのBCMCによる生着
<ol><li>皮内(i.d.)注射による耳の生着。 注:MC欠損マウスの耳のピナエへのBMCCCsの採用移行については、耳のピナあたり1 x 106 細胞(合計2 x 106 細胞)の2回の注射を行うことをお勧めします。MC欠損マウスの耳のピナエへのBCMCの皮内生着は、受動皮膚アナフィラキシー(PCA)24,27、宿主防御28、および慢性過敏症(CHS)反応29,30を含むいくつかのモデルにおいて多くの研究者によって使用されてきた。<ol>
<li>セルを 4 x 107 の BMCCs/ml (1 x 106 BMCCcs/ 25 μl) で冷たい DMEM でカウントおよび再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。</li>
		<li>人差し指で、耳のピナの背側面に垂直圧力を加え、腹側の顔を露出して伸ばします。</li>
		<li>耳のピナの腹側面の2つの異なる部位にBMCMC溶液の2つの25 μl i.d.注射を行い、耳の真ん中に最初の注射を行い、耳の先端に向かって2回目の注射を行います。 インビボ 実験を行う前に、i.d.の生着後4〜6週間待ちます。 注:我々の経験では、その時点で、耳のピナの中央部の真皮のMC/mm2の数は、一般的に野生型マウスの対応する位置と同様であるのに対し、耳のピンネの周囲のMC/mm2の数は、典型的には、対応する野生型マウス27,28の中のMC/mm2の数よりもかなり低い。このようなMC生着マウスを用いた実験を設計する際には、このことを念頭に置く必要があります(例えば、MC機能に影響を及ぼす可能性のある薬剤を耳のピナエの中央部に注入し、そのような治療の効果の分析もその領域に焦点を当てる必要があります)。</li>
	</ol></li>
	<li>腹腔内注入による腹腔の生着(すなわち)注射。 注:MC欠乏マウスの腹腔へのBMCCCsの導入は、マウスあたり2 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。このようなi.p.MMC欠損マウスへのi.p.注射は、様々なモデルにおける腹膜MCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきたが、毒素31 または細菌敗血症32,33に対する宿主防御のモデルを含む。<ol>
<li>適切な数のセルをカウントし、冷たいDMEMで1 x 107 のBMCCS/ml(2 x 106 BMCCcc/ 200 μl)で再懸濁します。BMCMC溶液を25G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>4-6週齢のMC欠損マウスの腹腔内に200μl BMCMc溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.p.の生着後4〜6週間待ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>静脈注射による生着(i.v.)注射。 注:MC欠損マウスへのi.v.インジェクションによるBMCCsの導入は、マウスあたり5 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。MC欠損マウスへのBMCの静脈内(i.v.)注射は、膀胱感染34、喘息35、肺線維症36、および抗体媒介性関節炎37のモデルを含む様々な疾患モデルにおけるMCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきた。<ol>
<li>適切な数のセルをカウントし、コールド DMEM で 2.5 x 10 7 BMCCs/ml (5 x 10 6 BMCCs/200 μl) で再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。</li>
		<li>イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。</li>
		<li>MC欠損マウスの尾静脈(または、あるいは、レトロ軌道静脈)に200 μlのBMCMC溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.v.の生着後12週間待ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 移植されたマスト細胞欠損マウスの分析
<ol><li>耳の生着分析。<ol>
<li>実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。</li>
		<li>耳のピンネーを分離し、4°Cで一晩10%(vol/vol)緩衝ホルマリンに固定します。 パラフィンに固定された耳のピナエを埋め込み、耳のピネの4μmのセクションをカットし、ガラススライドにマウントします。</li>
		<li>スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、室温で10分間空気乾燥スライドします。</li>
