私たちは支援のためCIBIO（トレント大学）とCNR神経科学研究所の管理スタッフに感謝したいと思います。ジョバンニProvenzanoはFondazione Veronesi（ミラノ、イタリア）からのポスドクフェローシップでサポートされています。この作品は、イタリアの大学研究省（PRIN 2008グラント＃YBに200894SYW2_002とPRIN 2010年から2011年のグラント＃2010N8PBAA_002）、トレント大学（YBにCIBIO起動グラント）とテレソン財団（へグラント＃のGGP13034によって賄われていましたYB）。

全ての実験は、欧州共同体指令63分の2010 / EUに準拠して行われた、健康のイタリアの省によって承認されました。 1.動物実験、住宅と治療<ol><li>各機関動物ケアのガイドラインに従ってマウスを使用して、すべての実験のプロトコルを実行します。 </li><li>食料と水自由摂取させ 、12時間の明/暗サイクルの動物を維持します。 </li><li>ハウス2-4の群のマウスには、おがくずや寝具材料と標準サイズのポリカーボネート製マウスケージに毎週変更しました。 </li><li>疾患に対する感受性は神経発達障害の異なるマウスモデルにおいて、年齢や性別に応じて変化することができるので、年齢と性別をマッチさせたマウスを使用してください。 </li><li>統計的有意性（免疫組織化学実験のための行動の研究と遺伝子型ごとに4匹のマウスについての遺伝子型あたり10匹のマウスの最小）に達するまで、動物の適切な数を選択してください。 </li></ol> 2.モリス水迷路（MWM） <ol><li>円形タンク（直径100センチメートル、高さ50センチメートル）を使用します。 <ol><li>タンク周りの部屋のディバイダーにいくつかの視覚的な手がかりを置き​​ます。 </li><li> 4架空の象限のうちの一つの中心にある固定位置にタンクに直径10cmのプラットフォームを配置します。すべてのトレーニングセッション全体のすべての試験について同じ象限内に隠されたプラットフォームをしてください。 </li><li>プラットフォームは水の表面の上1cmであるまで、水道水でプールを入力します。平衡化する水の温度は22℃に近くなければなりません。このステップは数時間かかることがあります。水の温度を平衡化するために必要な時間を短縮するお湯を加えます。 </li><li>水を不透明にするために白、非毒性塗料の約1.5〜2 Lを追加します。 </li></ol></li><li>トラックの取得手順<ol><li>標準のCCDカメラやビデオボードとMWMの追跡システムを設定します。このようなパスの長さのようないくつかの変数を監視し、分析するために、ビデオ·トラッキング·システムを選択して、ESCAPEの遅延、および時間は、各象限に費やされました。 </li><li> 4つの象限にアリーナを分割し、ライブトラッキングのための動物と背景との間の最適なコントラストを確保するために、検出設定を調整します。 </li><li>プラットフォーム領域を指定します。 </li><li> 60秒、最大試行時間を設定します。 </li></ol></li><li> MWMテスト<ol><li>行動試験の前に、マウスに彼らはプールや空間キューを見ることができない領域で20〜25分間の適応期間を可能にします。 </li><li> （それらの間に20〜30分間隔で2回連続の試験日）9日間各マウスを訓練します。 </li><li>パソコンとカメラに切り替え、ビデオ追跡システムソフトウェアを起動します。 </li><li>その頭は、4つの開始位置（北、南、東、西）のいずれかから開始し、プールの側に指摘して、その尾によってマウスを取り、水の中に配置します。各マウスについて、開始位置は異なり、試験全体でpseudorandomizedでなければなりません。 </li><li>マウスが泳いでみようとplatfを検索60秒の最大のためのORM。動物がプラットフォームに到達すると、それは20秒間プラットフォームに滞在することを可能にします。 </li><li>マウスがその時間内にプラットフォームを見つけることができなかった場合は、ゆっくりその尾をつかんでプラットフォームにマウスを案内し、それが20秒のためにそこに滞在してみましょう。動物はすべて2つの試験を完了した後、タオルでそれを乾燥させ、ケージに戻します。 </li><li>訓練期間のそれぞれの日は、同じ手順（手順を2.3.4-2.3.6）繰り返します。 </li><li>最後のトレーニングトレイルの後9日目に、プローブテストを実行します。 </li><li>プールからプラットフォームを削除します。 </li><li>マウスが泳いでみようと60秒の最大のためのプラットフォームを検索します。 </li><li>定期的に、それは同じ（22°C）であるべきであるように、水の温度をチェックし、プールを一掃。 </li></ol></li></ol>灌流動物からの切片の調製<ol><li> MWMの最後にマウスを生け贄に捧げます。遺伝子型あたり4匹のマウスをeuthanizの前に麻酔されなければなりませんローカルおよび国際的なガイドラインに従ってエーション。 </li><li> 10-15 PBS中の4％パラホルムアルデヒド、続いて4-5分間、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で（出血を可能にし、灌流するために左心室に蝶のカニューレを導入するシザーauriclewith権利をカット）経動物を灌流22分。 </li><li>解剖し、少なくとも12時間、4℃で4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 </li><li>スライスのために必要とされるまで4℃で0.1 M PBSおよびストア内の0.02％アジ化ナトリウムを15 mlを含む50ミリリットルポリスチレンコニカルチューブに脳を置きます。 </li><li>ビブラ切断前に小脳をカットし、削除します。 </li><li>ビブラのホルダープレート上に、瞬間接着剤を使用して、切断部位で脳を直立接着。 </li><li>適切なビブラトームに、背側海馬を通してシリアルために、20〜40ミクロ​​ン厚の冠状切片に脳をカット。 </li><li>ペイントブラシでビブラトーム切片を収集し、2に転送各ウェルについて、0.1MのPBS 1 mlを含む4マルチウェルプレート。 </li><li> 4ºCで、PBS中の0.02％アジ化ナトリウムで、PBS中の短期または長期のためのショップのセクションでは、（組織には、最大1年間に使用されるかもしれません）。 </li></ol> 4.免疫組織化学<ol><li>各ウェルについて、0.1MのPBSを500μlを含む24マルチウェルプレートに転送3-5各マウスについて、背側海馬のセクションでは、。 </li><li> 0.1 M PBS（穏やかに振盪しながら5分間、3回）の500μlの各ウェルに含まれるセクションを洗ってください。 </li><li>穏やかに攪拌しながら20分間、PBS中の1％H 2 O 2のセクションをインキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチします。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li>組織の透過性：PBS中の0.2％トリトンX-100で5分間のセクションをインキュベートします。 </li><li>上記の手順（4.4; 4.5）の間に、（numbe全実験のための十分なブロッキング緩衝液（PBS中10％ヤギ血清および0.1％トリトンX100）を作りますセクションのR×100μL×3段階）。 </li><li>注：（ビオチンに結合）二次抗体が作られたのと同じ種から使用血清を。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温（RT）で1時間バッファー（100μL/セクション）をブロック内のセクションをインキュベートすることによって非特異的抗体の結合を防ぎます。 </li><li>穏やかに撹拌しながら、4℃で一晩、ブロッキング緩衝液中で希釈した一次抗体（のpERK）のセクションをインキュベートします。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li>穏やかに攪拌しながら室温で1時間（ステップ4.6で使用したものと同じ）を、ブロッキング緩衝液中に希釈したビオチン（250 1）とコンジュゲート二次抗体でインキュベートします。 </li><li>アビジンとビオチン複合体に室温で少なくとも30分を必要とするため、同時にABC試薬を準備します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってABC試薬の必要量を準備します。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li> IncubatABC試薬で室温で45分間のEセクション。 </li><li>穏やかな撹拌（3×5分）で、0.1M PBSでセクションを洗ってください。 </li><li> DABは発癌性や催奇形性であるとしてDAB作業溶液を調製し、DABを含むすべてのステップは、ドラフト内で行う必要があります。 </li><li>プラスチック転送ピペットで新しいプレートにDAB溶液を移します。 </li><li>手でDAB作業溶液にゆっくりと旋回プレートを含むプレートに置いてセクション、セクションの最大エクスポージャーを可能にします。 </li><li>適切な信号が発生するまで、顕微鏡のDAB反応（2-5分）を監視します。 </li><li> 0.1 M PBS（3×5分）で組織を洗浄することにより、所望の色の強さで反応を停止します。 </li><li>一晩換気フード内の残りのDAB基質溶液を不活性化し、実験室でのガイドラインに従ってこれを処分する漂白剤を使用してください。 </li><li>ゼラチンのマウント切片をPBSに浮遊させることによって、スライドをコーティングしました。次いで、室温で少なくとも3〜4時間でそれらを乾燥させます。 </li><li> 50％、70％、95％で連続切片を脱水100％の2分毎エタノール、および5分間、100％キシレン中で明確。 </li><li>マウンティング培地を用いてカバースリップし、一晩乾燥さヒュームフードのままにしておきます。 </li></ol> 5.セル数<ol><li>カウントのpERK陽性細胞は、背側海馬のレベルで三から五の項では、動物ごとに分析する必要があります。 </li><li>適切な顕微鏡を用いて200倍の倍率で各セクションからの複数の明視野画像を取得し、その後、画像処理ソフトウェアを使用して組み立てます。 </li><li> ImageJのフリーソフトウェアを使用して、TIFF-変換モザイク画像上の細胞数を実行します。 </li><li> 100×100μmの各2〜3カウントボックスの上に門と顆粒細胞層中のpERK染色細胞をカウントします。 </li><li>細胞密度は、ウィンドウをカウント当たりの標識細胞の数（100×100ミクロン）と表現します。 </li><li>遺伝子型の間に有意差を評価するために統計分析を実行します。これは、スチューデントのtを用いて達成することができます試験またはANOVAは、市販のソフトウェアを使用して、適切な事後検定を行いました。 P &lt;0.05で統計的有意性レベルを設定します。 </li></ol>

