The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

NOT: yaşayan hayvanları kapsayan tüm işlemler EC direktifi 86/609 / EEC sayılı laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallar ve yerel etik kurul (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) tarafından onaylanan uygun olarak yapılmıştır. Timidin Analoglarının 1. periton içine enjeksiyon <ol><li> Enjeksiyondan önce hayvanlar gün tartılır. Bir sonraki gün aynı zamanda, bir 10 mg / ml stok çözeltisi, bireysel ağırlığa göre ayarlanmış enjeksiyon hacimleri planlanan tüm enjeksiyonlar için gereken timidin analoğu miktarını hesaplayın. </li><li> 10 mg / ml timidin stok çözelti hazırlayın. (DİKKAT! Thymidine benzerleri zehirlidir. Bir kimyasal davlumbaz kullanmak, yani, tedarikçiler tarafından sağlanan özel Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) izleyin laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek). <ol><li> Dondurucudan timidin analog alın ve yaklaşık RT getirmek. 21 ° C. 10 mg tartılır ve ekleyinveya 0.04 N NaOH (BrdU ve CldU için) steril tuzlu su (steril tuzlu su içinde, IDU için), vorteks. Bir 50 ° C su banyosu ve girdap içinde, 15 dakika, her - 2 - tozu çözmek üzere 3 dk için en az 10 yerleştirin. Not: en fazla 24 saat için kullanımlar çözeltileri, oda sıcaklığında ve -20 ° C de bir kaç hafta içinde saklanabilir. Işık (alüminyum folyo ile kapak) çözümler koruyun. Her zaman çökeltilerin kontrol ve gerekirse-çözülür yeniden. </li></ol></li><li> Ense fare kısıtlamaktadır ve periton içine, 30 G iğne ile ince bir dozaj şırıngası kullanılarak (oda sıcaklığında) stok çözeltisi, uygun bir, ağırlığa göre ayarlanmış hacim enjekte edilir. Not: durumda CldU ve Idu, aynı hayvanda sıralı olarak uygulanabilir gerekir eşit mol konsantrasyonları enjekte düşünün (örn, 50 mg / kg BrdU uygun 42.5 mg / kg CldU ve 57.5 mg / kg Idu). Bu nedenle, buna uygun olarak, 10 mg / ml&#39;lik stok çözeltiler enjeksiyon hacimlerini ayarlamak. </li></ol> 2. Doku Hazırlanması <ol><li> Prepaperfüzyon bir gün önce 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 formaldehit yeniden. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Transkardiyal 40 ml buz gibi soğuk formaldehid (akış oranı 5 mL / dakika) ile daha sonra 10 ml buz gibi soğuk PBS ile sol ventrikil yoluyla derin anestezi altındaki farelerin (% 3.5 izofluran) serpmek. 4 ° C&#39;de 24 saat boyunca aynı sabitleyici beyin ve sonrası düzeltme ayır. </li><li> Arka arkaya, 10% (4 ° C&#39;de 24 saat) ve% 30 sakaroz (beyin lavabolar kadar, yakl. 48 saat) içine beyin aktarın. Kabarcıklar doku ortaya kadar donma için, yavaş yavaş -25 ° C izopentan içine Kriyo-korumalı beyinleri daldırın. -80 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Bir dondurma mikrotomda 40 mikron kalınlığında koronal bölümleri kesin (-25 blok sıcaklığı -16 ° C). Bir 24-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuklarına içeren antifriz solüsyonu içine Sıralı aktarım bölümleri (Şekil 1 e bakınız). -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol><img alt = &quot;Şekil 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; 24-plaka içine microtome dilim aktarılması Şekil 1. şematik gösterimi. A1 başlayın ve A6 vb sonraki satır B gidin ve sonra, satır A içine sonraki dilimlerini yerleştirin. D6 ulaşan yaparken, A1 geri dönmek ve devam edin. Dilimlerin Bu düzenleme tüm beyin bölümlerinde inci her n ölçülmesini sağlar. Yenidoğan hücrelerin ölçümü için immünoflüoresans feno (tek sütun 2 alternatif satır içeriği eşdeğer) her 12 inci bölüm alır, (tek sütun içeriğine eşdeğeri) beyin bölümünde inci her 6 alır. 3. immün Not: Bölüm 6 oyuklu plakalar bir taşıyıcı plaka ile donatılmış uçları örgü genellikle, serbest yüzer işlenir. Bir istisna olarak, antikor inkubasyon ABC Reaksiyon örgü uçlar (a başına 0,5-1 mi olmadan 12 veya 24 oyuklu plakalar içinde yapılır engellemeell) lekeli gereken dilim sayısına bağlı olarak yeterlidir. Bu adımlar sırasında, ince bir fırça yardımıyla (her yeni çözümü ile durulayın) ile bölümleri aktarmak. Bütün inkübasyonlar, sürekli çalkalama (en fazla 150 rpm) ile yapılır. <ol><li> İmmünohistokimya (ABC yöntemi) <ol><li> Tamamen antifriz çıkarmak için (10 dakika her biri için oda sıcaklığında, 5 kez, 4 ° C&#39;de bir kez O / N), TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın. </li><li> Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için TBS-T içinde% 1.5 H2O 2 30 dakika boyunca inkübe edin. Köpüren dikkat ve gerekirse bölümleri-daldırın yeniden. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> İsteğe bağlı: Bu arada, bir ısıtma kabini ve 37 ° C&#39;de 2 N HCI ısıtın. DNA&#39;yı denatüre etmek için 2 N HCI içinde 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca bölümler inkübe edin. Bir fırça yardımıyla hafifçe ayrı bölümler. </li><li> İsteğe bağlı: 0.1 M borat tamponu pH 10 dakika boyunca bölümler nötralize8.5, RT. Transfer ederken, kısaca HCI artıkları çıkarmak için kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler çubukla. 15 dakika her biri için TBS 2 kez durulayın. </li><li> Doku geçirgenliği ve spesifik bir antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat bloke TBSplus inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de TBSplus O / N seyreltilmiş primer antikor içinde inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> TBSplus, oda sıcaklığında 3 saat içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor olarak inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. Bu arada ... </li><li> Üreticinin protokolü (TBS-T içinde% 1 a + 1,% B) işlemine göre, ABC kompleksi hazırlanır. Kullanmadan önce, oda sıcaklığında 30 dakika için beklemeye bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat için AB reaktif bölümleri inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Sırasıyla iki yarım ve pipet 4 ml ya da 2 ml oyuk başına bölünmüş, 6 ya da 12 oyuklu plaka başına, TBS-T içinde 50 mi, 0.5 mg / ml DAB hazırlayın. DAB çözeltisi (DİKKAT içine Transferi bölümler! DAB toksiktir. Specifi izleyinc yani, laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek, tedarikçi tarafından sağlanan MSDS) kimyasal davlumbaz kullanın. </li><li> Iyi peroksidaz reaksiyonu başlatmak için her yukarıdaki gibi, geriye kalan 25 ml DAB çözeltisine 0.5 ml% 1 H 2 O 2 ekleyin karıştırın ve pipet eşdeğer birimler. 