		<li>取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に光顕微鏡を使用してピンネー切片当たりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの皮膚におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
	</ol></li>
	<li>腹腔生着解析。<ol>
<li>腹腔内の肥満細胞数の評価<ol>
<li>実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。腹腔を壊さずに、慎重にマウスの腹側皮を除去する。</li>
			<li>25G針を装着した5mlシリンジを使用して、腹腔内に5mlの冷たいまたは室温のPBSを注入します。冷たいPBSを使用して腹膜細胞を活性化するリスクを減らします(これは腹膜MC脱顆粒または腹膜洗浄液中のいくつかのMC由来製品のレベルを評価する際に非常に重要です)。腹膜細胞を収穫するために20秒間腹部のマッサージを行います。</li>
			<li>22G針を装着した5mlシリンジを用いて腹膜洗浄をゆっくりと吸引する。吸引洗浄の量を記録します(注入された体積の80%まで回復すると予想されます)。</li>
			<li>腹膜洗浄液を5mlポリスチレン丸底管に移し、遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間移動させます。 吸気上清。400 μl の冷たい PBS でペレットを回収します。</li>
			<li>ヘモサイトメーターチャンバーを使用した腹膜細胞の総数をカウントする。フローサイトメトリー分析(ステップ1.3.1で説明されているように)に細胞懸濁液の半分を使用して、腹腔内の生着MCの割合およびマーカー発現を評価する。腹膜細胞の総数に MC の割合を掛けて、腹膜 MC の絶対数を求めます。</li>
			<li>ステップ1.3.2.2に記載されているように、残りの細胞で細胞遠心分離を行う。空気乾燥スライドは室温で10分間滑り、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。</li>
			<li>希釈されていないMay-グリュンヴァルト染色液で細胞を5分間覆い、続いて室温で5分間PBSで洗浄します。ギムサ染色液を1:20に脱イオン水で覆い、室温で20分間インキュベートします。2回の水道水で2回洗浄し、その後、空気乾燥スライド。</li>
			<li>取り付け培地を用いたカバースリップ細胞、および(少なくとも400個の細胞を計って)光顕微鏡を用いて、生着したMCの割合を計算する。生着マウス と 野生型マウスの腹膜洗浄におけるMCの割合を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
		</ol>
</li>
		<li>腸間膜窓における肥満細胞の評価<ol>
<li>ステップ3.2.1に記載の腹膜洗浄に続いて、腹膜を切開してマウスの腸管を露出させる。スライドにマウスごとに4〜5個の腸間膜窓を配置します。</li>
			<li>カルノイ溶液(エタノール、クロロホルム、氷酢酸の3:2:1 vol/vol/vol)で1時間スライドを室温で固定します。空気乾燥スライドと腸を取り除きます (固定の腸間膜窓はスライドに取り付けられたままです)。</li>
			<li>Csaba(アルシアブルー/サフラニンO)染色液で室温で20分間の調製物を染色します。<ol>
<li>500mlのCsabaステインを作るために、1M酢酸ナトリウム溶液100mlを1MHClの120mlと混合して500mlの酢酸緩衝液を調製し、脱イオン水で500mlまで調製し、pHを1.42に調整します。次に、90mgのサフラニンを溶解し(赤で「成熟したMC」を識別する)、1.8gアルシアンブルー(青で「未熟なMC」を識別する)、2.4gの硫酸アンモニウムNH4Fe(SO4)2を500mlの酢酸緩衝液に溶解する。</li>
			</ol>
</li>
			<li>取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に、光顕微鏡を使用して、腸間膜窓あたりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの腸間膜窓におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>I.v. 生着分析.<ol>
<li>実験の最後に、CO2 吸入によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼、および目的の組織(例えば 肺、皮膚または脾臓)を収穫し、4°Cでホルマリンを10%(vol/vol)緩衝したホルマリンで一晩固定する。</li>
		<li>パラフィンに固定組織を埋め込み、4μmのセクションをカットし、ガラススライドに取り付けます。スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。</li>
		<li>取り付け媒体を用いたカバースリップスライド、および光顕微鏡を用いて、組織切片当たりの生着MCの数と分布を評価する。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

