Authors would like to thank Peter Mombaerts for the generous gift of OR-GFP mice; Anne Lefranc and the CSGA animal facility for excellent animal care. Funding was provided by CNRS through an ATIP and ATIP Plus grants, by Conseil R&#233;gional de Bourgogne (FABER and PARI grants), by Universit&#233; de Bourgogne (BQR program).

פרוטוקול זה כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של Université de Bourgogne ואושר על ידי ועדת האתיקה Université de Bourgogne. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברים או-IRES-tauGFP מהונדסים גנטי זמינים במעבדה ג&#39;קסון. עכברים אלו פותחו במעבדה של ד&quot;ר פיטר &#39;Mombaerts כדי לנתח מיקוד ופיתוח האקסון של מערכת ההרחה 19. לדוגמא, קו MOR23-IRES-tauGFP, מספר מניות 006,643, נושא את השם הרשמי מתח B6; 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ; באופן דומה, הקו-SR1 IRES-tauGFP, מספר מניות 6717 נושא את השם הרשמי B6; 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגבי הגיל של בעלי החיים: לתוצאה טובה יותר של הפרוטוקול, להשתמש בבעלי חיים בין 2 ל 4 שבועות של גיל. בקבוצת גיל זו, לנתיחה היא (עצמות רכות, אפיתל ריח מוצק יותר) קלים יותר והידיות הדנדריטים הן דוgger להשוות לבעלי חיים מבוגרים. </li></ol> 2. הכנת אלקטרודות ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפטפות המגרה: רכישת prepulled גירוי טפטפות. אחרת, להכין אותם באופן ידני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בלהבה, לכופף שש טפטפות זכוכית 1 מ&quot;מ בכ 1 סנטימטר מהקצה. הכנס שש טפטפות אלה בתוספת 7 ה ישר בצינורות כיווץ בחום 1.5 סנטימטר לחזק על ידי לולאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום לכווץ את צינורות כדי לשמור על החביות המצורפות יחד. צרף צינורות לכווץ נוספים לגפיים האחרים של החביות. משוך פיפטה גירוי זה עם חולץ רב-חבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קצת דבק נוזלי לבן סביב חריר כדי לחזק את הטיפים הכפופים. בואו N / O היבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן L 1 או 2 של הפתרון תאי רינגר הרגיל (מ&quot;מ: 124 NaCl, KCl 3, 4 MgSO 1.3, CaCl 2 2, 3 NaHCO 26, Nah 2 PO 4 1.25, 15 גלוקוז; mOsm pH 7.6 ו 305). שמור על 4 מעלות צלזיוסעד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות תאיים (מ&quot;מ): 70 KCl, KOH 53, חומצת methanesulfonic 30, EGTA 5, HEPES 10, סוכרוז 70; pH 7.2 (KOH) וmOsm 310. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. טוב למספר שבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון תאיים הקלטה עם nystatin הכנה מוקדמת (ברגע האחרון) לפני הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 3 מ&quot;ג של nystatin, להוסיף 50 μl של DMSO; מערבולת 20 שניות לאחר מכן sonicate 2-3 דקות עד מדוללים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של פתרון DMSO-nystatin ב 5 מיליליטר של פתרון מניות תאיים. מערבולת 20 שניות, ואז sonicate 3 דקות. שמור פתרון זה על 4 מעלות צלזיוס ולהגן מפני אור ישיר, nystatin הוא רגיש לאור. פתרון זה יכול לשמש לכמה שעות. להחליף כל יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת אפיתל ההרחה היא מתחת למיקרוסקופ, לקחת חלק בפתרון זה במזרק 1 מיליליטר עם קצה צהוב-מוארך להבה למלא את האלקטרודות; להגן מפני אור ישיר. ברגע שב RT, פתרון nystatinאינו יציב; להחליף את הפתרון במזרק 1 מ&quot;ל כל שעה או לשמור אותו בקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך אלקטרודות הקלטה עם חולץ להשיג צוואר ארוך וטיפ קטן (~ 2 מיקרומטר) עם התנגדות של 15-20 MΩ עם פתרון nystatin הפנימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון odorant על 0.5 M בDMSO מתחת למכסה המנוע קטר; aliquot ולשמור ב -20 ° C עד שימוש. לדלל odorant בפתרון של רינגר עד הריכוז הרצוי. מלא את פיפטה הגירוי. </li></ol> 3. הכנת אפיתל הרחה הערה: עכברים או-IRES-tauGFP להביע tauGFP תחת שליטתו של היזם או. בעכברים אלו, כל הנוירונים המבטאים את או עניין מסומנים עם