12 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Kalıcı montaj orta ile lamel. </li><li> İsteğe bağlı: lamel yerleştirmeden önce Counterstain (bakınız bölüm 3.5). Not: bir sinyal-gürültü oranı olduğundan, yüksek bir arka plan ve düşük ise, AB reaktifi (aşama 3.1.8) ile inkübasyondan sonra H2O 2 tedavi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Çoklu-immunofloresans <ol><li> Tek veya aynı anda çoklu immunofloresans <ol><li> TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın (4 ° C&#39;de bir kez O / N, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 5 kez her biri) tamamen bir kaldırmatifreeze. </li><li> İsteğe bağlı: 3.1.3 adımları olarak - 3.1.4. </li><li> Spesifik olmayan antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat doku geçirgenliği ve engellemek için TBSplus inkübe edin. </li><li> Birincil antikor kokteyli inkübe (örneğin, sıçan α-BrdU, kobay-DCX α, keçi α-GFP), 4 ° C&#39;de TBSplus O / N seyreltilmiştir. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli inkübe (örneğin, Rodamin Kırmızı α-sıçan, Alexa-647 α-kobay, Alexa-488 α-keçi, tüm eşek türetilmiş), TBSplus içinde seyreltilmiş 3 saat RT veya O / N at 4 ° C&#39;de ilave edildi. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li><li> Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Sulu yapıştırma vasatı ile lamel. </li></ol></li><li> Aynı konak türünden primer antikorlar ile sıralı çoklu immunofloresans <ol><li> 3.2.1.3 - 3.2.1.1 adımları gibi. </li><li> Fi inkübeilk birincil antikor (ör tavşan α-antijen A), O / N 4 ° C&#39;de ilave edildi. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İlk florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Rodamin kırmızı geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İlk ikincil antikor açık paratoplar doyurmak için 3 saat oda sıcaklığında birincil antikorlar aynı ana (örneğin, tavşan serumu) den% 10 normal serum içinde inkübe. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> 50 ug (örn α-tavşan IgG (H + L)), ikinci ikincil antikor, O / N oranında tarafından kabul edilebilir epitoplarını kapsayan birincil antikor konak karşı / ml birleşmemiş tek değerli Fab fragmanları ile TBSplus inkübe 4 ° C. </li><li> 10 dakika her biri için TBS-T içinde en az 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. Transfer ederken, kısaca swab kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler herhangi Fab artıkları çıkarmak için. </li><li> 4 ° C &#39;de, ikinci birincil antikor (ör tavşan α-antijen B) O / N inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> İkinci florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Alexa 488-geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. NOT: Farklı konak türler ekleyebilirsiniz gelen antikorlar ile antijenleri etiketlemek için 3.2.2.2 adıma ve ilgili ikincil antikorlar 3.2.2.3 adıma. </li></ol></li><li> Primer antikor olarak aynı türden ikincil antikor bir NOT: Bu protokol, GFAP, Nestin-GFP ve DCX birlikte BrdU veya Ki67 karşı dörtlü-boyama için uygundur. <ol><li> 3.2.1.5 - 3.2.1.1 izleyin kesinlikle protokol adımları. Bu noktaya kadar TBSplus tek eşek serumu kullanın. </li><li> T inkübeOda sıcaklığında 1 saat süre ile% 3 keçi serumu ihtiva eden BSplus. Bu α-keçi sekonder antikor açık paratoplar kapsar. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> AMCA-conj inkübe edin. TBSplus, 3 saat oda sıcaklığında veya O / N 4 ° C&#39;de seyreltilmiş keçi α-tavşan. 15 dakika her biri için TBS içinde üç kez yıkayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. </li></ol></li><li> CldU, DUK ortak boyama <ol><li> , Durulayın denatüre ve bölüm 3.2.1 de açıklandığı gibi bölümleri nötralize (- 3.2.1.2 3.2.1.1 adımları). </li><li> Α-fare TBSplus IgG (H + L), oda sıcaklığında 1 saat 20 ug / ml birleşmemiş Fab fragmanları kuluçkalayın. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de TBSplus O / N sulandırılmış ve fare α-BrdU (350 1); (IgG2 arıtıldı 400 1), sıçan α-BrdU içeren birincil antikor kokteyli içinde inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> Biyotinlenmiş eşek içeren ikincil antikor kokteyli inkübe α-sıçan (1: 500) ve FITC-geçidi. eşek α-fare Fab fragmanları (1: 100). 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. </li><li> Rodamin Kırmızı conj inkübe edin. Streptavidin, oda sıcaklığında 2 saat. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel. </li></ol></li><li> Nestin-GFP farelerde, floresan sinyalinin amplifıkasyonu <ol><li> Primer antikor kokteyli keçi α-GFP ekleyin. </li><li> (. Bu tür Alexa 488 conj olarak α-keçi eşek) GFP benzer spektral özelliklere sahip bir florokrom konjuge sekonder antikor ekle ikincil antikor kokteyl. </li></ol></li></ol></li><li> Epitop alma <ol><li> Antifriz dışarı durulama sonra epitop alma yürütmek. 99 ° C (yaklaşık 25 dakika) - 0.1 M sitrat tamponu pH 6,0-95 içeren 6- veya 12-yuvalı plakalar ile ön ısıtma gemi. </li><li> (30 dakika boyunca sıcak sitrat tamponu ve buhar haline bölümleri transfer plastik l alüminyum folyo ile plakaları kaplamakkimlikleri ısıya dayanıklı değildir). </li><li> Hemen soğumaya bir buz banyosu içinde plaka yerleştirin. Bu doğum sonrası hayvanların beyin kesitleri ile çalışırken özellikle önemli olan doku morfolojisi, korumaya yardımcı olur. </li><li> Yıkayın ve sitrat nötralize ve boyama devam etmek 10 dakika her TBS 3 kez durulayın. </li></ol></li><li> Fare fare doku üzerinde antikorların <ol><li> -Α fare IgG 20 ug / ml tek değerli Fab fragmanları ekleyin (H + L ikincil antikor ile aynı ana-türleri), ilk blokaj aşama (örneğin, aşama 3.1.5 ya da 3.2.1.3). </li><li> 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın ve ilgili protokol ile devam edin. </li></ol></li><li> Cresyl menekşe counterstaining <ol><li> (Cam kavanoz içinde) 60 ° C&#39;ye kadar ön ısıtma kresil menekşe rengi solüsyon. 3 dakika boyunca sıcak çözeltiye slaytlar inkübe edin. </li><li> Sulu içinde durulayın. dest. ve% 70 oranında 1 dakika her biri,% 96 ve% 100 izopropanol 2 kez kurutmak. </li&gt; <li> 6 ksilen dakika veya uyumlu kalıcı montaj ortamı ile bir ksilen yerine ve lamel - 5 için Clear. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> Kıvrımlarının tüm rostro ölçüde boyunca her 6 th bölümünde peroksidaz lekeli yenidoğan hücreleri saymak. 400X büyütmede ışık mikroskobu kullanın. </li><li> Yenidoğan hücrelerin toplam sayısının bir tahmin elde etmek kavşak aralığı ile sonuçlanan hücre sayıları çarpın. </li><li> Görüntü floresan uygun lazerler ve filtre sistemleri ile donatılmış bir konfokal lazer mikroskobu ile bölümleri etiketli. 400X büyütmede kıvrımlarının tüm genişliği boyunca herhangi bir konumda görüntü yığınlarını alın ve diğer belirteçler ile birlikte etiketleme için, hemisfer başına ilgi dahilindeki en az 50 rastgele seçilmiş hücrelerin analiz eder. </li><li> Mutlak hesaplamak için yeni doğan hücrelerin toplam sayısı ile birlikte etiketlenmiş hücreler (/% 100) elde edilen yüzdeler çarpınBelirli yenidoğan hücre popülasyonlarının sayıları. </li></ol>

