The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem animais vivos foram realizadas em conformidade com a directiva EC 86/609 / CEE orientações sobre cuidados e uso de animais de laboratório e aprovado pelo comitê de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz). 1. injeção intraperitoneal de timidina Analogs <ol><li> Pesar animais o dia antes da injeção. Calcule a quantidade de timidina analógica necessária para todas as injecções planejadas no dia seguinte, bem como o volume de injecção individuais ajustados ao peso de uma solução estoque de 10 mg / ml. </li><li> Prepare / ml solução estoque timidina 10 mg. (CUIDADO! Análogos da timidina são tóxicos. Siga as Fichas de Dados de Segurança específicas (MSDS) prestados pelos fornecedores, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um exaustor química). <ol><li> Tome timidina analógico a partir do congelador e trazê-lo até à temperatura ambiente, aproximadamente. 21 ° C. Pesar 10 mg e adicionarsolução salina estéril (para BrdU e CldU) ou NaOH 0,04 N (em solução salina estéril, por IdU), vortex. Colocar por pelo menos 10 - 15 minutos num banho a 50 ° C e água cada vórtice de 2 - 3 minutos para dissolver o pó. NOTA: Utilizar soluções para até 24 horas quando armazenada à temperatura ambiente e durante várias semanas a -20 ° C. Proteger as soluções da luz (cubra com papel alumínio). Sempre verifique se há precipitados e re-dissolver, se necessário. </li></ol></li><li> Contenha o mouse pela nuca e intraperitoneal injetar um volume apropriado, ajustada ao peso da solução de (pelo RT) utilizando uma seringa de dosagem bem com uma agulha G 30. NOTA: No caso de CldU e IdU têm de ser administrados sequencialmente dentro de um mesmo animal, considerar a injectar concentrações equimolares (por exemplo, de 42,5 mg / kg de CldU e 57,5 mg / kg IdU, que correspondem a 50 mg / kg de BrdU). Portanto, ajustar os volumes de injecção das soluções de 10 mg / ml em conformidade. </li></ol> 2. Preparação de tecidos <ol><li> Prepare formaldeído a 4% em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,4 no dia antes da perfusão. Armazenar a 4 ° C. </li><li> Transcardialmente perfundir os ratinhos anestesiados profundamente (3,5% de isoflurano) através do ventrículo esquerdo com 10 ml de PBS gelado, em seguida, com 40 ml de gelo-frio formaldeído (taxa de fluxo de 5 ml / min). Dissecar o cérebro e pós-fix no mesmo fixador durante 24 horas a 4 ° C. </li><li> Transferir os cérebros consecutivamente em 10% (24 h a 4 ° C) e 30% de sacarose (até as pias cerebrais, aprox. 48 h). Para o congelamento, lentamente submergir os cérebros crioprotegidos em -25 ° C isopentano até sem bolhas surgem a partir do tecido. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Corte cortes coronais de 40 m de espessura em um micrótomo de congelação (temperatura do bloco a -25 a -16 ° C). Secções de transferência sequencialmente em solução anticongelante contendo poços de uma placa de 24 poços de cultura de células (ver Figura 1). Armazenar a -20 ° C. </li></ol><img alt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52551 / 52551fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Ilustração esquemática de transferência de fatias do micrótomo em uma placa de 24 poços. Comece na A1 e coloque fatias subsequentes na fileira A, após A6 ir para a próxima linha B e assim por diante. Ao atingir D6, volte para A1 e continuar. Este arranjo de fatias permite a quantificação de cada enésima secção de um cérebro inteiro. Para a quantificação de células recém-nascidas tomar todos os 6 th secção cérebro (equivalente ao conteúdo de uma coluna), para imunofluorescência fenotipagem tomar cada 12 th secção (equivalente ao conteúdo de duas fileiras alternadas de uma coluna). 3. Immunostaining NOTA: As seções são processadas livre flutuação, normalmente em placas de 6 poços equipados com uma placa de suporte e inserções de malha. Como exceção, o bloqueio, incubações de anticorpos e reação ABC são feitos em 12 ou 24 poços placas sem inserções de malha (0,5 a 1 ml por well é suficiente, dependendo do número de fatias que têm de ser marcadas). Durante estas etapas, transferir seções com a ajuda de um pincel fino (enxaguar com cada nova solução). Todas as incubações são realizadas com agitação contínua (máx 150 rpm). <ol><li> A imuno-histoquímica (método ABC) <ol><li> Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente anti-congelante. </li><li> Incubar durante 30 min em 1,5% de H 2 O 2 em TBS-T, para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Preste atenção ao borbulhar e re-submergir seções se necessário. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Opcional: Entretanto pré-aquecer uma câmara de aquecimento e HCl 2 N a 37 ° C. Incubar secções durante 30 min a 37 ° C em HCl 2 N para desnaturar o ADN. Delicadamente seções separadas com a ajuda de um pincel. </li><li> Opcional: Neutralizar secções durante 10 minutos em 0,1 M de borato de pH8,5, RT. Durante a transferência, pincelar brevemente as inserções de malha contendo as seções sobre uma toalha de papel para remover restos de HCl. Lavar duas vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e para bloquear os locais de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA. </li><li> Incubar em anticorpo primário diluído em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em anticorpo secundário biotinilado diluído em TBSplus, 3 horas à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. Enquanto isso ... </li><li> Prepare complexo ABC de acordo com o protocolo do fabricante (1% A + B 1% em TBS-T). Deixa-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Incubar em secções reagente AB durante 1 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Preparar 50 ml de 0,5 mg / ml de DAB em TBS-T, por 6 ou 12 poços, dividida em duas metades e pipetas 4 ml ou 2 ml por poço, respectivamente. Seções transferência para solução de DAB (CUIDADO! DAB é tóxico. Siga o específic MSDS fornecidas pelo fornecedor, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um fume hood química). </li><li> Adicionar 0,5 ml de 1% de H 2 O 2 para a solução DAB 25 ml restantes, misturar e pipeta volumes equivalentes, tal como acima, para cada poço para iniciar a reacção de peroxidase. Incubar por 12 min. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem permanente. </li><li> Opcional: contracorante antes de colocar a lamela (ver secção 3.5). NOTA: Se a relação de sinal-para-ruído é baixo por causa da elevada interferência de fundo, repetir H 2 O 2 de tratamento após a incubação com o reagente de AB (passo 3.1.8). </li></ol></li><li> Múltiplo-imunofluorescência <ol><li> Imunofluorescência múltipla de solteiro ou simultânea <ol><li> Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente umtifreeze. </li><li> Opcional: como as etapas 3.1.3 - 3.1.4. </li><li> Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear os sítios de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo primário (por exemplo, α-BrdU de rato, cobaia α-DCX, α-GFP) de cabra diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Incubar em coquetel de anticorpos secundários fluorochrome conjugado (por exemplo, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cobaia, Alexa-488 α-cabra; todos derivados de burro) diluído em TBSplus, 3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. </li><li> Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem aquoso. </li></ol></li><li> Imunofluorescência múltipla seqüencial com anticorpos primários de espécies hospedeiras mesmos <ol><li> Como as etapas 3.2.1.1 - 3.2.1.3. </li><li> Incubar em fiprimeiro anticorpo primário (por exemplo, α-antigénio de coelho A), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em primeiro anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, vermelho de rodamina-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em 10% de soro normal a partir do mesmo host que os anticorpos primários (por exemplo, soro de coelho) por 3 hr RT para saturar paratopos abertas no primeiro anticorpo secundário. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em TBSplus com 50 ug / fragmentos Fab monovalentes unconjugated ml contra o exército dos anticorpos primários (por exemplo, IgG α-coelho (H + L)) para cobrir epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário, O / N no 4 ° C. </li><li> Lavar pelo menos 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. Durante a transferência, swa brevementeb as inserções de malha contendo os cortes em uma toalha de papel para remover quaisquer restos Fab. </li><li> Incubar em segundo anticorpo primário (por exemplo, de coelho α antigénio-B), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em segundo anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, Alexa-488-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. NOTA: Para identificar antígenos com anticorpos de diferentes espécies hospedeiras adicioná-los para a etapa 3.2.2.2 e os respectivos anticorpos secundários para a etapa 3.2.2.3. </li></ol></li><li> Um dos anticorpos secundários provenientes mesma espécie como um dos anticorpos primários NOTA: Este protocolo é adequado para quadruple-coloração contra BrdU ou Ki67 juntamente com GFAP, nestin-GFP e DCX. <ol><li> Siga rigorosamente o protocolo passos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Até este ponto utilizar apenas soro de burro em TBSplus. </li><li> Incubar em TBSplus contendo 3% de soro de cabra durante 1 h à TA. Isto cobre paratopos abertas no anticorpo secundário de cabra-α. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em AMCA conj. α-cabra de coelho diluído em TBSplus, TA 3 horas ou O / N a 4 ° C. Lavar três vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. </li></ol></li><li> Co-coloração CldU, IdU <ol><li> Lavar, desnaturar e neutralizar seções como descrito no ponto 3.2.1 (passos 3.2.1.1 - 3.2.1.2). </li><li> Incubar com 20 ug / ml de fragmentos Fab não conjugados α-IgG de ratinho (H + L) em TBSplus, 1 h à TA. Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo primário contendo α-BrdU de rato (1: 400; purificado IgG2), e rato α-BrdU (1: 350) diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em cocktail de anticorpo secundário contendo de burro biotinilados α-rato (1: 500) e FITC-conj. burro α-Rato fragmentos Fab (1: 100). Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. </li><li> Incubar em vermelho-Rodamina conj. Estreptavidina, 2 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima. </li></ol></li><li> A amplificação do sinal de fluorescência em ratinhos nestina-GFP <ol><li> Adicionar cabra α-GFP para o cocktail de anticorpo primário. </li><li> Adicionar um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo propriedades espectrais semelhantes a GFP (tais como Alexa 488 conj. Α-cabra de burro) para o cocktail de anticorpo secundário. </li></ol></li></ol></li><li> Recuperação Epitope <ol><li> Realizar recuperação antigênica após enxaguar anticongelante. Pré-aqueça o vapor com 6 ou 12 poços contendo placas de tampão citrato 0,1 M pH 6,0-95 - 99 ° C (aproximadamente 25 minutos). </li><li> Transfira as seções para o tampão citrato quente e vapor durante 30 minutos (cobrir as placas com folha de alumínio como plástico lids não são resistentes ao calor). </li><li> Colocar imediatamente as placas num banho de gelo para arrefecer. Isso ajuda a proteger a morfologia do tecido, o que é de particular importância quando se trabalha com secções de cérebro de animais após o nascimento. </li><li> Lavar 3 vezes em TBS durante 10 minutos cada para lavar e neutralizar o citrato e continuar a coloração. </li></ol></li><li> Anticorpos de rato sobre o tecido do mouse <ol><li> Adicionar / ml de fragmentos de 20 ug monovalentes Fab α-IgG de ratinho (H + L; mesmas espécies hospedeiras-anticorpo secundário) do que para o primeiro passo de bloqueio (por exemplo, o passo 3.1.5 ou 3.2.1.3). </li><li> Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada, e prosseguir com respectivo protocolo. </li></ol></li><li> Cresyl counterstaining violeta <ol><li> Pré-aqueça solução violeta de cresilo a 60 ° C (em frasco de vidro). Incubar as lâminas na solução quente por 3 min. </li><li> Enxágüe em aq. dest. e desidratar 2 vezes durante 1 minuto cada em 70%, 96% e 100% de isopropanol. </li&gt; <li> Limpar por 5-6 min em xileno ou um substituto xileno e lamela com um meio de montagem permanente compatível. </li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Contagem de células coradas em recém-nascidos com peroxidase a cada po 6 corte ao longo de toda a extensão rostro-caudal do giro dentado. Use um microscópio de luz em aumento de 400X. </li><li> Multiplicar o número de células resultantes com o intervalo de intersecção para obter uma estimativa do número total de células recém-nascidas. </li><li> A imagem de fluorescência marcado secções com um microscópio confocal de laser equipado com lasers adequados e sistemas de filtragem. Leve pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro denteado no aumento de 400X e analisar pelo menos 50 células selecionadas aleatoriamente de interesse por hemisfério para co-rotulagem com outros marcadores. </li><li> Multiplicar as percentagens calculadas de células co-rotulado (% / 100) com os números totais de células recém-nascidos para calcular absolutonúmero de populações de células específicas de recém-nascidos. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração. Rotulagem de divisão de células com análogos da timidin...

Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade 1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Geram neuroblastos (Tipo 3) que, gradualmente, sair do ciclo celular para se tornar neurónios imaturos (com dendrites estendido para a camada molecular) e, finalmente, integrar na rede de células granulares do hipocampo como maduros. Devido às suas características fisiológicas específicas dessas células fornecer o circuito com maior plasticidade 3 suggesting um papel único na função do hipocampo. Na verdade, os estudos sobre a última década gerou provas substanciais de que a neurogênese adulta contribui para a memória espacial, a separação padrão e comportamento emocional 4,5. Neurogénese adulto pode ser estudada utilizando diferentes abordagens. Análogos da timidina incorporar em DNA durante a fase S do ciclo celular e permitir o nascimento de encontros, quantificação e análise de células de destino 6-8-nascidos. Aplicação sequencial de diferentes análogos da timidina (eg, CldU Edu ou UDI) pode ser usado para estudar a renovação celular ou populações de células nascidas em diferentes momentos durante o curso de um experimento 9. Uma alternativa, um marcador para a proliferação celular endógeno é Ki67. Ela é expressa em células em divisão, durante todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2, H), excepto na fase de repouso (G0), e o início de G1 10,11. Para analisar o fenótipo de populações de células-nascidos no adulto dentate gyrus vários marcadores moleculares específicas de fase podem ser utilizados, tais como a GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP é um marcador de astrócitos maduros, mas também é expresso em células da glia, como radiais na parte frontal do cérebro adulto. Nestin é um filamento intermediário específico para células da glia-like radiais e as células progenitoras intermediários iniciais. DCX é uma proteína associada a microtúbulos expressa em progenitores intermediários, neuroblastos imaturos e neurónios. Com base na (co-) expressão destes três marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos de células progenitoras distintos podem ser identificados: o tipo 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), tipo 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) e tipo 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-rotulagem de DCX em conjunto com NeuN, que é expressa nos neurónios pós-mitóticos, permite a diferenciação de immature (DCX +, NeuN +) e maduro (DCX -, NeuN +) neurônios granulares. Os marcadores acima mencionados são freqüentemente usados ​​para co-rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal subseqüente ao analisar o número ea identidade das células-nascidos. Isto requer tipicamente anticorpos de diferentes espécies hospedeiras para evitar anticorpo reactividade cruzada indesejada. No entanto, a maioria dos anticorpos primários adequados para investigação neurogénese são levantados, quer em coelhos ou ratinhos (por exemplo, rato α-BrdU, rato α-NeuN, α-Ki67 de coelho, α-GFAP de coelho). Isto leva a sérias limitações no número e combinação de antígenos que possam ser avaliados em uma única fatia. Este, por sua vez, não só aumenta o esforço de coloração, como múltiplas colorações devem ser realizados, mas pode também comprometer a fiabilidade dos resultados. Além disso, alguns antigénios são susceptíveis de formalina induzida por mascaramento epitopo de fixação (por exemplo, Ki67, Nestina). Descrevemos aqui modificações dos protocolos immunolabeling simples e múltipla clássicos (por exemplo, recuperação antigênica, múltiplos immunostaining seqüencial, uso de nestin-GFP camundongos transgênicos 12) que superar muitas destas questões. Em particular, o protocolo de imunofluorescência múltipla sequencial permite coloração contra até quatro antigénios diferentes mesmo se parte dos anticorpos é derivado a partir do mesmo hospedeiro. Isto permite a detecção simultânea de tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo de células progenitoras do tipo 3, bem como a sua actividade proliferativa dentro de uma única secção.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:277px;">Name</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:131px;">Comments &#38; Dilutions</td>
		</tr>
		<tr height="13">
			<td height="13" style="height:13px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymidine analog administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td rowspan="4" style="width:131px;">toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6891</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Chloro-2&#8242;-deoxyuridine, CldU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2105478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">5-Iodo-2&#8242;-deoxyuridine, IdU</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100357</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane-Actavis</td>
			<td>Piramal Healthcare</td>
			<td>700211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Paraformaldehyde powder (PFA)</td>
			<td>Riedel-De H&#228;en</td>
			<td>16005</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Perfusion pump PD5206</td>
			<td>Heidolph Instruments</td>