GFP. פרוטוקול זה מותאם עבור חדרי הניתוח באו לידי ביטוי בכל האזורים. עם זאת, ניתוחים והקלטות קלים יותר לחדרי ניתוח הביע באזור הגב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את החיה על ידי הזרקת תערובת של קטמין ו xylazine (150 מ&quot;ג / קילוגרם ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם דירקטוריוןמשקל y, בהתאמה). עריפת ראש יכול להתבצע במספריים חדים לעכברים צעירים או עם הגיליוטינה מכרסמים מתוחזקים היטב לעכברים מבוגרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספריים לנתח טבעת באמצעות לעשות חתך המדיאלי אורך דרך עור הגב. הסר את העור על ידי משיכתו לגזרים. בעזרת המספריים, לחתוך את הלסתות התחתונות במפרק הלסת. הסר את השיניים הקדמיות העליונות במקביל חתך עטרה לשיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך עטרה של הראש מאחורי העיניים ולשמור את החלק הקדמי בלבד של הראש. לטבול אותו בתמיסת רינגר קר כקרח לנתיחה בהיקף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח תחת ההיקף: בצד הגחון, לעשות חתך אורכי לאורך הלסת העליונה / השיניים. חותך את עצמות גב לאורך זמן, הבאים בצד dorso-הרוחב של חלל האף. להסיר את רוב העצמות וחיך; להעביר את המחיצה ואפיתל קשור אליו ברינגר חומץ בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחה הסופית: ממש לפני שמתחילה את ההקלטהפגישה, לקלף את האפיתל מהמחיצה הבסיסית עם מלקחיים. לנתק את האפיתל עם מלקחיים ועם שני 4-5 חתכי מספריים מ&quot;מ (מספריים microvannas שימוש) בחלק הקדמי של מחיצת האף שבו ההידבקות חזקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את איבר יעקובסון על ידי חיתוך אותו לאורך הגב שלה לחיבור האפיתל במחיצה. העבר את האפיתל לחדר הקלטה עם שכבת הריר פונה כלפי מעלה; לשמור את זה שטוח בתא עם נבל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן תא תחת מיקרוסקופ הזקוף מצויד באופטיקה הקרינה ומצלמה רגישה. דמיין את ההכנה על מסך המחשב בהגדלה גבוהה דרך 40X מטרת מים טבילה (צמצם מספרי 0.8) והגדלת 2X או 4X נוסף הושגה על ידי זכוכית מגדלת. Perfuse ברציפות עם צלצול מחומצן בRT (1-2 מיליליטר / דקה). </li></ol> 4. הקלטת מושב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחפש את תא ניאון: להלהיב את ההכנה ב480ננומטר לEGFP, אשר פולט אור בטווח 530-550 ננומטר; יעד ידית הדנדריטים אחד שהיא באופן מהימן גלוי בקרינה ותחת שדה בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא אלקטרודה עם פתרון תאיים עם nystatin; להסיר בועות בעדינות על ידי הקשה על האלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס האלקטרודה על בעל אלקטרודה, להפעיל לחץ חיובי בפיפטה; התנגדות צריכה להיות 15-20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא האלקטרודה קרובה לתא; פעם התנגדות מגיעה ~ 40 MΩ, לשחרר לחץ חיובי ולהפעיל לחץ שלילי קל להגיע gigaseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהוא הגיע חותם, להגדיר את פוטנציאל הממברנה בכ -75 mV; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתא נפתח, להמשיך עם פרוטוקולי גירוי, טיפולים תרופתיים. כדי למדוד את התגובה לגירוי odorant אחת, שיא 200-500 אלפיות שני של פעילות ספונטנית, לעורר עבור 500 אלפית שני ולמדוד את התגובה של התא לתקופה של עד 10 שניות 13. לטיפולים תרופתיים, perfuse הסוכנים תרופתיים בהריכוז הרצוי 20. </li></ol> ניתוח נתונים 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח זרמים שהושרו על ידי גירוי odorant אחריו כמו: משרעת המרביות, עלייה-הזמן (זמן דרוש כדי להגיע ל -90% ממשרעת המרבית, באלפיות שני), הסכום הנוכחי (שטח מתחת לעקומה בPAS), בפעם ב 50% (זמן בין תחילת והקיזוז של התגובה ב -50% את המשרעת המרבית, באלפיות השני). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בזרמי התמרה השיא (משרעת מרבי הגיע) בריכוזים שונים, לצייר ולהתאים עקומת תגובת מינון באמצעות משוואת היל: אני = Imax / (1 ​​+ (K 1/2 / n C)), שבו אני מייצג את השיא נוכחי , IMAX התגובה המרבית בריכוזים להרוות, K1 / 2 הריכוז שבהגיעה מחצית מהתגובה המרבית, C ריכוז odorant וn מקדם היל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הקלטות של פוטנציאל הממברנה במהדק נוכחי לשלילת הקוטביות המרבית, טוטהפוטנציאל l הושר (שטח מתחת לעקומה בmVsec); פעילות שיא ספונטנית spiking מעל 30 שניות עד 1 הקלטות דקות; שיא רגישות דרך קוצים שהושרו על ידי הזרקה של זרמים (5-10 הרשות הפלסטינית). </li></ol>