<ol>
	<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+integration+and+plasticity+of+new+neurons+in+the+adult+hippocampus.">Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus.</a> J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).</li><li>Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+period+for+enhanced+synaptic+plasticity+in+newly+generated+neurons+of+the+adult+brain.">A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain.</a> Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).</li><li>Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=When+is+adult+hippocampal+neurogenesis+necessary+for+learning?+evidence+from+animal+research.">When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research.</a> Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).</li><li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+neurons+and+new+memories:+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and+memory.">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).</li><li>Encinas, J. M., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+quantitating+neural+stem+and+progenitor+cells+in+the+adult+brain.">Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain.</a> Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).</li><li>Burns, K. A., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+doses+of+bromo-+and+iododeoxyuridine+produce+near-saturation+labeling+of+adult+proliferative+populations+in+the+dentate+gyrus.">Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus.</a> Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).</li><li>Cameron, H. A., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+produces+a+large+pool+of+new+granule+cells+in+the+dentate+gyrus.">Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus.</a> J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).</li><li>Vega, C. J., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferative+history+in+tissue+revealed+by+temporal+halogenated+thymidine+analog+discrimination.">Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination.</a> Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Brown, D. C., Gatter, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki67+protein:+the+immaculate+deception.">Ki67 protein: the immaculate deception.</a> Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).</li><li>Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+using+nestin+promoter-GFP+transgenic+mice.">Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice.</a> Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).</li><li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+hippocampal+neurons+in+adult+mice+living+in+an+enriched+environment.">More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment.</a> Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).</li><li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+D2+is+an+FSH-responsive+gene+involved+in+gonadal+cell+proliferation+and+oncogenesis.">Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis.</a> Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).</li><li>Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+kinetics+of+dentate+gyrus+neurogenesis+in+the+absence+of+cyclin+D2.">Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2.</a> BMC Neurosci. 13, 46 (2012).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunocytochemistry:+an+update.">Controls for immunocytochemistry: an update.</a> J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).</li><li>Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+and+epitope+retrieval+in+diagnostic+immunohistochemistry:+a+concise+review+with+practical+considerations.">Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations.</a> Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Kantifikasyon ve yenidoğan hücrelerin alt popülasyonlarının belirlenmesi yetişkin nöron araştırma merkezi konudur. Yetişkin nöron spesifik aşamalarında ifade proteinlere karşı çoğalma belirteçleri ve antikorlar birleştiren bu alt popülasyonlar immünohistokimyasal algılanmasını sağlar. Antikorlar ya da antikor kombinasyonlarının bazı spesifik boyama koşulları gerektirir. Sentetik timidin analogları ile hücrelerin bölünmesi Etiketleme hala yetişkin hipokampal...