最初の説明 38 から約30年が経過したところで、"マスト セル ノックイン" アプローチは、MC が生体内で何ができるか、または何ができないかについての貴重な情報を提供し続けています。MCの機能は長い間アレルギーにおけるその役割に限定されると考えられていた。「マスト細胞ノックイン」アプローチを用いて生成されたデータは、MCが他の機能の中で、特定?...

マスト細胞(MC)は、多能性骨髄前駆物質1-3から生じる造血細胞である。骨髄の進入に続いて、MCの前駆体は、局所的な成長因子1-3の影響を受けて成熟したMCに発展する様々な組織に移行する。組織常駐型のMCは、皮膚、気道、胃腸管などのホスト環境のインターフェースに戦略的に位置し、外部侮辱に対する第一線の防御線として3-6と動作する。多くの場合、MCは「ベースライン」の表向きの特性と解剖学的位置に基づいてサブ分類されます。マウスでは、「結合組織型」のMC(CTMC)および粘膜MC(MC)1~3,7,8という2種類のMCが記載されている。CTMCは、しばしば、小脳および神経線維の近くに位置し、滑膜腔に存在し、MMCは腸内および呼吸粘膜1-3の上皮内位置を占める。
多くの方法論が、MC9-13の生物学的機能を研究するために適用されてきた。多くのグループは、細胞株(ヒトMCラインHMC114またはLAD215,16など)、インビトロ由来MC(ヒト末梢血由来MC17、マウス骨髄由来など)のいずれかを使用してインビトロアプローチに焦点を当てています。 培養したMC[BCMCs]18、胎児皮膚由来培養MC[FSCCs]19および腹膜細胞由来MC[PCMC]20)または異なる解剖学的部位から単離されたMC。これらのモデルはすべて、MC活性化に関与するシグナル伝達経路など、MC生物学の分子的詳細を研究するために広く使用されています。しかし、MC生物学の重要な側面は、その表現型および機能的特性(例えば、細胞質顆粒プロテアーゼ含有量または異なる刺激に対する応答)が解剖学的位置および微小環境2,7によって変調され得る点である。生体内で遭遇するこのような要因の正確な混合物は、in vitroで再現することが困難な場合があるので、我々は、MC機能9に関する洞察を得るためにin vivoアプローチを使用して好む。
遺伝的MC欠乏症を有する複数のマウス株が存在し、広く使用されているWBB6F1-キットW/W-vまたはC57BL/6-キットW-sh/W-shマウスなど。これらのマウスはKIT(CD117)の発現および/または活性を欠いているが、主MC成長因子幹細胞因子(SCF)21,22の受容体である。その結果、これらのマウスは深いMC欠乏症を有するが、また、c−キット突然変異(WBB6F1-キットW/W-vマウス)またはc-キット発現の減少をもたらす大きな染色体反転の影響(C57BL/6-キットW-sh-C-s)9,122222222222222222222年12月12日に関連する表現型異常を有する。さらに最近では、c-キット-独立した構成MC欠乏症を有するマウスのいくつかの株が24-26に報告されている。これらすべてのマウスおよびいくつかの追加の新しいタイプの誘導可能なMC欠乏マウスは、最近詳細に9,10,13で見直された。
ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、MC欠損マウスへの導入、異なる解剖部位における養子転移MCの数と分布の分析について述べた。このいわゆる 「マストセルノックイン」 法は 、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために使用することができます。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

マスト細胞(MC)は、様々な組織に存在する造血細胞であり、特に皮膚、気道、消化管などの外部環境に曝露される部位に豊富に存在する。IgE依存性アレルギー反応における有害な役割で最もよく知られているMCは、毒や侵入細菌や寄生虫に対するホスト防御の重要なプレーヤーとしても出現しています。MC表現型および機能は、解剖学的位置によって異なる可能性がある微小環境要因、または免疫応答の発達のタイプまたは段階に基づいて影響を受ける可能性がある。このため、MC機能に関する洞察を得るために、インビトロ法よりもインビボアプローチを支持してきました。ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、遺伝的MC欠損マウスへの導入、異なる解剖学的部位における養子転移の数と分布の分析について述べた。この方法は、"マストセルノックイン"アプローチと名付けられ、過去30年間、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために広く使用されてきました。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。

「マスト細胞ノックイン」アプローチの概要を 図1に示し、BMCの生成、MC欠乏マウスに生着する細胞の数(実験計画に基づいて示された数を変更することができます)、および注入部位に応じて着実と実験の間隔(この場合は異なる場合)が含まれています。 例えば、MC細胞質顆粒中の保存されたメディエーターの含有量は、時間38と共に着実に増加する。 ?...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。

「マスト細胞ノックイン」マウスを用いた生体内肥満細胞の機能解析

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.1K ビュー.  Stanford University School of Medicine. イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

細胞運命を以下に<em&gt; E大腸菌の</emラムダファージによる感染後&gt;

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

免疫・感染学

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

RBL-2H3マスト細胞脱顆粒に対する化学的影響を評価するために、マイクロプレートアッセイ：有機溶剤を使用せずに、トリクロサンの影響

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

マスト細胞の分泌顆粒の調査。生からのエキソサイトーシスへ

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

生体内で予防接種モデルを用いた抗原特異的 T 細胞細胞傷害性関数の検出のための試金

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

酵素抗体法を用いたマウスにおける胸腺依存性および胸腺非依存性免疫グロブリン アイソタイプ反応の評価

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.