<ol>
	<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+amplification+by+calcium-dependent+chloride+channels+in+olfactory+receptor+cells.">Nonlinear amplification by calcium-dependent chloride channels in olfactory receptor cells.</a> Nature. 366 (6452), 283-286 (1993).</li><li>Ponissery Saidu, S., Dibattista, M., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-induced+responses+recorded+from+olfactory+receptor+neurons+using+the+suction+pipette+technique.">Odorant-induced responses recorded from olfactory receptor neurons using the suction pipette technique.</a> J Vis Exp. (62), e3862 (2012).</li><li>Moss, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+and+biochemical+responses+of+mouse+vomeronasal+receptor+cells+to+urine-derived+compounds:+possible+mechanism+of+action.">Electrophysiological and biochemical responses of mouse vomeronasal receptor cells to urine-derived compounds: possible mechanism of action.</a> Chem Senses. 23 (4), 483-489 (1998).</li><li>Kaur, A., Dey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+calcium+imaging+of+dissociated+vomeronasal+neurons.">Live cell calcium imaging of dissociated vomeronasal neurons.</a> Methods Mol Biol. 1068, 189-200 (2013).</li><li>Ma, M., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+characterization+of+rat+and+mouse+olfactory+receptor+neurons+from+an+intact+epithelial+preparation.">Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation.</a> J Neurosci Methods. 92 (1-2), 31-40 (1999).</li><li>Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multigene+family+may+encode+odorant+receptors:+a+molecular+basis+for+odor+recognition.">A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition.</a> Cell. 65 (1), 175-187 (1991).</li><li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system.">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> J Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li><li>Bozza, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+class+I+and+class+II+odorant+receptors+to+glomerular+domains+by+two+distinct+types+of+olfactory+sensory+neurons+in+the+mouse.">Mapping of class I and class II odorant receptors to glomerular domains by two distinct types of olfactory sensory neurons in the mouse.</a> Neuron. 61 (2), 220-233 (2009).</li><li>Vassalli, A., Rothman, A., Feinstein, P., Zapotocky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenes+impart+odorant+receptor-specific+axon+guidance+in+the+olfactory+bulb.">Minigenes impart odorant receptor-specific axon guidance in the olfactory bulb.</a> Neuron. 35 (4), 681-696 (2002).</li><li>Feinstein, P., Bozza, T., Rodriguez, I., Vassalli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+guidance+of+mouse+olfactory+sensory+neurons+by+odorant+receptors+and+the+beta2+adrenergic+receptor.">Axon guidance of mouse olfactory sensory neurons by odorant receptors and the beta2 adrenergic receptor.</a> Cell. 117 (6), 833-846 (2004).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).</li><li>Grosmaitre, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SR1,+a+mouse+odorant+receptor+with+an+unusually+broad+response+profile.">SR1, a mouse odorant receptor with an unusually broad response profile.</a> J Neurosci. 29 (46), 14545-14552 (2009).