İki beyin bölgeleri kurucu yaşam boyunca yeni nöronlar oluşturmak, lateral ventriküllerin subventriküler bölge ve hipokampusün (DG) subgranular bölge (SGZ). Yeni doğan nöronlar nöral progenitör hücrelerden elde ve olgunluğa 1,2 ulaşmadan önce morfolojik ve fizyolojik gelişimin farklı aşamalarında gitmek. Yavaş bölünmesi radyal glia-benzeri kök hücre (tip 1) transit ardışık aşamaları ara progenitör hücrelerin ortaya yükselterek. daha farklılaşmamış alt tipi (Tip 2a ve tip 2b) kısa teğet süreçleri ile düzensiz bir şekle sahiptir. Onlar (dendritler moleküler tabakası doğru genişletilmiş) ile giderek olgunlaşmamış nöronların olmak için hücre döngüsünü çıkmak ve nihayet hipokampal ağ gibi olgun granül hücreleri içine entegre Nöroblastlar (tip 3) oluşturur. Dolayı özellikle fizyolojik özellikleri bu hücreler gelişmiş plastisite 3 sugges ile devreyi sağlamakting hipokampustaki benzersiz bir rolü. Aslında, son on çalışmaları yetişkin nöron mekansal bellek, desen ayırma ve duygusal davranış 4,5 katkıda önemli kanıtlar oluşturdu. Yetişkin nöron farklı yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Timidin analogları hücre döngüsünün S-fazında DNA içine dahil ve yeni doğan hücrelerin 6-8 doğum partner, miktar ve kader analizi sağlar. Farklı timidin analogları (örneğin, CldU, edu veya DUK) sıralı uygulama hücre yenileme ya da bir deney 9 sırasında farklı zaman noktalarında doğan hücre popülasyonlarının incelemek için kullanılabilir. Bir alternatif olarak, hücre proliferasyonu için endojen işaretleyici Ki67 olup. Hücre döngüsü (G1, S, G2, E) dinlenme aşamasında dışında (G0) ve G1 10,11 başında her safhasında hücrelerin bölünmesi ile ifade edilir. Yetişkin dentat yenidoğan hücre popülasyonlarının fenotipi analiz etmekE girus çeşitli safha spesifik moleküler markörler GFAP, Nestin, DCX ve neuN 1,6 olarak kullanılabilir. GFAP erişkin astrositlerin bir göstergesi, aynı zamanda, yetişkin önbeyin radyal glial benzeri hücrelerde ifade edilir. Nestin radyal glia-benzeri hücreler ve erken orta projenitör hücrelere özgü bir ara filamenttir. DCX ara progenitörlerle nöroblast- ve olgun nöronlarda ifade edilen bir mikrotübüle bağlı bir proteindir. + Nestin - türü 2a (GFAP - tip 1 (GFAP + Nestin +, DCX): Bu üç işaretleri ve dört ayrı progenitör hücre alt tipleri tespit edilebilir etiketli hücrelerin morfolojik özellikleri (eş) ifadesi dayanarak , DCX -), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin - DCX +) 1. Birlikte postmitotik nöronların ifade neun, ile DCX Eş-etiketleme immatür farklılaşmasını izin verire (DCX + neun +) ve olgun (DCX - neun +) granül nöronlar. Yukarıda belirtilen belirteçler sıklıkla yeni doğmuş hücrelerin sayısını ve kimliğini analiz etmek üzere immünoflüoresan ko-etiketleme ve daha sonra konfokal mikroskopi için kullanılır. Bu, tipik olarak, istenmeyen antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı bir ev sahibi türünden antikorların gerektirir. Ancak nöron araştırma için uygun bir temel antikorların büyük bir kısmı ya da tavşanlar ya da fareler (örneğin, fare α-BrdU, fare α-neun, tavşan α Ki67, tavşan α-GFAP) yetiştirilir. Bu, tek bir dilim değerlendirilebilir antijenlerin sayısı ve kombinasyon halinde ciddi kısıtlamalara yol açar. Bu da birden fazla boyamaları girmelidirler gibi yalnızca boyama sarfedilen güç artar, ama aynı zamanda sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir. Bununla birlikte, bazı antijenler, formalin tespit kaynaklı epitop maskeleme (ör Ki67 duyarlıdırlar, Nestin). Biz burada klasik tek ve çoklu immün protokolleri değişiklikleri tanımlamak (örneğin, epitop alma, birden fazla sıralı immun, Nestin-GFP transgenik farelerin 12 kullanımı) bu sorunların çoğunun üstesinden. Özel olarak, sıralı çok sayıda imüno protokol antikorların bir kısmı da, ev sahibinden türemiş bile, dört farklı antijenlere karşı boyama sağlar. Bu aynı anda Tip 1, Tip 2a, tip 2b ve tip 3 projenitör hücrelerin saptanmasını, hem de tek bir bölüm içinde çoğalma aktivitesi sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