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	<li>Castren, E., Elgersma, Y., Maffei, L., Hagerman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+neurodevelopmental+disorders+in+adulthood.">Treatment of neurodevelopmental disorders in adulthood.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32, 14074-14079 (2012).</li><li>Ehninger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+learning+deficits+in+a+Tsc2+/-+mouse+model+of+tuberous+sclerosis.">Reversal of learning deficits in a Tsc2+/- mouse model of tuberous sclerosis.</a> Nature medicine. 14, 843-848 (2008).</li><li>West, A. E., Greenberg, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+the+learning+and+memory+deficits+associated+with+neurofibromatosis+type.">A mouse model for the learning and memory deficits associated with neurofibromatosis type.</a> I. Nature. 15, 281-284 (1997).</li><li>Morris, R. G., Garrud, P., Rawlins, J. N., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Place+navigation+impaired+in+rats+with+hippocampal+lesions.">Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions.</a> Nature. 297, 681-683 (1982).</li><li>Praag, H., Kempermann, G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Running+increases+cell+proliferation+and+neurogenesis+in+the+adult+mouse+dentate+gyrus.">Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.</a> Nature. 2, 266-270 (1999).</li><li>Adams, J. P., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+psychology:+roles+for+the+ERK+MAP+kinase+cascade+in+memory.">Molecular psychology: roles for the ERK MAP kinase cascade in memory.</a> Annual review of pharmacology and toxicology. 42, 135-163 (2002).</li><li>Di Cristo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+ERK+activation+for+visual+cortical+plasticity.">Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity.</a> Science. 292, 2337-2340 (2001).</li><li>Satoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK2+contributes+to+the+control+of+social+behaviors+in+mice.">ERK2 contributes to the control of social behaviors in mice.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 11953-11967 (2011).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+GABAergic+neurons+in+the+hippocampus+and+cerebral+cortex+of+Engrailed-2+null+mutant+mice:+implications+for+autism+spectrum+disorders.">Loss of GABAergic neurons in the hippocampus and cerebral cortex of Engrailed-2 null mutant mice: implications for autism spectrum disorders.</a> Experimental neurology. 247, 496-505 (2013).</li><li>Sgado, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+in+engrailed-2+mutant+mice+reveals+common+molecular+pathways+associated+with+autism+spectrum+disorders.">Transcriptome profiling in engrailed-2 mutant mice reveals common molecular pathways associated with autism spectrum disorders.</a> Molecular autism. 4, 51 (2013).</li><li>Cheh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=En2+knockout+mice+display+neurobehavioral+and+neurochemical+alterations+relevant+to+autism+spectrum+disorder.">En2 knockout mice display neurobehavioral and neurochemical alterations relevant to autism spectrum disorder.</a> Brain research. 1116, 166-176 (2006).</li><li>Dawson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+broader+phenotype+of+autism:+genetic,+brain,+and+behavioral+perspectives.">Defining the broader phenotype of autism: genetic, brain, and behavioral perspectives.</a> Development and psychopathology. 14, 581-611 (2002).</li><li>Gage, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Maei, H. R., Zaslavsky, K., Teixeira, C. M., Frankland, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+Most+Sensitive+Measure+of+Water+Maze+Probe+Test+Performance.">What is the Most Sensitive Measure of Water Maze Probe Test Performance.</a> Frontiers in integrative neuroscience. 3, 4 (2009).</li><li>Guzowski, J. F., Setlow, B., Wagner, E. K., McGaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+gene+expression+in+the+rat+hippocampus+after+spatial+learning:+a+comparison+of+the+immediate-early+genes+Arc,+c-fos+and+zif268.">Experience-dependent gene expression in the rat hippocampus after spatial learning: a comparison of the immediate-early genes Arc, c-fos and zif268.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 5089-5098 (2001).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません

- / -マウス、神経発達障害のマウスモデルここでは、たEn2でMWM後の神経活性化を明らかにするためのpERKの免疫組織化学プロトコルを提供します。 - / - WTと比較して変異体たEn2のCA3サブフィールドで検出されたのpERKのレベルを減少させました。異なるCA3サブフィールド、のpERK陽性ニューロンの一般的な増加で観察されたものからではなく、両方の門で検出されたとEN2のGCL ...

神経発達障害は、中枢神経系（CNS）の開発および成熟が中に早期に乱されたダウン症候群、脆弱X症候群（FXS）、レット症候群、神経線維腫症、結節性硬化症やASD、などの障害の広い異種基などが挙げられます出生前の期間1。これらの発達脳機能障害は、運動機能、言語、学習と記憶のプロセスに深刻な、生涯影響を引き起こす可能性があります。遺伝的要因と環境要因の過多は、ここ数年の間に2,3神経発達障害の病因に関与しています。臨床表現型の根底にある分子メカニズムは不明のままであっても、上記の知見は、これらの障害のいくつかのマウスモデルの開発を可能にしています。学習および記憶障害には、TSC1 +/-、TSC2 +/-としてこれらのマウスモデルの数が特定されています、NF1 +/-と EN2 - / -マウス2,4-7。神経発達障害の分野における重要な課題は、記憶や学習障害の基礎となる細胞および分子プロセスの同定です。学習または記憶の間に活性化、選択のシグナル伝達経路は、特定の遺伝子の転写を誘導し、最終的にデノボのタンパク質合成につながることができます。即時初期遺伝子（IEGs）の活性化およびタンパク質依存性シナプス修飾は、急速に神経活動と行動訓練8,9に応じて脳の神経細胞に誘導されます。 ニューロフィブロミンを含むシグナル伝達経路の欠損は神経発達障害における学習障害と関連しています。ニューロフィブロミンは、変異神経線維腫症1型の原因となるNF1遺伝子、神経系腫瘍によって特徴付けられる複雑な遺伝性症候群、行動、モータ遅延、および認知DISAの製品ですbilities 10。抑制性ニューロンに制限NF1欠失についてヘテロ接合マウスは、長期増強（LTP）の初期段階だけでなく、MWM 5,11,12、侵入した空間学習の欠損を示します。興味深いことに、このマウスモデルにおけるNF1欠損が増加ERKのリン酸化、最終的にこれらのニューロン5からのGABA放出の異常な増強を生じ、学習の間に介在阻害におけるRASシグナリングの過剰活性化をもたらします。 これらの知見に基づいて、行動タスク後の神経活動の可視化は、神経疾患に関与する特定の回路を再構成する方法を示しています。ここで説明する免疫組織化学プロトコルは、認知障害とASDマウスモデルにおいてMWMを次の海馬ERKリン酸化レベルを評価し、定量化することを目指しています。 MWMは広くげっ歯類13,14に海馬依存空間学習および記憶を調べるために使用され</s&gt;アップ。我々は、ERKは、学習と記憶形成の15において重要な役割を有することが示されたため、タスク依存海馬学習の分子読み出しとしてERKリン酸化を使用することを決定しました。また、ERK経路は、開発視覚野16における経験依存的可塑性のために必要です。最後に、CNSショーで2 ERKアイソフォーム（ERK2）のいずれかを欠損したマウスは、ERKシグナルは、ASDなどの神経発達障害の病因に重要な役割を果たしている可能性があることを示し、認知感情的、社会的行動17の異常をマーク。 神経発達障害のモデルとしてマウス（ - / -たEn2）私たちは、エングレイルド2ノックアウトを使用していました。 EN2 - / -マウスは、前脳の介在18の損失を含む解剖学的および行動「ASD様」機能では、ASD関連遺伝子19の発現低下を示し、社交性を減少し、損なわれた認知の柔軟性6,7,20。空間learni- / -マウス6,7および21 ASD患者で観察された認知機能障害に関連する可能性があるようなMWMで検出されたものとしてNGとメモリの欠陥は、たEn2、特に堅牢です。 - / -成体マウス7さらに、我々は、MWMにおける減損空間学習が減少ニューロフィブロミンの発現に関連するとEN2の門でのpERKレベルを増加させることが示されました。ここでは、このASDマウスモデルにおいてMWMを次のpERKの免疫組織化学的特性評価のための詳細なプロトコールを提示します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EthoVision XT 8</td>
			<td>Noldus Information Technology</td>
			<td></td>
			<td>This software platform is not a requirement &#8211; there are many other behavioral softwares on the market.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempera Paint</td>
			<td>Giotto - Fila Group Company</td>
			<td></td>
			<td>White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>Equivalent models from other companies can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A406-20</td>
			<td>Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66004-950</td>
			<td>Toxic - to be used under hood. Change xylene every month depending on use.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1009-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>G9023-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC kit Vectastain&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB peroxidase substrate</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pERK antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technologies&#160;</td>
			<td>4370</td>
			<td>Dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>BA-1000&#160;</td>
			<td>Dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Slides&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-548-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>317616</td>
			<td>Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&#160;Zeiss&#160;</td>
			<td>Axio Imager.M2</td>
			<td>Equivalent microscope can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Systems, San Jose, CA</td>
			<td></td>
			<td>To assemble images.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td></td>
			<td>Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SigmaPlot 11.0</td>
			<td>Systat Software Inc. (USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 6</td>
			<td>GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)</td>
			<td></td>
			<td>Equivalent softwares for statistical analysis can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemical visualization of hippocampal neuron activity after spatial learning in a mouse model of neurodevelopmental disorders