</li><li>Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responses+of+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptor+MOR23:+a+patch+clamp+analysis+in+gene-targeted+mice.">Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1970-1975 (2006).</li><li>Lam, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+responsiveness+of+embryonic+mouse+olfactory+sensory+neurons+expressing+the+odorant+receptors+S1+or+MOR23.">Odorant responsiveness of embryonic mouse olfactory sensory neurons expressing the odorant receptors S1 or MOR23.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2210-2217 (2013).</li><li>Zhang, J., Huang, G., Dewan, A., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoupling+stimulus+specificity+and+glomerular+position+in+the+mouse+olfactory+system.">Uncoupling stimulus specificity and glomerular position in the mouse olfactory system.</a> Mol Cell Neurosci. 51 (3-4), 79-88 (2012).</li><li>Zhang, J., Pacifico, R., Cawley, D., Feinstein, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+detection+of+amines+by+a+trace+amine-associated+receptor.">Ultrasensitive detection of amines by a trace amine-associated receptor.</a> J Neurosci. 33 (7), 3228-3239 (2013).</li><li>Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+odorant+receptors+and+response+properties+of+olfactory+sensory+neurons+in+aged+mice.">Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice.</a> Chem Senses. 34 (8), 695-703 (2009).</li><li>Cadiou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+odorant+exposure+induces+peripheral+olfactory+plasticity+at+the+cellular+level.">Postnatal odorant exposure induces peripheral olfactory plasticity at the cellular level.</a> J Neurosci. 34 (14), 4857-4870 (2014).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+wiring+in+the+mouse+olfactory+system.">Axonal wiring in the mouse olfactory system.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 713-737 (2006).</li><li>Grosmaitre, X., Santarelli, L. C., Tan, J., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+functions+of+mammalian+olfactory+sensory+neurons+as+odor+detectors+and+mechanical+sensors.">Dual functions of mammalian olfactory sensory neurons as odor detectors and mechanical sensors.</a> Nat Neurosci. 10 (3), 348-354 (2007).</li><li>Duchamp-Viret, P., Chaput, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odor+response+properties+of+rat+olfactory+receptor+neurons.">Odor response properties of rat olfactory receptor neurons.</a> Science. 284 (5423), 2171-2174 (1999).</li><li>Heydel, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-binding+proteins+and+xenobiotic+metabolizing+enzymes:+implications+in+olfactory+perireceptor+events.">Odorant-binding proteins and xenobiotic metabolizing enzymes: implications in olfactory perireceptor events.</a> Anat Rec (Hoboken). 296 (9), 1333-1345 (2013).</li><li>Pelosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perireceptor+events+in+olfaction).">Perireceptor events in olfaction).</a> J Neurobiol. 30 (1), 3-19 (1996).</li><li>Spehr, M., Wetzel, C. H., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-phosphoinositides+modulate+cyclic+nucleotide+signaling+in+olfactory+receptor+neurons.">3-phosphoinositides modulate cyclic nucleotide signaling in olfactory receptor neurons.</a> Neuron. 33, 731-739 (2002).</li><li>Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+adenylyl+cyclase+inhibits+olfactory+generator+currents+induced+by+'IP(3)-odors.">Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by 'IP(3)-odors.</a> J Neurophysiol. 84 (1), 575-580 (2000).