Yetişkin nöron yeni nöronlar giderek kararlı ara progenitör alt tipleri ile aktive edilmiş bir nöral kök hücre elde edildiği yüksek ölçüde düzenlenmiş bir çok-aşamalı süreçtir. Bu alt-tiplerin her biri, birlikte, özel morfolojik kriterlere göre tespit edilmek için kullanılabilen spesifik moleküler markörlerin bir dizi ifade eder. Tipik haliyle, immünofloresan teknikler ekso- ya da endojen çoğalma işaretleri ile kombinasyon halinde alt tip-spesifik antikorlar içeren uygulanır. Biz burada yetişkin hipokampal nöron tüm aşamalarında saptanması ve ölçülmesi için yöntemler immün tarif. Bu timidin analogları, transcardial perfüzyon, doku işleme, ısı kaynaklı epitop alma, ABC immünohistokimya, çoklu dolaylı immunofloresan, konfokal mikroskopi ve hücre ölçümü uygulaması içermektedir. Ayrıca biz sorunları u circumvents sıralı birden immunofloresans protokolü sunuyoruzsually aynı konak türlerinde kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak ihtiyacı doğan. Tek bir bölüm içinde bir çoğalma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt tiplerinin doğru belirlenmesini sağlar. Bu teknikler paralel farklı progenitör alt tiplerinin düzenleme, beyin patolojileri katılımlarını ve spesifik beyin fonksiyonları rollerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Biz ölçmek ve doğum sonrası ve yetişkin hipokampus yenidoğan hücreleri karakterize etmek yukarıda açıklanan yöntemleri uygulamalı. Bu nedenle, vahşi tip ve nöron-eksikli siklin D2 nöron oranı (yani, zenginleştirilmiş bir ortam, EE) 13,14 etkilediği bilinen koşullar altında muhafaza (Ccnd2 KO) fareler nakavt kullanılır. Ki67, BrdU, CldU veya DUK ya karşı immünohistokimyasal DAB boyama sürekli yabanitipte ve Ccnd2 KO farelerde (Şekil 3) <su...