リン酸化され、細胞外調節キナーゼ（のpERK）の誘導は、学習に依存する神経活動の信頼性の分子読み出しです。ここでは、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するためのpERK免疫組織化学プロトコルを記述します。マウス、自閉症スペクトラム障害（ASD）のモデル具体的には、エングレイルド-2ノックアウト（ - / -たEn2）におけるモリス水迷路（MWM、古典的海馬依存性学習課題）後の神経の活性化を研究するためのpERK免疫染色を使用していました。野生型（WT）対照と比較して、たEn2 - / -マウスは、MWMにおける重要な空間的学習障害を示しました。 WT動物と比較して、マウス- / - MWM後、pERKの陽性ニューロンの数の有意差は、特定の海馬たEn2のサブフィールドで検出されました。したがって、我々のプロトコルは、ロバストの違いを検出することができますASDのマウスモデルにおいて、海馬依存性学習障害に関連付けられているのpERK陽性ニューロン。より一般的には、我々のプロトコルは、認知障害の両方により特徴づけられる遺伝的または薬理学的なマウスモデルにおいて、海馬ニューロンの活性化のプロファイルを調査するために適用することができます。

ここで説明するプロトコルは、免疫組織化学により、可視化するために設計された、神経発達障害のマウスモデルにおいて、MWM後の海馬ニューロン活動の特定のマーカーの発現。ここに示したすべての実験データは、我々の最近の仕事7から採取しました。男性と女性のWTとEN2 - / - （3-5ヶ月齢;重量= 25〜35グラム）年齢をマッチさせた大人の同腹子ヘテロ接合交配から得られた?...

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Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K ビュー.  University of Trento. 我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。 

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

神経科学

Using MazeSuite and Functional Near Infrared Spectroscopy to Study Learning in Spatial Navigation

