Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil R&#233;gional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Universit&#233; de Bourgogne (BQR program).

このプロトコルは、大学·デ·ブルゴーニュの動物ケアのガイドラインに従っており、大学·デ·ブルゴーニュの倫理委員会によって承認されました。 1.動物<ol><li>ジャクソン研究所で入手可能な遺伝子操作されたOR-IRES-tauGFPマウスを使用してください。これらのマウスは、嗅覚系19の軸索標的と発展を分析するために、ピーター·Mombaerts「研究室で開発されました。例えば、MOR23-IRES-tauGFPライン、在庫数006643は、公式の歪み名B6を負い、129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ。同様に、SR1-IRES-tauGFPライン、在庫数6717は、正式名称のB6を負い、129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJを。 </li><li>動物の年齢について：プロトコルのより良い成果のために、年齢の2および4週間の間、動物を使用しています。この年齢層では、解剖が容易（より柔らかい骨、より強固な嗅上皮）と樹状ノブが双方向であるですgger古い動物と比較します。 </li></ol>電極と溶液の調製<ol><li>刺激ピペットの場合：購入はピペットを刺激prepulled。そうでない場合は、手動でそれらを準備。 <ol><li>炎を使用して、先端から約1cmで6、1mmのガラスピペットを曲げます。アイレットによって強化1.5センチメートル熱収縮チューブでこれらの6つのピペットプラスストレート7 番目に挿入します。 </li><li>熱は、互いに取り付けバレルを維持するためのチューブを縮小します。バレルの他の端に追加の熱収縮チューブを取り付けます。マルチバレルプラーで、この刺激ピペットを引き出します。 </li><li>曲がった先端を強化するためにアイレットの周りにいくつかの白い液体接着剤を追加します。ドライO / Nましょう。 </li></ol></li><li> （：; pHは7.6と305 mOsmでのNaCl 124、KClの3、 硫酸マグネシウム1.3、 塩化カルシウム2、NaHCO 3で26、のNaH 2 PO 4 1.25、グルコース15mMの中で）正常なリンガー細胞外溶液の1または2 Lを準備します。 4°Cで保管してください使用するまで。 </li><li> （mm表示）細胞内のストック溶液を調製する：KClを70、KOH 53、メタンスルホン酸30、EGTA 5、HEPES 10、ショ糖70。 pHを7.2（KOH）と310ミリオスモル。使用するまで4℃で保管してください。数週間のために良いです。 </li><li>実験前（直前に）即時にナイスタチンを有する細胞内記録液を準備します。 <ol><li>ナイスタチンの3 mgの計量、DMSOの50μlを添加します。完全に希釈されるまでボルテックス20秒後、2〜3分を超音波処理します。 </li><li>細胞内の原液5mlのDMSO-ナイスタチン溶液20μlを追加します。ボルテックス20秒は、その後3分間超音波処理します。 4℃でこの溶液を維持し、直接光から保護し、ナイスタチンは、光に敏感です。この溶液は、数時間のために使用することができます。毎日交換してください。 </li><li>嗅上皮製剤は、顕微鏡下であると、電極を埋めるために火炎伸長イエローチップで1mlシリンジに、この溶液の一部を取ります。直接光から保護します。 RT、ナイスタチン溶液を一度に安定していません。時間ごとに注射器や氷の中にそれを保持1mlの溶液を交換してください。 </li></ol></li><li>内部ナイスタチン溶液で15〜20MΩの抵抗と長い首と小さな先端（〜2μm）を得るために、プラーと記録電極を引き出します。 </li><li>ヒュームフードの下でDMSO中に0.5 Mで、付臭剤溶液を調製します。アリコートし、使用するまで-20℃で維持します。所望の濃度まで、リンゲル液中の付臭剤を希釈します。刺激ピペットを埋めます。 </li></ol>嗅上皮の調製注：OR-IRES-tauGFPマウスまたはプロモーターの制御下tauGFPを発現します。これらのマウスでは、関心のORを表す全てのニューロンをGFPで標識されます。このプロトコルは、すべてのゾーンで発現和するように適合されています。しかし、解剖や録音は背側ゾーンで発現論理和のために容易です。 <ol><li>ケタミンとキシラジンの混合を注入することにより、動物を麻酔（150ミリグラム/ kgおよび10mg / kgのBODY体重、それぞれ）。断頭は、若いマウスに対する鋭いハサミでまたは古いマウスに対する適切に維持げっ歯類ギロチンで行うことができます。 <ol><li>リング解剖ハサミを使用すると、背側の皮膚を介して長手方向の内側の切開を行います。それを引き離すことにより、皮膚を削除します。はさみを使用して、顎関節に下顎を切りました。歯に冠状カット平行な上部の前歯を削除します。 </li><li>目の後ろの頭の冠状カットを行い、ヘッドのだけ前方部分を保持します。スコープの下で解剖用の氷冷リンゲル液でそれを浸し。 </li></ol></li><li>スコープの下で解剖：腹側に、上顎/歯に沿った長手方向のカットを行います。鼻腔の背側面以下、縦方向に背側骨をカットします。ほとんどの骨と口蓋を削除します。セプタム、室温で酸素化リンガーにそれに接続されている上皮を転送します。 </li><li>最終的な解剖のための：右の記録を開始する前にセッションでは、ピンセットで基本となる隔壁から上皮を引き剥がします。鉗子でとの密着性が強い中隔の前の部分にある2つの4〜5ミリメ​​ートルのシザーカット（使用microvannasはさみ）で上皮を外します。 <ol><li>慎重中隔上皮への背側の接続に沿ってそれを切断することにより鋤鼻器官を削除します。上向きに粘液層を有する記録チャンバーに上皮を移します。ハープと室内でフラットに保ちます。 </li></ol></li><li>蛍光光学系と感度カメラを搭載した正立顕微鏡下でチャンバーをインストールします。 40Xの水浸対物レンズ（開口数0.8）と拡大レンズによって達成余分2Xや4X拡大による高倍率でのコンピュータ画面上の準備を可視化します。室温で酸素化リンガー（1-2 ml /分）で連続的に灌流。 </li></ol> 4.レコーディングセッション<ol><li>蛍光細胞を検索：480で準備を励起530から550 nmの範囲の光を放射するためのEGFPナノメートル;蛍光と明視野の下で確実に表示されている1樹状ノブをターゲットにしています。 </li><li>ナイスタチンと細胞内液と電極を埋めます。そっと電極をタップして気泡を除去。 </li><li>電極ホルダに電極を挿入し、ピペットで正圧を適用します。抵抗は15〜20MΩでなければなりません。 </li><li>セルの近くに電極をもたらします。抵抗は〜40MΩに達すると、正圧を解放し、ギガシールに到達するまでのわずかな負圧を適用します。 </li><li>シールに到達すると、約-75 mVの膜電位に設定し、 </li><li>セルが開かれると、刺激プロトコル、薬理学的治療を進めます。単一の付臭剤の刺激、自発的活動の記録200〜500ミリ秒の応答を測定するために、500ミリ秒のために刺激して、最大10秒13のための細胞の応答を測定します。薬理学的治療については、次の薬剤を灌流所望の濃度20。 </li></ol> 5.データ解析<ol><li>以下のように、付臭剤の刺激によって誘発された電流を分析します（ミリ秒での最大振幅の90％に達するのに必要な時間、）最大振幅、立上り時間、合計電流（PASの曲線下面積）、時間を50％に（ミリ秒で開始し、最大振幅の50％で応答オフセットとの間の時間）。 <ol><li>描き、ヒル方程式を用いて用量反応曲線をフィット、異なる濃度（最大振幅に達した）ピーク伝達電流を使用する：I = Imaxと/（1 +（K 1/2 / C）N）Iがピーク電流を表します。 、最大応答の半分に達したときのK1 / 2濃度、C付臭剤の濃度とnヒル係数を飽和濃度で最大応答をIMAX。 </li></ol></li><li>最大脱分極のための電流クランプ、踏太で膜電位の記録を分析しますL電位は（mVsecの曲線下面積）を誘発しました。 30秒〜1分の記録を超えるレコード自発スパイク活動。電流（5-10 pA）での注射によって誘発されたスパイクを介してレコード興奮。 </li></ol>