			<td>523-52060-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Masterflex Tygon lab tubing, &#216; 0.8 mm&#160;</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>06409-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>1036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freezing microtome Microm HM 400</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">24 Well Cell Culture Multiwell Plates</td>
			<td style="width:147px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immunohistochemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefal Vitacuisine Steamer</td>
			<td>Tefal</td>
			<td>VS 4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vectastain Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">DAB (3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D-5637</td>
			<td style="width:131px;">carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;">rabbit IgG1 &#945;-Ki67</td>
			<td style="width:147px;">Novocastra/ Leica Biosystems</td>
			<td>NCL-L-Ki67MM1</td>
			<td style="width:131px;">DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rabbit &#945;-GFAP, AS-3-GF</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>173 002</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat IgG (H+L) &#945;-GFP</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>R1091P</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">mouse IgG1 &#945;-nestin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6142</td>
			<td style="width:131px;">1:200; requires epitope retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">guinea pig IgG (H+L) &#945;-Doublecortin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (ascites)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030CX</td>
			<td style="width:131px;">for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;">rat IgG2a &#945;-BrdU (purified)</td>
			<td>AbD Serotec/ Bio-Rad</td>
			<td>OBT0030&#160;&#160;</td>
			<td style="width:131px;">for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">mouse IgG1&#312; &#945;-BrdU</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td style="width:131px;">for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mouse IgG1 &#945;-NeuN</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-065-152</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-065-150</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Biotin</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goat &#945;-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11006</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-097-003</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-605-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-605-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>712-295-150</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-295-152</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">donkey &#945;-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>706-296-148</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptavidin-Rhodamine Red-X&#160;</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>016-290-084</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat &#945;-rabbit IgG (H+L)-AMCA</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>111-155-144</td>
			<td style="width:131px;">1:250, works only with rabbit &#945;-GFAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1306</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blocking</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>715-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fab-fragment donkey &#945;-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>711-007-003</td>
			<td>1:20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal donkey serum</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal rabbit serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>011-000-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Normal goat serum</td>
			<td>Dianova</td>
			<td>005-000-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histology</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Cresyl violett</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Clear</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109843</td>
			<td style="width:131px;">non-toxic xylene substitute</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:277px;">Neo-Mount</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>109016</td>
			<td style="width:131px;">permanent mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="10">
			<td height="10" style="height:11px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">Axioskop 2</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:277px;">LSM 710</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis

Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.

Foram aplicados os métodos descritos acima para quantificar e caracterizar células-nascidos nas pós-natais e adultos hipocampo. Portanto, nós utilizamos wildtype e neurogênese deficiente ciclina D2 vazar (Ccnd2 KO) alojados em condições conhecidos por afetar a taxa de neurogênese (ou seja, o ambiente enriquecido, EE) 13,14. A coloração imuno-histoquímica contra DAB ou Ki67, BrdU, CldU ou IdU revelou consistentemente diferenças no número de células entre os recém-nascidos de ti...

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Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

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Neuroscience

26.4K visualizações.  Jena University Hospital. This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.