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted virtual 3D environments, track a participants' behavioral performance within the virtual environment and synchronize with external devices for physiological and neuroimaging measures, including electroencephalogram and eye tracking.
Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables continuous, noninvasive, and portable monitoring of changes in cerebral blood oxygenation related to human brain functions2-7. Over the last decade fNIR is used to effectively monitor cognitive tasks such as attention, working memory and problem solving7-11. fNIR can be implemented in the form of a wearable and minimally intrusive device; it has the capacity to monitor brain activity in ecologically valid environments. 
Cognitive functions assessed through task performance involve patterns of brain activation of the prefrontal cortex (PFC) that vary from the initial novel task performance, after practice and during retention12. Using positron emission tomography (PET), Van Horn and colleagues found that regional cerebral blood flow was activated in the right frontal lobe during the encoding (i.e., initial na&iuml;ve performance) of spatial navigation of virtual mazes while there was little to no activation of the frontal regions after practice and during retention tests. Furthermore, the effects of contextual interference, a learning phenomenon related to organization of practice, are evident when individuals acquire multiple tasks under different practice schedules13,14. High contextual interference (random practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a non-sequential, unpredictable order. Low contextual interference (blocked practice schedule) is created when the tasks to be learned are presented in a predictable order.
Our goal here is twofold: first to illustrate the experimental protocol design process and the use of MazeSuite, and second, to demonstrate the setup and deployment of the fNIR brain activity monitoring system using Cognitive Optical Brain Imaging (COBI) Studio software15. To illustrate our goals, a subsample from a study is reported to show the use of both MazeSuite and COBI Studio in a single experiment. The study involves the assessment of cognitive activity of the PFC during the acquisition and learning of computer maze tasks for blocked and random orders. Two right-handed adults (one male, one female) performed 315 acquisition, 30 retention and 20 transfer trials across four days. Design, implementation, data acquisition and analysis phases of the study were explained with the intention to provide a guideline for future studies.

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments. Functional near-infrared spectroscopy (fNIR) is an optical brain imaging technique that enables noninvasive and portable monitoring of cerebral blood oxygenation changes. This paper summarizes collective use of MazeSuite and fNIR within a cognitive processing learning paradigm.

空間ナビゲーションで学習研究するために近赤外分光法をMazeSuiteおよび機能の使用

MazeSuite is a complete toolset to prepare, present and analyze navigational and spatial experiments1. MazeSuite can be used to design and edit adapted ...

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance imaging. However, use of such methods in animal models requires anesthesia and hence both alters the brain state and prevents behavioral measures. An alternative method is the use of in vivo microdialysis to take continuous measurement of brain extracellular fluid concentrations of glucose, lactate, and related metabolites in awake, unrestrained animals. This technique is especially useful when combined with tasks designed to rely on specific brain regions and/or acute pharmacological manipulation; for example, hippocampal measurements during a spatial working memory task (spontaneous alternation) show a dip in extracellular glucose and rise in lactate that are suggestive of enhanced glycolysis1-3,4-5, and intrahippocampal insulin administration both improves memory and increases hippocampal glycolysis6. Substances such as insulin can be delivered to the hippocampus via the same microdialysis probe used to measure metabolites. The use of spontaneous alternation as a measure of hippocampal function is designed to avoid any confound from stressful motivators (e.g. footshock), restraint, or rewards (e.g. food), all of which can alter both task performance and metabolism; this task also provides a measure of motor activity that permits control for nonspecific effects of treatment. Combined, these methods permit direct measurement of the neurochemical and metabolic variables regulating behavior.

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Modulation of hippocampally-dependent spatial working memory by direct intrahippocampal microinjection, accompanied and followed by in vivo microdialysis for metabolites in conscious, behaving animals.

海馬のインスリンおよびマイクロインジェクション<emインビボ&gt;</em空間記憶テスト中&gt;マイクロダイアリシス

Glucose metabolism is a useful marker for local neural activity, forming the basis of methods such as 2-deoxyglucose and functional magnetic resonance ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and thus current therapeutic treatment strategies are not curative. Through the use of whole exome sequencing, an increasing number of genes have been identified to play a role in human locomotion. Despite identifying these genes, it is not known how these genes are crucial to normal locomotive functioning. Therefore, a reliable assay, which utilizes model organisms to elucidate the role of these genes in order to identify novel targets of therapeutic interest, is needed more than ever. We have designed a sensitized version of the negative geotaxis assay that allows for the detection of milder defects earlier and has the ability to evaluate these defects over time. The assay is performed in a glass graduated cylinder, which is sealed with a wax barrier film. By increasing the threshold distance to be climbed to 17.5 cm and increasing the experiment duration to 2 min&#160;we have observed a greater sensitivity in detecting mild mobility dysfunctions. The assay is cost effective and does not require extensive training to obtain highly reproducible results. This makes it an excellent technique for screening candidate drugs in Drosophila mutants with locomotion defects.