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis at JoVE.com

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

immunohistochemistry-multiple-labeling-with-antibodies-from-same-host

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K Görüntüleme.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Video: Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Nörobilim

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Membran Yetişkin farelerin ventromedial Hipotalamus Nöronlar Potansiyel Boya Görüntüleme Glikoz Algılama Çalışması için

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&amp;#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Juxtasomal Biocytin Labeling to Study the Structure-function Relationship of Individual Cortical Neurons

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive functions including decision making, sensory-guided behavior or memory. To understand how such intricate neuronal networks perform such tasks, a crucial step is to determine the function (or electrical activity) of individual cell types within the network, preferentially when the animal is performing a relevant cognitive task. Additionally, it is equally important to determine the anatomical structure of the network and the morphological architecture of the individual neurons to allow reverse engineering the cortical network. Technical breakthroughs available today allow recording cellular activity in awake, behaving animals with the valuable option of post&#160;hoc identifying the recorded neurons. Here, we demonstrate the juxtasomal biocytin labeling technique, which involves recording action potential spiking in the extracellular (or loose-patch) configuration using conventional patch pipettes. The juxtasomal recording configuration is relatively stable and applicable across behavioral conditions, including anesthetized, sedated, awake head-fixed, and even in the freely moving animal. Thus, this method allows linking cell-type specific action potential spiking during animal behavior to reconstruction of the individual neurons and ultimately, the entire cortical microcircuit. In this video manuscript, we show how individual neurons in the juxtasomal configuration can be labeled with biocytin in the urethane-anaesthetized rat for post&#160;hoc identification and morphological reconstruction.

To understand the structure of neuronal networks, functional and morphological characterization of individual neurons is a necessity. Here, we demonstrate juxtasomal biocytin labeling, which allows electrophysiological recordings in the extracellular configuration, yet maintaining the ability to intracellularly label the neuron for post&#160;hoc reconstruction of dendritic and axonal architecture.

Juxtasomal Biocytin Etiketleme Bireysel Kortikal nöronlar yapı-fonksiyon ilişkisi Çalışması için

The cerebral cortex is characterized by multiple layers and many distinct cell-types that together as a network are responsible for many higher cognitive ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.