<ol>
	<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells.">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li><li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique.">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862 (2012).</li><li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds:+possible+mechanism+of+action.">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li><li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons.">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li><li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li><li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse.">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li><li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb.">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li><li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor.">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SR1,+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile.">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li><li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23:+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice.">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li><li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23.">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li><li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system.">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li><li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor.">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li><li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level.">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system.">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li><li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors.">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li><li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons.">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li><li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes:+implications+in+olfactory+perireceptor+events.">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li><li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perireceptor+events+in+olfaction).">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li><li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons.">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+'IP(3)-odors.">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li><li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides,+insulin+and+leptin.">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li><li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons.">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

正しく健全なOSNsの特性を監視するために、このプロトコルの能力は、製剤の品質に大きく依存します。したがって、解剖の手順は非常に重要です。最初に、解剖媒体の質（pHは、浸透圧）、酸素および温度（氷のように冷たいが、凍結していない）に注意を払うことが重要です。第二に、解剖ツールと上皮の操作は、損害を回避することができるように制限する必要があります。最後に、可?...

嗅細胞（OSN）は、嗅覚の最初のステップを表しています。げっ歯類で鼻腔を裏打ちする嗅上皮に位置し、彼らは脳にその軸索を介して送信される活​​動電位への臭気物質の化学情報を変換します。より良い嗅覚符号化メカニズムを理解するためには、OSNsの伝達及び膜特性を特徴付けることが必要です。最近まで、哺乳類OSNsの性質を特徴づけるために使用される技術のほとんどが解離OSNs 1-4で行いました。解離過程は、その環境からOSNsを解放するために、様々な機械的および化学的（ すなわち 、酵素）プロセスを使用しています。これらのプロセスは、記録のために利用可能な細胞の数が少ないを誘導します。この低い数字は、GFP標識細胞の場合にはより一層重要になることがあります。解離もsurvivを高めることができるOSNsと嗅上皮の他の細胞との間の局所細胞と細胞の相互作用を除去しますアルとOSNsのプロパティの調整。解離手順を回避するためには、無傷の製剤は、5開発しました。 各OSNは、大規模な多重遺伝子ファミリーの6から選択される一つの嗅覚受容体（OR）を発現します。マウスの主嗅上皮で発現〜千論理和があります。野生型動物で、または多数の、同一または非常に低い発現をOSNsを記録するための機会のために。これらの制限を克服するために、遺伝子標的化マウスが利用可能であるもので識別されたOR蛍光タンパク質で標識されている7-9表す全てOSNs。これらの標識されたOSNsは、前述の欠点を持つ解離準備7,10,11で機能解析を行うために使用されました。遺伝的に標識されたマウスからの無傷の上皮の準備5は、したがって、これらの問題を回避します。それはviの中に近い環境で正確に定義された論理和を表現OSNsの活動の監視を可能にしますできるだけVO。また、OSNsのパッチクランプ記録は、膜の特性、伝達経路の薬理学、リガンド/ OR相互作用の正確な分析を可能にします。すべてのこれらのトピックはほとんど細胞外記録を用いて分析することはできません。我々は、嗅覚受容体SR1とMOR23 12,13を表現OSNsの応答を監視するには、この技術を使用していました。技術の実現可能性は、ニューロン15,16を表現OSNs 14を発現しているMOR23上の他のグループだけでなく、上の他の論理和により確認されました。 OSNsの定義された集団の監視は17、付臭剤誘起塑性18、及び臭気コーディング15における嗅覚受容体の配列の変異の役割を老化、このような開発14のような多くの異なる状況での特性の分析につながることができます。このプロトコルは、このように、膜レベルで定義されたOSNsの機能的特性を監視するための強力なツールを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">heavy equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration table with Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500 SERIES</td>
			<td>required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFL40XW</td>
			<td>at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnifier</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-TVCAC</td>
			<td>ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filters</td>
			<td>Olympus/Chroma</td>
			<td></td>
			<td>depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">recording electrodes /system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC10 USB</td>
			<td>monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>controls the amplifier during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP225</td>
			<td>precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrode puller</td>
			<td>sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>with a FT345-B wide trough filament;&#160; to prepare recording pipets of about 2&#181;m diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recording chamber</td>
			<td>warner instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td>a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multibarrel puller</td>
			<td>MDI</td>
			<td>PMP-107-Z</td>
			<td>by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision pressure injector&#160;</td>
			<td>Toohey Company</td>
			<td>P/N T25-1-900 Single Channel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>this precision pressure injector&#160; controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V&#160; TTLs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td>a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubings</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">solutions/perfusion/chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>gardner denver</td>
			<td>300 series</td>
			<td>a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nystatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td>mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td>intracellular/extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride di hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethylSulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47,135-6</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes-Na</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor

特異的なリガンドで刺激すると嗅細胞（OSN）の生理的反応を分析する嗅覚主導の行動とその変調の基礎を理解することが重要です。これらの符号化特性は、匂い分子と嗅覚受容体（OR）との間の最初の相互作用に大きく依存OSNsで表されます。表現または重要であるのアイデンティティ、特異性およびリガンドスペクトル。 ORのリガンドを発見する確率は非常に低い上皮内でランダムに選択されたOSNで表されます。この課題に対処するため、このプロトコルは、定義されたORのプロモーターの制御下で蛍光タンパク質GFPを発現する遺伝子タグ付きマウスを使用しています。 OSNsは、隣接するセルは、それらの成熟と機能に影響を与えると、鼻腔ライニングしっかりと組織化上皮に位置しています。ここでは、OSNs eの特性をそのまま嗅上皮を分離し、パッチクランプ記録を介して記録する方法を説明します定義された嗅覚受容体をxpressing。プロトコルは、隣接する組織の影響力を維持しながら一つはOSNの膜特性を特徴付けることができます。パッチクランプ結果の分析は、リガンド/ OR相互作用、伝達経路および薬理学、OSNs &#39;コードの特性と膜レベルでのそれらの変調の正確な定量化をもたらします。

このプロトコルの結果は、解剖の品質に依存します。この解剖の手順は、（ すなわち、上皮の損傷を避けるために）短い（10〜15分未満）および正確でなければなりません。 図1は、理想的な準備は、異なる倍率レベルでどのように見えるかを示しています。明視野下での低倍率では（例えば、支持細胞OSNsのノブなど）異なる細胞型は区別できる（ 図1A）です?...

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Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K ビュー.  Université de Bourgogne. Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

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