</li><li>Savigner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+spontaneous+and+odorant-evoked+activity+of+rat+olfactory+sensory+neurons+by+two+anorectic+peptides,+insulin+and+leptin.">Modulation of spontaneous and odorant-evoked activity of rat olfactory sensory neurons by two anorectic peptides, insulin and leptin.</a> J Neurophysiol. 101 (6), 2898-2906 (2009).</li><li>Ukhanov, K., Brunert, D., Corey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide+3-kinase-dependent+antagonism+in+mammalian+olfactory+receptor+neurons.">Phosphoinositide 3-kinase-dependent antagonism in mammalian olfactory receptor neurons.</a> J Neurosci. 31 (1), 273-280 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

היכולת של פרוטוקול זה כדי לפקח בצורה נכונה את המאפיינים של OSNs הבריא תלויה במידה רבה באיכות של התכשיר. לכן, הצעדים לנתיחה הם קריטיים. הראשון הוא קריטי לשים לב לאיכות (pH, osmolarity), חמצון וטמפרטורה של המדיום לנתיחה (אבל לא קפוא קר כקרח). שנית, המניפולציה של האפיתל עם כלים לנתח...

נוירונים חושיים ריח (OSN) מייצגים את השלב הראשון של תפיסת חוש הריח. ממוקם באפיתל ההרחה המצפה את חלל האף במכרסמים, הם יהפכו את המידע הכימי של ניחוחי לפוטנציאל פעולה שנשלח דרך האקסון שלהם למוח. כדי להבין טוב יותר את מנגנוני קידוד חוש הריח, יש צורך לאפיין את תכונות התמרה וקרום של OSNs. עד לאחרונה, רוב הטכניקות המשמשות כדי לאפיין את המאפיינים של OSNs יונקים בוצעו על 1-4 OSNs ניתקו. תהליך הניתוק משתמש (כלומר, אנזימים) תהליכים שונים מכאניים וכימיים לשחרר OSNs מסביבתם. תהליכים אלה גורמים למספר נמוך של תאים זמינים להקלטות. מספר נמוך זה יכול להיות אפילו יותר קריטי במקרה של תאי ה- GFP שכותרתו. דיסוציאציה גם מסירה את אינטראקציות תא אל התא המקומיות בין OSNs ותאים אחרים של אפיתל הריח שעשוי לשפר survivאל ואפנון של הנכסים &quot;OSNs. כדי לעקוף את הליך הניתוק, הכנה שלמה פותחה 5. כל OSN מבטא קולטן אחד חוש הריח (OR) נבחר ממשפחת multigene גדולה 6. יש ~ 1,000 חדרי ניתוח הביטוי באפיתל ההרחה העיקרי בעכבר. בשל המספר הגדול של בעלי חיים או בסוג בר, הסיכויים להקליט OSNs להביע זהה או נמוכים מאוד. כדי להתגבר על מגבלות אלה, עכברי גן ממוקד זמינים שבו כל OSNs להביע מזוהה או מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי 7-9. OSNs שכותרתו אלה שמשו לעשות אנליזה פונקציונלית בהכנות ניתק 7,10,11 עם החסרונות שהוזכרו קודם לכן. הכנת אפיתל ללא פגע 5 מעכברים שכותרתו גנטית ולכן עוקפת בעיות אלה. זה מאפשר הניטור של הפעילות של OSNs להביע חדרי ניתוח מוגדרים במדויק בסביבה הקרוב בviVO ככל האפשר. חוץ מזה, הקלטות תיקון מהדק של OSNs גם יאפשרו ניתוח מדויק של תכונות קרום, פרמקולוגיה מסלול התמרה, יגנד / או אינטראקציות. בקושי ניתן לנתח את כל הנושאים הללו באמצעות הקלטות תאית. השתמשנו בטכניקה זו כדי לעקוב אחר התגובות של OSNs מבטאות את הקולטנים odorant SR1 וMOR23 12,13. ההיתכנות של הטכניקה אושרה על ידי קבוצות אחרות בMOR23 להביע 14 OSNs כמו גם בחדרי ניתוח אחרים להביע נוירונים 15,16. הניטור של אוכלוסייה מוגדרת של OSNs יכול להוביל לניתוח של המאפיינים שלהם בהקשרים רבים ושונים כגון פיתוח 14, הזדקנות 17, odorant מושרה פלסטיות 18, ותפקידם של שינויים ברצף של קולטן odorant בריח קידוד 15. פרוטוקול זה ובכך מספק כלי רב עוצמה כדי לעקוב אחר התכונות הפונקציונליות של OSNs המוגדר ברמת הקרום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">heavy equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration table with Faraday cage</td>
			<td>TMC</td>
			<td>63-500 SERIES</td>
			<td>required : isolates the recording system from vibrations induced by the environment (movements of experimenter, vibrations of equipment such as fans for cooling computers, etc); can also be purchased with a Faraday cage, or equipped by a custom made Faraday cage; this cage is recommended to avoid electric noise from the environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI</td>