We present an optimized inexpensive and reliable negative geotaxis assay in Drosophila melanogaster as a model for neurodegenerative disorders. Being more sensitive to mild locomotor defects, this assay will help screen for potential genetic interactions and drug targets.

神経変性疾患のショウジョウバエモデルにおけるクライミング欠陥の定量分析

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies indicate that the severity of brain injury appear to be sex dependent, and that the male neonates are more susceptible to the effects of HI-related brain injury, resulting in more severe neurological outcomes as compared to females with comparable brain injuries. The development of reliable methods to isolate and maintain highly enriched populations of sexed hippocampal astrocytes is essential to understand the cellular basis of sex differences in the pathological consequences of neonatal HI. In this study, we describe a method for creating sex specific hippocampal astrocyte cultures that are subjected to a model of in-vitro ischemia, oxygen-glucose deprivation, followed by reoxygenation. Subsequent reactive astrogliosis was examined by immunostaining for the Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and S100B. This method provides a useful tool to study the role of male and female hippocampal astrocytes following neonatal HI, separately.

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

Astrocytes are one of the most important key players in the central nervous system (CNS). Here, we are reporting a practical method of sexed hippocampal astrocyte culture protocol in order to study the mechanisms underlying the astrocyte function in male and female neonate pups after in-vitro ischemia.

マウス海馬アストロサイトにおける性差後<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

聴覚弁別学習した後、マウス脳領域の高分解能定量的シナプスプロテオームプロファイリング

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

低密度初代海馬ニューロンの文化

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Assessing Spatial Learning and Memory in Small Squamate Reptiles

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, interest in the cognitive processes of nonmodel species, typically within an ecological context, has also become an emerging field of study. In particular, interest in the cognitive processes in reptiles is growing although experimental studies on reptilian cognition are sparse. The few reptilian studies that have experimentally tested for spatial learning and memory have used rodent paradigms modified for use in reptiles. However, ecologically important aspects of the physiology and behavior of this taxonomic group must be taken into account when testing for spatially based cognition. Here, we describe modifications of the dry land Barnes maze and associated testing protocol that can improve performance when probing for spatial learning and memory ability in small squamate reptiles. The described paradigm and procedures were successfully used with male side-blotched lizards (Uta stansburiana), demonstrating that spatial learning and memory can be assessed in this taxonomic group with an ecologically relevant apparatus and protocol.

This paper describes a modification of the Barnes maze, a standard rodent paradigm used to assess spatial memory and learning, for use in small squamate reptiles.

小さなうろこに覆われた爬虫類の空間学習と記憶を評価します

Clinical research has leveraged a variety of paradigms to assess cognitive decline, commonly targeting spatial learning and memory abilities. However, ...

The Use of Trace Eyeblink Classical Conditioning to Assess Hippocampal Dysfunction in a Rat Model of Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain undergoes rapid organizational change and is similar to accelerated brain changes that occur during the third trimester in humans. This model of fetal alcohol spectrum disorders (FASDs) produces severe brain damage, mimicking the amount and pattern of binge-drinking that occurs in some pregnant alcoholic mothers. We describe the use of trace eyeblink classical conditioning (ECC), a higher-order variant of associative learning, to assess long-term hippocampal dysfunction that is typically seen in alcohol-exposed adult offspring. At 90 days of age, rodents were surgically prepared with recording and stimulating electrodes, which measured electromyographic (EMG) blink activity from the left eyelid muscle and delivered mild shock posterior to the left eye, respectively. After a 5 day recovery period, they underwent 6 sessions of trace ECC to determine associative learning differences between alcohol-exposed and control rats. Trace ECC is one of many possible ECC procedures that can be easily modified using the same equipment and software, so that different neural systems can be assessed. ECC procedures in general, can be used as diagnostic tools for detecting neural pathology in different brain systems and different conditions that insult the brain.

Trace eyeblink classical conditioning (ECC) was used to assess hippocampal-dependent associative learning in adult rats that were administered a high concentration (11.9% v/v) of alcohol during early neonatal brain development. In general, ECC procedures are sound diagnostic tools for detecting brain dysfunction across many psychological and biomedical settings.

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

Neonatal rats were administered a relatively high concentration of ethyl alcohol (11.9% v/v) during postnatal days 4-9, a time when the fetal brain ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.