			<td>upright microcope equipped with epifluorescence; fixed or moving stage depending on the user&#39;s preference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objectives</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFL40XW</td>
			<td>at least 2 objectives required: a 4x or 10x for coarse approach to the cell; and a 40x immersion long distance example Olympus LUMPLFL40XW/IR/0,8/WD:3.3 MM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnifier</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-TVCAC</td>
			<td>ABSOLUTELY REQUIRED: placed in the light path between the objective and the camera; allows to magnify the image on the screen in order to reach precisely the knob with the recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td>a good camera is required to see the neurons in fluorescence as well as in bright field; the controlling software is simple and allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell. An ultrasensitive camera is not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filters</td>
			<td>Olympus/Chroma</td>
			<td></td>
			<td>depending on the fluorescent protein used in the mice; example for GFP: excitation : BP460-490: emission: HQ530/50m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">recording electrodes /system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC10 USB</td>
			<td>monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the puffing by sending a TTL signal to the spritzer; the EPC10 setup is controled by computer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>Patchmaster</td>
			<td>controls the amplifier during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP225</td>
			<td>precision micromanipulator, allows precise movements down to 1/1Oth of a micrometer; this model is very stable; avoid hydraulic manipulators that may drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrode puller</td>
			<td>sutter</td>
			<td>P97</td>
			<td>with a FT345-B wide trough filament;&#160; to prepare recording pipets of about 2&#181;m diameter with a long tip to reach the cells; the resistance should be 15 to 20Mohm with perforated patch clamp solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>sutter</td>
			<td>BF120-69-10</td>
			<td>in our recording conditions, this glass is ideal for recording pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recording chamber</td>
			<td>warner instruments</td>
			<td>RC-26G</td>
			<td>a chamber is needed to set the preparation under the microscope. To maintain the preparation in the center of the chamber, a net/anchor should be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td>attached in groups of 7, these pipettes are used to prepare prepulled stimulating pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multibarrel puller</td>
			<td>MDI</td>
			<td>PMP-107-Z</td>
			<td>by association of pull and twist, this puller allows us to prepare puffing electrodes with 7 barrels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>precision pressure injector&#160;</td>
			<td>Toohey Company</td>
			<td>P/N T25-1-900 Single Channel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>this precision pressure injector&#160; controls the pressure ejected in the multibarrel puller; it is controlled manually or by the amplifier by a 5V&#160; TTLs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td>a coarse manipulator is enough to bring the puffing electrode close to the recording site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubings</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td>tygon tubing to bring the pressure from the puffer to the puffing pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">solutions/perfusion/chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vacuum pump</td>
			<td>gardner denver</td>
			<td>300 series</td>
			<td>a vibrating membrane pump is more quiet and efficient than other types of pumps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>gravity perfusion system with polyethlylen tubing to bring in and out the external solution from the recording chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nystatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3503</td>
			<td>mandatory to perpare internal solution for perforated patch clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIMETHYL SULFOXIDE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5879</td>
			<td>used to disolve nystatin for internal solution for perforated patch&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td>intracellular/extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride di hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4 7H2O)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63140</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>extracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>internal solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MethylSulfoxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47,135-6</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes-Na</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td>intracellular solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perforated patch-clamp recording of mouse olfactory sensory neurons in intact neuroepithelium: functional analysis of neurons expressing an identified odorant receptor

ניתוח התגובות הפיזיולוגיות של תאי עצב תחושתיים חוש הריח (OSN) כאשר מגורה עם ligands הספציפי הוא קריטי כדי להבין את הבסיס של התנהגויות מונעים ריח והאפנון שלהם. מאפייני קידוד אלה תלויים במידה רבה באינטראקציה הראשונית בין מולקולות ריח וקולטני הריח (OR) באו לידי ביטוי בOSNs. ספקטרום זהות, הסגוליות ויגנד של ביטוי או קריטיים. ההסתברות למצוא יגנד של או הביטוי בOSN נבחר באופן אקראי בתוך האפיתל הוא נמוך מאוד. כדי להתמודד עם אתגר זה, פרוטוקול זה משתמש גנטי עכברים מתויגים המבטאים את ה- GFP חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של ​​האמרגן של חדרי ניתוח שהוגדר. OSNs ממוקם באפיתל הדוק ומסודר המצפים את חלל האף, עם תאי שכנים משפיעים ההתבגרות ותפקודם. כאן אנו מתארים שיטה לבודד אפיתל ריח שלם ולהקליט דרך הקלטות תיקון מהדק המאפיינים של דואר OSNsxpressing קולטנים odorant מוגדרים. הפרוטוקול מאפשר לאפיין תכונות קרום OSN, תוך שמירה על ההשפעה של רקמות שכנות. ניתוח של תוצאות תיקון מהדק מניב כימות מדויק של יגנד / או אינטראקציות, מסלולי העברה ופרמקולוגיה, תכונות הקידוד &#39;OSNs והאפנון שלהם ברמת הקרום.

התוצאה של פרוטוקול זה תלויה באיכות של הנתיחה. צעדים לנתיחה זה חייבים להיות קצרים (פחות מ 10 עד 15 דקות) ומדויקים (כלומר, כדי למנוע נזקים של האפיתל). איור 1 מדגים כיצד הכנה אידיאלית נראית כמו ברמות הגדלה שונות. בהגדלה נמוכה בשדה בהיר תאים מסוגים השונים (כגון י?...

Watch this Scientific Journal Video about Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

הקלטה מחוררת תיקון מהדק של עכבר עצב סנסורי חוש הריח בneuroepithelium שלמים: ניתוח פונקציונלי של נוירונים הבעת קולטן odorant מזוהה

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.6K Views.  Université de Bourgogne. Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Video: Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

תגובות odorant מושרה הקלטות מתא העצב קולטני ריח באמצעות טכניקת יניקת פיפטה

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

תאית הקלטה, חושי שדה מיפוי, ונוירונים שזוהו Culturing בעלוקה, Medicinalis Hirudo</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...